Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Larsson fick stöd av forskningsanslag av Helmut Horten Stiftung och Velux Stiftung, Zürich (Schweiz). G.V. stöddes av forskningsanslag av schweiziska National Science Foundation, Stiftelsen Cecilia-Augusta, Lugano och SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Schweiz)

1. insamling och bearbetning av konditionerat Media
<ol><li>Coat 55 cm2 petriskålar med 0,02% svin hud gelatin i PBS.</li>
	<li>Skylt CPC (8.000/cm2) i förväg belagda rätter med 7 mL av Iscoves modifierade Dulbecco's Medium (IMDM) kompletteras med 20% FBS (fetalt bovint Serum) och 1% Penicillin/Streptomycin (P/S). Obs: Begreppet ”CPC” avser mänskliga explant härrör celler som har varit beskrivs på annan plats14. CM kan hämtas från olika cel...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Konventionella FC teknik är fortfarande den mest okomplicerade analytiska metoden att karakterisera markörer som uttrycks på ytan av EV. I detta sammanhang är välja lämpligaste protokollet avgörande för att få användbar information på enskild partikel fraktioner av intresse genom att undvika begränsningar på grund av instrumentet känslighet. Vi beskrivs en metod med magnetiska partiklar tillsammans med antikroppar som känner igen Exo och små EV ytantigenerna som lämpar sig för efterföljande FC ansökan...

Celler utsöndrar extracellulära blåsor (EV) av olika storlekar, inklusive microvesicles (MV) och exosomes (Exo). Den senare kan skiljas från MV både storlek och subcellulär facket av ursprung. MV (200-1000 nm i storlek) frigörs från överordnade celler genom utgjuta från plasmamembranet. Omvänt, Exo (30 – 150 nm) härstammar från endosomal membran och släpps ut i det extracellulära utrymmet när de multivesicular organen (MVB) säkring med cellmembranet1,2.
EV blir alltmer används som diagnostiska markörer samt som, potentiellt, terapeutiska verktyg inom många områden bland annat onkologi, neurologi, kardiologi och muskuloskeletala sjukdomar3,4,5. En stor majoritet av pågående studier med EV som terapeutiska medel utnyttja isolering av blåsor från cell-villkorade medium (CM) av in vitro-odlade celler. Mesenkymala stamceller (MSC) utöva gynnsamma effekter i flera sammanhang och MSC-derived EV har visat fördelar i modeller av myokardischemi/reperfusion skada6 och hjärnan skada7. MSC-derived EV uppvisar också immun immunmodulerande aktiviteter som kan utnyttjas för att behandla immun avvisande, vilket framgår i en modell av terapi eldfasta graft - versus - host sjukdom8. Fostervatten vätska stamceller (hAFS) aktivt berika CM med MVs och Exo, heterogent fördelat i storlek (50-1000 nm), som medlar flera biologiska effekter, såsom spridning av differentierade celler, angiogenes, hämning av fibros, och hjärtfunktionen4. Vi har nyligen visat att EV, och särskilt Exo, utsöndras av mänskliga hjärt-derived stamceller (Exo-CPC) minska hjärtinfarkt storlek i råttor5,9.
EXO dela en gemensam uppsättning proteiner på ytan, inklusive tetraspanins (CD63, CD81, CD9) och stora histocompatibility komplex klass I (MHC-jag). Förutom denna gemensamma uppsättning av proteiner, Exo även innehåller proteiner som är specifika för den EV delmängden av producenten celltyp. EXO markörer vinner avgörande betydelse eftersom de spelar en avgörande roll i mellan cellulär kommunikation, därmed reglera många biologiska processer5,10. På grund av sin storlek, att hitta ett enkelt sätt att analysera EV använder klassiskt flöde flödescytometri (FC) återstår en utmanande uppgift.
Här presenterar vi ett förenklat protokoll för EV analys med FC, som kan tillämpas på pre berikad produktproverna genom ultracentrifugering eller direkt till CM (figur 1). Metoden använder pärlor belagd med en specifik antikropp som binder kanoniska Exo-associerade ytan epitoper (CD63, CD9, CD81) utan ytterligare tvättar. FC analyser kan utföras med en konventionell cytometer utan behov av justeringar innan mätningar. Metoder för karakterisering av antigener på enskilda små partiklar med flöde cytometers har beskrivits av andra grupper med avseende på olika program11,12,13. Här, använde vi functionalized magnetiska pärlor för fångst av små partiklar och Exo, följt av fenotypning av infångade partiklar av FC. Även om denna metod kan användas för att karaktärisera antigena sammansättningen av små blåsor som släpptes av vilken celltyp som in vitro-, gav här vi viss cell kultur villkor som gäller för kulturen av mänskliga hjärt stamceller (CPC) och mest lämplig miljö för produktion av EV av dessa celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Flödescytometri (FC) är metoden för val av semi kvantitativ mätning av cellytan antigen markörer. Denna teknik har nyligen använts för fenotypisk analyser av extracellulära blåsor (EV) inklusive exosomes (Exo) i perifert blod och andra kroppsvätskor. Den lilla storleken på EV mandat användningen av särskilda instrument med en påvisbara gränsen runt 50-100 nm. Alternativt kan EV vara bunden till latex mikrokulor som kan upptäckas av FC. Mikrokulor, konjugerat med antikroppar som känner igen EV-associerade markörer/kluster av differentiering CD63, CD9 och CD81 kan användas för EV fånga. EXO isolerade från CM kan analyseras med eller utan före berikning av ultracentrifugering. Denna metod är lämplig för EV analyser med hjälp av konventionella FC instrument. Våra resultat visar en linjär korrelation mellan menar fluorescens intensitet (MFI) värden och EV koncentration. Störa EV genom ultraljudsbehandling dramatiskt minskade MFI, som visar att metoden inte upptäcker membran skräp. Vi rapporterar en korrekt och tillförlitlig metod för analys av EV ytantigener, som lätt kan genomföras i ett laboratorium.

Totalt antal partiklar för enda färgning
Eftersom en enda pärla kan binda mer än en partikel, testade vi olika villkor för att ställa den minsta mängden totala EV (enda antikropp per rör) för att nå den tidiga exponentiella fasen av MFI kurva. En fast koncentration av antikroppar användes medan det totala antalet partiklar som varierade från 5 x 105 till 2,5 x 108. Som visas i <...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Protokollet beskrivs en reproducerbar metod utformad för användning med cell cellkulturer för att upptäcka ytan epitoper på små extracellulära blåsor (EV). Det använder specifika EV immunoprecipitation använder pärlor tillsammans med antikroppar som känner igen ytantigen CD9, CD63 och CD81. Metoden är optimerad för nedströms Flödesanalys flödescytometri.

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Extracellulära vesiklar används alltmer som en diagnostisk biomarkör och potentiella terapeutiska verktyg inom många områden. Flow Cytometric är den mest rakt framåt analysmetod för att karakterisera genom kostym inför markörer detta protokoll kan användas i att analysera en assized partikel, är snabb, och är tillämplig på konventionella seismometrar utan behov av särskild inställning eller dedicerade instrumentet. Även om detta protokoll används för att kategorisera Extracellular Vesicles från nämnda tillstånd och medium, det kan utvidgas mot kategorisering av blod anlände AVs, att ersätta invasiva vävnad tarmbiopsier hos patienter.För forskare som är nya i protokollet är det viktigt att utföra steg som beskrivs i set-up-metoden avsnitt, och att noga följa de demonstrerade få strategier Börja med beläggning 55 centimeter kvadrat Petri-rätter med 02%svin hud gelatin, i PBS. Efter 15 minuter, tvätta skålen och plattan 4,4 gånger 10 till den femte hjärt progenitor celler på varje maträtt i 7 milliliter av Iscove's Modified Dulbecco's Medium, eller IMDM, kompletteras med 20%fetala nötkreatur serum, och 1%penicillin och streptomycin för deras inkubation vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. När cellerna når ca 80%konfluency, tvätta kulturerna två gånger med Dulbeccos PBS utan kalcium och magnesium och mata cellerna med 10 milileters serum fri exosome produktionsmedium.Efter 7 dagar, pool det konditionerade mediet från varje platta, i en enda polypropylencentrifugrör och centrifug mediet för att avlägsna eventuella cellskräp. Överför supernatent i en 100 kilodalton centrifug filterrör, Och koncentrera den rensade, konditionerade, medium med en extra centrifugering. Överför koncentratet till ett mikrocentrifugrör för en slutlig bänkskiva centrifugering och tillsätt supernatent i en polykarbonat tjock vägg mikro centrifugering röret.Fyll röret med PBS, till en slutlig volym på 3,2 milileters, och ladda provet i en titan fast angeled rotor. Ladda sedan rotorn i en bordsskiva ultracentrifug för ultracentrifugering, och återanvänd pelleten i 100 mikroliter av färska PBS. För nanopartikelspårning och analyskvantifiering späds 1 mikroliter av det ultracentrifugerade provet, i 999 mikroliter PBS, och lasta provet i en 1 milileterspruta utan bubblor.Ladda sprutan i inloppsporten i undersökningskammaren, och sätt på lasern. Använd infångstknappen för att öppna kameran, och justera fokus. Spela sedan in minst tre olika bildrutor på 60 sekunder vardera, och använd alternativet för batchprocessen i programvaran, för att analysera de tre olika förvärven.För att förbereda provet för förvärv, först lägga till lämplig experimentell monoklonala antikroppar konjugerad fånga pärlor vid en 1:1:1 förhållande, i en mikro centrifugrör, och virvel den resulterande fånga pärla pool. Därefter lägger du till lämplig volym av prov till 1 mikroliter av fånga pärla pool för att generera en 1 gånger 10 till 8 partiklar plus 1,2 gånger 10 till 5: e pärlor per testkoncentration. Tillsätt 1 mikroliter pärlor till ett rör märkt pärlor som den negativa kontrollen, och justera volymen i varje rör till 100 mikroliter med färska PBS.Placera sedan rören i en thermo mixer, med skakningar, på 400 rotationer per minut, och 4 till 10 Celsius, över natten. Nästa dag, överför proverna till en rund botten 96 väl platta, och tillsätt lämplig florescence konjugerade antikroppar till varje brunn. Efter en 1 timme inkubation vid 4 till 10 grader Celsius, tillsätt 100 mikroliter PBS till varje brunn, och öppna förvärv programvara.Välj cytometer och system starta upp program, för att starta instrumentet och öppna ett nytt experiment. Skapa en experimentell mall, och välj platta och lägg till plåt. Välj placering av proverna på plattan, och klicka på set som prov väl.Ange exempelnamnet i namngivningsreglerna, öppna kanalfliken och välj lämpliga valssignalkanaler. Nu lasta plattan i instrumentet. Och klicka punkt tomt, att skapa en ny framåt scatter område kontra sidan scatter område punkt tomt.Välj initiera för att starta lasern och fluidiken och klicka kör för att starta förvärvet. Justera skalan för att visa befolkningen i mitten av framåt kontra sida scatter tomt, och rita en pärlor grind runt hela provpopulationen att utesluta skräp. Klicka på Stopp och punkt plot för att skapa en framåt scatter höjd kontra framåt scatter område punkt tomt, och grind provet på pärlor befolkningen.Rita en ny port runt den större befolkningen och namnge det Singlets, och klicka på dot plot för att skapa en fluorescerande signal kontra sida scatter område punkt tomt, per experimentell fluorophore används. Grind den nya prick tomt på Singlets. Välj sedan antalet händelser som ska registreras och välj post för att starta den experimentella anskaffningen.I slutet av analysen, ladda förvärvsfilerna i lämplig analys programvara, och öppna ett nytt protokoll. Skapa punktytningar för varje fil som just visats, och ställ in alla spridningsaxeln på linjär skala, och alla den fluorescerande axeln till loggskala. Visa sedan det florescence geometriska medelvärdet i de relevanta signalkanalerna, för att beräkna den fulla förändringen i medelflurescensintensitet, i de olika extracellulära vesikelpreparaten.Efter testning olika villkor för att ställa in den minsta totala mängden extracellulära vesiklar för att nå den tidiga exponentiell fas av ett medelvärde florescence intensitet kurva, var det minsta antalet partiklar som fastställts vara 1 gånger 10 till de 8 partiklar per färgning. Den optimala koncentrationen av antikropp för 1 gånger 10 till de 8 partiklarna för att uppnå den högsta signalen utan icke-specifik antikroppsbindning, bestämdes vara 10 mikrogram per milliliter för både anti CD9_FITC och anti CD63_PE antikroppar och fem mikrogram per milliliter för anti CD81_PE-antikroppen. För att bekräfta lämpligheten av metoden, för att analysera kopp formad extracellulära vesiklar, och inte membran skräp, de extracellulära vesiklar var sonicated, vilket resulterar i en minskning av medelvärdet florescence intensitet, efter så lite som 30 sekunder av ultraljudsbehandling, med ingen florescence upptäcktes alls efter en minut av mekaniska störningar.X egen rening från hjärt progenitor celler som visats, avkastning extracellulära vesiklar, uttrycker låga nivåer av CD9 och höga nivåer av CD63 och CD81 från båda cell populationer. Dessutom, medan X egna ytmarkörer är tydligt identifierbara utan ultracentrifugering, ökar detta anrikningssteg kraftigt den genomsnittliga florescenceintensiteten hos dessa markörer. När du arbetar med extracellulära vesicles, det finns mer slarvig nano partikel pellets kan lätt missas.Därför är det väsentligt att följa alla steg som visas i protokollet. Att använda extracellulära vesicles som biomarkör är nu en av de mest framväxande fältforskningen. Och snart, kan översättas till den kliniska diagnostiska används som ett alternativt screeningverktyg.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Kartläggning och analys av mus erytroida stamceller med CD71/TER119 Flow-cytometrisk analys

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikelspårningsanalys för kvantifiering och storleksbestämning av extracellulära blåsor

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från Escherichia coli och andra bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolering och karakterisering av cyanobakteriella extracellulära vesiklar

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolering av mikroRNA från Tick Ex Vivo spottkörtelkulturer och extracellulära vesiklar

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Isolering och analys av spårbara och funktionaliserade extracellulära vesiklar från plasma och fasta vävnader

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering och terapeutisk tillämpning av extracellulära vesiklar från odlade humana mesenkymala stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...