Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Л.б. была поддержана исследовательских грантов Helmut Horten Stiftung и Velux Stiftung, Цюрих (Швейцария). Г.в. был поддержан исследовательские гранты швейцарского национального научного фонда, Фонда Сесилия-Аугуста, Лугано и SHK Stiftung für Герц und Kreislaufkrankheiten (Швейцария)

1. сбор и обработка кондиционером средств массовой информации
<ol><li>Герб 55 см2 Петри с желатином свинину кожу 0,02% в PBS.</li>
	<li>Пластина КПК (8000/см2) в предварительно покрытых блюда с 7 мл Iscove изменение Дульбекко среднего (IMDM), дополнены 20% FBS (плода бычьим сывороточным) и 1% пенициллин...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Традиционная методика ФК остается наиболее простой аналитический метод характеризовать маркеры, выраженные на поверхность EV. В этой связи выбор наиболее подходящего протокола важно получить полезную информацию об индивидуальных частиц фракций интереса, избегая ограничения из-за чу?...

Клетки секретируют внеклеточного везикулы (EV) разных размеров, включая микровезикулы (MV) и exosomes (Exo). Последний можно отличить от MV, размер и внутриклеточных отсек происхождения. MV (200 – 1000 Нм в размер), освобождаются от родительской клетки пролить от плазматической мембраны. И наоборот экзо (30 – 150 Нм) происходят из мембран от англ и выпускаются во внеклеточное пространство, когда multivesicular органов (MVB) предохранитель с клеточной мембраны1,2.
EV все чаще используется как диагностические биомаркеров а также, потенциально, терапевтические средства во многих областях, включая онкология, Неврология, кардиология и опорно-двигательного аппарата3,4,5. Подавляющее большинство текущих исследований с использованием EV как терапевтические эксплуатировать изоляции везикулы от клеток кондиционером среднего (см) в пробирке культивируемых клеток. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) оказывают благотворное влияние в нескольких контекстах, и MSC-производные EV показали преимущества в моделях миокарда ишемии/реперфузии травмы6 и мозга травмы7. MSC-производные EV также демонстрируют иммунной модулирующее мероприятий, которые могут быть использованы для лечения иммунной отказа, как показано в модель терапии огнеупорные трансплантат – versus – хост болезни8. Амниотической жидкости стволовых клеток (Хафс) активно обогатить см с MVs и Exo, гетерогенно распределены в размер (50-1000 Нм), который посредником несколько биологических эффектов, таких как распространение дифференцированных клеток, ангиогенез, ингибирование фиброз, и кардиопротекции4. Недавно мы показали, что EV и особенно Exo, выделяется клетками человеческого сердца производные Прародителя (Exo-КПК) уменьшить размер при инфаркте миокарда в крысах5,9.
EXO доля общий набор белков на их поверхности, в том числе tetraspanins (CD63, CD81, CD9) и комплекс гистосовместимости I класса (MHC-I). Помимо этого общий набор белков экзо также содержат белки, специфичных для EV подмножество типа клеток продюсер. EXO маркеры приобретают первостепенное значение, потому что они играют решающую роль в между сотовой связи, регулирования таким образом многие биологические процессы5,10. Из-за их малого размера найти простой способ для анализа EV, с использованием классического потока цитометрии (FC) остается сложной задачей.
Здесь мы представляем упрощенный протокол для анализа EV с помощью FC, который может быть применен в предварительно обогащенного образцы, полученные через ultracentrifugation или непосредственно в см (рис. 1). Данный метод использует бисер покрытием с специфическим антителом, которая связывает канонические Exo связанные поверхности epitopes (CD63, CD9, CD81) без дополнительных моет. Анализ ФК может производиться с использованием обычных цитометр без необходимости для корректировки до измерения. Были описаны методы для характеризации антигенов на отдельных мелких частиц, используя поток цитофлуориметрами другими группами в отношении различных приложений11,,12-13. Здесь мы использовали функционализированных магнитные бусы для захвата мелких частиц и Exo, следуют фенотипирование захваченных частиц, ФК. Хотя этот метод может быть использован для характеристики антигенный состав мелких пузырьков, выпущен в любой тип клеток в пробирке, здесь мы предоставили конкретную ячейку культуры условия, которые применяются к культуре человеческого сердца прогениторных клеток (КПК) и наиболее соответствующие условия для производства EV этими клетками.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Проточной цитометрии (FC) является методом выбора для полуколичественного определения клетк поверхности антиген маркеров. Недавно этот метод был использован для фенотипического анализа внеклеточного везикулы (EV) включая exosomes (Exo) в периферической крови и других жидкостях организма. Небольшой размер EV мандатов использование специальных инструментов порог обнаружения вокруг 50-100 Нм. Кроме того EV могут быть привязаны к латекса микрошарики, которая может быть обнаружена ФК. Микрошарики, конъюгированных с антителами, которые признают EV-связанные маркеры/Кластер дифференцировки CD63, CD9 и CD81 могут быть использованы для захвата EV. EXO изолированы от см могут быть проанализированы с или без предварительного обогащения ultracentrifugation. Этот подход подходит для анализа EV, с использованием обычных инструментов ФК. Наши результаты показывают линейной корреляции между значениями означают интенсивности флуоресценции (MFI) и концентрации EV. Нарушая EV через sonication резко сократилась МФО, указывающее, что метод не может обнаружить мембраны мусора. Мы приводим точный и надежный метод для анализа поверхностных антигенов EV, которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории.

Общее количество частиц для одного окрашивания
Поскольку один шарик можно связать более чем одной частицы, мы испытывали различные условия для задания наименьшее количество всего EV (одного антитела в трубку) достичь на ранне?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Протокол описывает используется воспроизводимый метод, предназначенный для использования с supernatants культуры клеток для обнаружения поверхностных epitopes на небольших внеклеточного везикулы (EV). Он использует конкретные иммунопреципитации EV, с использованием бисера в сочетании с антителами, которые признают поверхностный антиген CD9, CD63 и CD81. Этот метод оптимизирован для анализа цитометрии вниз по течению потока.

Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Внеклеточные пузырьки все чаще используются в качестве диагностического биомаркера и потенциального терапевтического инструмента во многих областях. Flow Cytometric является наиболее прямой вперед аналитический метод для характеристики костюма сталкиваются маркеры этот протокол может быть использован при анализе assized частицы, быстро, и применимо к обычным сейсмометры без необходимости специальной настройки или выделенный инструмент. Хотя этот протокол используется для классификации внеклеточных пузырьков от сказал условие и среды, она может быть расширена в направлении классификации крови прибыл AVs, чтобы заменить инвазивных биопсий тканей у пациентов.Для исследователей, новых к протоколу, очень важно выполнить шаги, описанные в разделе метода настройки, и внимательно следить за продемонстрированы стратегии получения Начать путем покрытия 55 сантиметров в квадрате Петри-блюда с 02%porcine кожи желатина, в PBS. Через 15 минут, мыть блюдо и пластины 4,4 раза 10 до пятого сердечного прародителя клетки на каждое блюдо в 7 миллилитров Iscove в модифицированных Dulbecco's Medium, или IMDM, дополненный 20%fetal сыворотки крупного рогатого скота, и 1%пенициллин и стрептомицин для их инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Когда клетки достигают около 80% слияния, мыть культуры в два раза с PBS Дулбекко без кальция и магния и кормить клетки с 10 milileters сыворотки свободной экзосомы производства среды.Через 7 дней с каждой пластины сгустите кондиционированную среду в единую полипропиленовую центрифугу и центрифугу для удаления любого клеточного мусора. Перенесите супернатент в 100-килодальтонную центрифугу фильтровальной трубки, и сосредоточьте очищенную, кондиционированную, среду с дополнительной центрифугой. Перенесите концентрат в трубку микроцентрифуги для окончательной центрифугации скамейки и добавьте супернатант в поликарбонатную толстую стенку микроцентрифугной трубки.Заполните трубку PBS, до конечного объема 3,2 milileters, и загрузить образец в титановый фиксированный ангельский ротор. Затем загрузите ротор в настольный ультрацентрифуг для ультрацентрифугации и повторно насадите гранулы в 100 микролитров свежего PBS. Для отслеживания и анализа наночастиц количественно, разбавить 1 микролитр ультрацентрифугированного образца, в 999 микролитров PBS, и загрузить образец в 1 миллилет шприц без пузырьков.Загрузите шприц в входный порт экзаменационной камеры и включите лазер. Используйте кнопку захвата, чтобы открыть камеру и настроить фокус. Затем завемить по крайней мере три различных кадра по 60 секунд каждый и использовать опцию пакетного процесса в программном обеспечении, чтобы проанализировать три различных приобретения.Чтобы подготовить образец к приобретению, сначала добавьте соответствующие экспериментальные моноклональные антитела, конъюгированные бусинки захвата в соотношении 1:1:1, в микроцентрифугу трубки, и вихрь в результате захвата бисера бассейн. Далее добавьте соответствующий объем выборки к 1 микролитеру пула бусинки захвата для генерации 1 раза от 10 до 8 частиц плюс 1,2 раза от 10 до 5 бусин на тестовую концентрацию. Добавьте 1 микролитер из бисера в трубку с маркировкой бисера как отрицательный контроль, и отрегулируйте громкость в каждой трубке до 100 микролитров со свежим PBS.Затем поместите трубки в термомешалке, с встряхивания, на 400 оборотов в минуту, и от 4 до 10 по Цельсию, на ночь. На следующий день, передать образцы на круглое дно 96 хорошо пластины, и добавить соответствующие florescence конъюгированных антител к каждому хорошо. После 1 часа инкубации при 4 до 10 градусов по Цельсию, добавить 100 микролитров PBS к каждой хорошо, и открыть приобретение программного обеспечения.Выберите цитометр и систему запуска программы, чтобы начать инструмент и открыть новый эксперимент. Создайте экспериментальный шаблон, выберите пластину и добавьте пластину. Выберите положение образцов на пластине, и нажмите набор, а также образец.Введите имя образца в правилах именования, откройте вкладку канала и выберите соответствующие каналы сигнала флорескции. Теперь загрузите пластину в инструмент. И нажмите точка участок, чтобы создать новую область рассеяния вперед по сравнению с боковой области рассеяния точка участка.Выберите инициализировать, чтобы начать лазер и fluidics и нажмите запустить, чтобы начать приобретение. Отрегулируйте шкалу, чтобы показать население в середине вперед по сравнению с боковой участок рассеяния, и сделать бисер ворота вокруг всей популяции выборки, чтобы исключить мусор. Нажмите стоп и точка участок для создания вперед рассеяния высоты по сравнению с вперед рассеяния области точка участка, и ворота образца на бисер населения.Нарисуйте новые ворота вокруг большего населения и назовите его Singlets, и нажмите точка участок, чтобы создать один флуоресцентный сигнал по сравнению с боковой рассеяния области точка участка, в экспериментальном флюорофор используется. Ворота новый участок точка на Singlets. Затем выберите количество событий для записи и выберите запись для начала экспериментального приобретения.В конце анализа загрузите файлы приобретения в соответствующее программное обеспечение для анализа и откройте новый протокол. Создайте точечные участки для каждого файла, как только что продемонстрировано, и установите всю ось рассеяния в линейную шкалу, и все флуоресцентные оси для шкалы журнала. Затем покажите геометрическое значение флоресции в соответствующих каналах сигналов, чтобы рассчитать полное изменение среднего интенсивности флорескции, в различных внеклеточных препаратах везикулы.После тестирования различных условий, чтобы установить минимальное общее количество внеклеточных пузырьков, чтобы достичь ранней экспоненциальной фазы кривой интенсивности среднего флуоресценции, минимальное количество частиц было определено в 1 раз от 10 до 8 частиц на окрашивание. Оптимальная концентрация антител в 1 раз от 10 до 8 частиц для достижения наивысшего сигнала без связывания неспецифических антител, была определена как 10 микрограмм на миллилитр как для анти-CD9_FITC и анти-CD63_PE антител и пять микрограмм на миллилитр для анти CD81_PE антитела. Чтобы подтвердить пригодность метода, для анализа чашки формы внеклеточных пузырьков, а не мембранного мусора, внеклеточные пузырьки были sonicated, в результате чего снижение среднего флуоресценции интенсивности, после всего лишь 30 секунд sonication, без флорескции обнаружены на всех после одной минуты механического нарушения.Собственная очистка X от клеток-предшественников сердца, как было продемонстрировано, дает внеклеточные пузырьки, выражая низкий уровень CD9 и высокий уровень CD63 и CD81 у обеих популяций клеток. Кроме того, в то время как собственные маркеры поверхности X четко идентифицируются без ультрацентрифугации, этот шаг обогащения значительно повышает средняя интенсивность флуоресценции этих маркеров. При работе с внеклеточными пузырьками, есть более небрежные гранулы наночастицы могут быть легко пропущены.Поэтому необходимо следовать всем шагам, как это попродемонстрировано в протоколе. Использование внеклеточных пузырьков в качестве биомаркера в настоящее время является одним из самых новых полевых исследований. И в скором времени, может быть переведен в клинической диагностики используется в качестве альтернативного инструмента скрининга.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Анализ отслеживания наночастиц для количественной оценки и определения размера внеклеточных везикул

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Масштабируемое выделение и очистка внеклеточных везикул от кишечной палочки и других бактерий

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Выделение и характеристика цианобактериальных внеклеточных везикул

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Выделение микроРНК из клещей Ex vivo Культуры слюнных желез и внеклеточных везикул

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Выделение и анализ прослеживаемых и функционализированных внеклеточных везикул из плазмы и твердых тканей

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Выделение, характеристика и терапевтическое применение внеклеточных везикул из культивируемых мезенхимальных стволовых клеток человека

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...