Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

L.B. fue apoyado por becas de investigación de Helmut Horten Stiftung y Velux Stiftung, Zurich (Suiza). G.V. fue apoyado por becas de investigación de la Swiss National Science Foundation, la Fundación Cecilia Augusta, Lugano y el SHK Stiftung für Kreislaufkrankheiten und Herz (Suiza)

1. recogida y tratamiento de medios condicionados
<ol><li>Capa de 55 cm2 placas de Petri con gelatina de piel porcino 0,02% en PBS.</li>
	<li>CPC (8.000/cm2) en platos previamente recubiertos de la placa con 7 mL de medio de modificado Dulbecco de Iscove (IMDM) suplementado con 20% FBS (suero bovino Fetal) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Nota: El término "CPC" se refiere a las células del explante humano derivado que han sido descritos en otra parte...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Técnica FC convencional sigue siendo el método analítico más sencillo caracterizar marcadores expresados en la superficie de EV. En este sentido, seleccionar el protocolo más apropiado es crucial para obtener información útil sobre fracciones de partículas individuales de interés evitando limitaciones debido a la sensibilidad del instrumento. Hemos descrito un método utilizando partículas magnéticas juntadas con anticuerpos que reconocen Exo y pequeño EV los antígenos superficiales que son convenientes para...

Las células secretan vesículas extracelulares (EV) de diferentes tamaños incluyendo microvesículas (MV) y exosomas (Exo). Este último puede distinguirse de MV por tamaño y el compartimento subcelular de origen. MV (200-1.000 nm de tamaño) se liberan de las células madre por desprendimiento de la membrana plasmática. Por el contrario, Exo (30 – 150 nm) originan endosomal membranas y se liberan en el espacio extracelular, cuando los cuerpos multivesicular (MVB) se fusionan con la membrana de la célula1,2.
EV son cada vez más utilizados como biomarcadores diagnóstico así como, potencialmente, herramientas terapéuticas en muchos campos como la oncología, Neurología, cardiología y enfermedades musculoesqueléticas3,4,5. Una gran mayoría de los estudios en curso con EV como agentes terapéuticos explotan el aislamiento de las vesículas de acondicionado celular medio (CM) de las células cultivadas in vitro. Las células madre mesenquimales (MSCs) ejercen efectos beneficiosos en varios contextos, y EV derivados de MSC han demostrado beneficios en modelos de isquemia/reperfusión miocardio lesión6 y cerebro lesión7. Derivados de MSC EV también exhiben actividades moduladores inmunes que pueden ser explotadas para el tratamiento de rechazo inmune, como se demostró en un modelo de terapia-refractario injerto - versus - host disease8. Células madre del líquido amniótico (hAFS) enriquecer activamente CM con MVs y Exo, heterogénea en tamaño (50-1.000 nm), que median varios efectos biológicos, tales como proliferación de células diferenciadas, angiogénesis, inhibición de la fibrosis, y cardioprotección4. Hemos demostrado recientemente que EV y particularmente de Exo, secretada por las células del progenitor de origen cardiaco humano (Exo-CPC) reducen el tamaño del infarto de miocardio en ratas5,9.
Exo de compartir un conjunto común de proteínas en su superficie, incluyendo tetraspaninas (CD63, CD81, CD9) y complejo mayor de histocompatibilidad clase I (MHC-I). Además de este conjunto común de proteínas, Exo contienen también proteínas específicas para el subconjunto de EV del tipo de la célula productora. Marcadores de Exo están ganando importancia primordial porque juegan un papel crucial en la comunicación entre celular, de tal modo regulación de muchos procesos biológicos5,10. Debido a su pequeño tamaño, encontrar una manera fácil de analizar EV usando clásico flujo cytometry (FC) sigue siendo una tarea difícil.
Aquí, presentamos un protocolo simplificado para el análisis de la EV con FC, que se puede aplicar a muestras previamente enriquecidas obtenidas mediante ultracentrifugación o directamente a CM (figura 1). El método utiliza bolas recubiertas con un anticuerpo específico que se une canónica asociada a Exo superficie epitopos (CD63, CD9, CD81) sin lavados adicionales. Análisis de la FC pueden realizarse usando un citómetro convencional sin necesidad de ajustes antes de las mediciones. Métodos para la caracterización de antígenos en las partículas pequeñas individuales con citómetros de flujo han sido descritos por otros grupos con respecto a varias aplicaciones11,12,13. Aquí, utilizamos granos magnéticos funcionalizados para la captura de partículas pequeñas y Exo, seguido por fenotipado de partículas captadas por el FC. Aunque este método puede utilizarse para caracterizar la composición antigénica de pequeñas vesículas por cualquier tipo de célula en vitro, aquí proporcionamos condiciones de cultivo de células específicas que se aplican para el cultivo de células progenitoras cardíacas humanas (CPC) y la más ambiente adecuado para la producción de EV por estas células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Citometría de flujo (FC) es el método de elección para la medición semicuantitativa de marcadores de antígeno de superficie celular. Recientemente, esta técnica se ha utilizado para los análisis fenotípicos de vesículas extracelulares (EV) incluyendo exosomas (Exo) en la sangre periférica y otros fluidos corporales. El pequeño tamaño de EV exige el uso de instrumentos dedicados tienen un umbral de detección alrededor de 50-100 nm. Por otra parte, EV se puede enlazar a microesferas de látex que pueden ser detectado por FC. Microesferas, conjugado con anticuerpos que reconocen EV asociado marcadores/Cluster de diferenciación CD63, CD9 y CD81 se pueden utilizar para la captura de EV. Exo de CM puede ser analizada con o sin enriquecimiento previo por ultracentrifugación. Este enfoque es adecuado para análisis EV usando instrumentos convencionales de FC. Nuestros resultados demuestran una correlación lineal entre los valores de la intensidad media de fluorescencia (IMF) y concentración de EV. Interrumpir EV mediante sonicación dramáticamente había disminuido MFI, indicando que el método no detecta restos de membrana. Divulgamos un método exacto y confiable para el análisis de antígenos de superficie de EV, que pueden aplicarse fácilmente en cualquier laboratorio.

Número total de partículas de tinción simple
Puesto que un solo grano puede atar más de una partícula, probamos diferentes condiciones para establecer la menor cantidad de EV total (anticuerpo individual por tubo) para llegar a la fase exponencial temprana de curva de MFI. Una concentración fija de anticuerpo fue utilizada mientras que el número total de partículas entre 5 x 105 a 2.5 x 10<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

El protocolo describe un método reproducible diseñado para uso con sobrenadantes de cultivo celular para detectar epítopos superficiales en pequeñas vesículas extracelulares (EV). Utiliza específica inmunoprecipitación EV usando granos juntados con los anticuerpos que reconocen antígenos de superficie CD9, CD63 y CD81. El método está optimizado para el análisis de citometría de flujo aguas abajo.

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Las Vesículas Extracelulares se utilizan cada vez más como un biomarcador de diagnóstico y herramienta terapéutica potencial en muchos campos. Flow Cytometric es el método analítico más directo para caracterizar por marcadores enfrentados a trajes que este protocolo se puede utilizar en el análisis de una partícula asalizada, es rápido y es aplicable a los sismómetros convencionales sin necesidad de un ajuste especial o el instrumento dedicado. Aunque este protocolo se utiliza para clasificar las Vesículas Extracelulares de dicha condición y medio, se puede ampliar hacia la categorización de los AV de la sangre, para reemplazar las biopsias de tejido invasiva en los pacientes.Para los investigadores nuevos en el protocolo, es fundamental realizar los pasos descritos en la sección del método de configuración, y seguir de cerca las estrategias de obtención demostradas Comenzar por el recubrimiento de 55 centímetros cuadrados Petri-platos con 02%gelatina de piel porcina, en PBS. Después de 15 minutos, lave el plato y la placa 4,4 veces 10 a las quintas células progenitoras cardíacas en cada plato en 7 mililitros del Medio de Dulbecco Modificado de Iscove, o IMDM, complementado con 20%suero bovino fetal, y 1%penicilina y estreptomicina para su incubación a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células alcanzan aproximadamente el 80%confluencia, lave los cultivos dos veces con PBS de Dulbecco sin calcio y magnesio y alimente las células con 10 milileters de medio de producción de exosomas libres de suero.Después de 7 días, acope el medio acondicionado de cada placa, en un solo tubo centrífugo de polipropileno y centrifugar el medio para eliminar cualquier residero celular. Transfiera el sobrenentamiento a un tubo de filtro centrífuga de 100 kilodalton, y concentre el medio despejado, acondicionado, con una centrifugación adicional. Transfiera el concentrado a un tubo de micro centrífuga para una centrifugación de sobremesa final y añada el sobrenadante en un tubo de micro centrífuga de pared gruesa de policarbonato.Llene el tubo con PBS, a un volumen final de 3,2 milileters, y cargue la muestra en un rotor de ángel fijo de titanio. A continuación, cargue el rotor en una ultracentrífuga de mesa para una ultracentrifugación, y resuspender el pellet en 100 microlitros de PBS fresco. Para el seguimiento de nanopartículas y la cuantificación del análisis, diluir 1 microlitro de la muestra ultracentrifugada, en 999 microlitros de PBS, y cargar la muestra en una jeringa de 1 milileter sin burbujas.Cargue la jeringa en el puerto de entrada de la cámara de examen y encienda el láser. Utilice el botón de captura para abrir la cámara y ajustar el enfoque. A continuación, registre al menos tres fotogramas diferentes de 60 segundos cada uno, y utilice la opción de proceso por lotes en el software, para analizar las tres adquisiciones diferentes.Para preparar la muestra para la adquisición, primero agregue las cuentas de captura conjugadas de anticuerpos monoclonales experimentales apropiadas en una proporción de 1:1:1, en un tubo de micro centrífuga, y vórtice la piscina de cuentas de captura resultante. A continuación, agregue el volumen adecuado de muestra a 1 microlitro de la piscina de cuentas de captura para generar un 1 por 10 a las 8 partículas más 1,2 veces 10 a las 5a perlas por concentración de prueba. Agregue 1 microlitro de perlas a un tubo etiquetado con cuentas como control negativo, y ajuste el volumen en cada tubo a 100 microlitros con PBS fresco.A continuación, coloque los tubos en un mezclador térmico, con agitación, a 400 rotaciones por minuto, y de 4 a 10 grados centígrados, durante la noche. Al día siguiente, transfiera las muestras a una placa redonda inferior de 96 pozos, y agregue los anticuerpos conjugados de florescencia apropiados a cada pozo. Después de una incubación de 1 hora a 4 a 10 grados Celsius, agregue 100 microlitros de PBS a cada pozo, y abra el software de adquisición.Seleccione el citómetro y el programa de arranque del sistema, para iniciar el instrumento y abrir un nuevo experimento. Cree una plantilla experimental y seleccione la placa y agregue la placa. Seleccione la posición de las muestras en la placa y haga clic en establecer como muestra.Introduzca el nombre de la muestra en las reglas de nomenclatura, abra la pestaña de canal y seleccione los canales de señal de florescencia adecuados. Ahora cargue la placa en el instrumento. Y haga clic en gráfica de puntos, para crear un nuevo área de dispersión hacia delante frente a la gráfica de puntos de área de dispersión lateral.Seleccione inicializar para iniciar el láser y los fluidos y haga clic en Ejecutar para iniciar la adquisición. Ajuste la escala para mostrar la población en el medio de la gráfica de dispersión hacia delante frente frente a lado, y dibuje una puerta de cuentas alrededor de toda la población de la muestra para excluir los desechos. Haga clic en stop and dot plot para crear una altura de dispersión hacia delante frente en un gráfico de puntos de dispersión hacia delante y atrapese la muestra en la población de cuentas.Dibuje una nueva puerta alrededor de la población más grande y asígnela Singlets, y haga clic en gráfica de puntos para crear una gráfica de puntos de dispersión de lado frente a la gráfica de puntos de dispersión lateral, por fluoróforo experimental utilizado. Cierra la nueva gráfica de puntos en los Singlets. A continuación, seleccione el número de eventos que desea grabar y seleccione registro para iniciar la adquisición experimental.Al final del análisis, cargue los archivos de adquisición en el software de análisis adecuado y abra un nuevo protocolo. Cree trazados de puntos para cada archivo como se acaba de demostrar y establezca todo el eje de dispersión en escala lineal y todo el eje florescente en la escala de registro. A continuación, muestre la media geométrica de florescencia en los canales de señales relevantes, para calcular el cambio completo en la intensidad media de la florescencia, en las diferentes preparaciones de vesícula extracelular.Después de probar diferentes condiciones para establecer la menor cantidad total de vesículas extracelulares para alcanzar la fase exponencial temprana de una curva de intensidad de florescencia media, se determinó que el número mínimo de partículas era de 1 por 10 a 8 partículas por tinción. Se determinó que la concentración óptima de anticuerpos durante 1 veces 10 a las 8 partículas para lograr la señal más alta sin unión de anticuerpos inespecíficos era de 10 microgramos por mililitro para anticuerpos anti CD9_FITC y anti CD63_PE y cinco microgramos por mililitro para el anticuerpo anti CD81_PE. Para confirmar la idoneidad del método, para analizar las vesículas extracelulares en forma de copa, y no los residuos de membrana, las vesículas extracelulares fueron sonicadas, lo que resultó en una disminución en la intensidad media de la florescencia, después de tan solo 30 segundos de sonicación, sin que se detectaran florescencias en absoluto después de un minuto de interrupción mecánica.La purificación propia de X a partir de células progenitoras cardíacas como se ha demostrado, produce vesículas extracelulares, expresando bajos niveles de CD9 y altos niveles de CD63 y CD81 de ambas poblaciones celulares. Además, mientras que los marcadores de superficie propios de X son claramente identificables sin ultracentrifugación, este paso de enriquecimiento mejora en gran medida la intensidad media de la florescencia de estos marcadores. Cuando se trabaja con vesículas extracelulares, hay más pellets de nanopartículas descuidados que se pueden perder fácilmente.Por lo tanto, es esencial seguir todos los pasos como se muestra en el protocolo. El uso de vesículas extracelulares como biomarcador es ahora una de las investigaciones de campo más emergentes. Y pronto, puede traducirse en el diagnóstico clínico utilizado como una herramienta alternativa de cribado.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Investigación

Biología

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Análisis de seguimiento de nanopartículas para la cuantificación y determinación del tamaño de vesículas extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares cianobacterianas

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...