Name: flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media
Uploaded: 2019-02-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

BANGİN'Helmut Horten Stiftung ve Velux Stiftung, Zürih (İsviçre) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir. G.V. İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, Cecilia-Augusta Vakfı, Lugano ve SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (İsviçre) araştırma hibe tarafından desteklenmiştir

1. toplama ve klimalı ortam işleme
<ol><li>55 cm2 Petri yemekler PBS içinde %0.02 domuz deri jelatin ile kat.</li>
	<li>Plaka TBM (8.000/cm2) önceden kaplanmış yemekler 7 mL, Iscove'nın modifiye Dulbecco'nın orta (20 ile desteklenmiş IMDM) ile % FBS (Fetal sığır Serum) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S). Not: "TBM" olmuştur insan explant türetilmiş hücrelere bir terimdir başka bir14bölümünde. CM farklı hücre türleri belirli koşull...

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. , (2017).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Yadav, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+in+pancreatic+cancer:+the+beginning+of+a+new+era.">Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era.</a> Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).</li><li>Balbi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Characterization+of+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cell+Extracellular+Vesicles+as+a+Powerful+Paracrine+Tool+Endowed+with+Regenerative+Potential.">First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).</li><li>Andriolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+From+Human+Cardiac+Progenitor+Cells+for+Therapeutic+Applications:+Development+of+a+GMP-Grade+Manufacturing+Method.">Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method.</a> Frontiers in Physiology. 9, (2018).</li><li>Lai, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secreted+by+MSC+reduces+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Stem Cell Research. 4, (2009).</li><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+Improve+Post-Stroke+Neuroregeneration+and+Prevent+Postischemic+Immunosuppression.">Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).</li><li>Kordelas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSC-derived+exosomes:+a+novel+tool+to+treat+therapy-refractory+graft-versus-host+disease.">MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease.</a> Leukemia. 28, 970-973 (2014).</li><li>Barile, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+cardiac+progenitor+cells+inhibit+cardiomyocyte+apoptosis+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).</li><li>Longatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+single-chain+variable+fragments+are+specific+and+versatile+targeting+motifs+for+extracellular+vesicles.">High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).</li><li>Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Microvesicles+from+Peripheral+Blood.">Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry.">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Arakelyan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Virometry+to+Analyze+Antigenic+Spectra+of+Virions+and+Extracellular+Vesicles.">Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chimenti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem/progenitor+cells+in+the+form+of+cardiospheres+from+human+cardiac+biopsies+and+murine+hearts.">Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts.</a> Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).</li><li>van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).</li><li>Pospichalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+fluorescently+labeled+exosomes+and+microvesicles+using+dedicated+flow+cytometer.">Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).</li><li>van der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updating+the+MISEV+minimal+requirements+for+extracellular+vesicle+studies:+building+bridges+to+reproducibility.">Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cellular Biology. , (2006).</li><li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7, 11271 (2017).</li><li>Sodar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Sluijter, J. P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+diagnostics+and+therapy+of+the+ischaemic+heart:+Position+Paper+from+the+Working+Group+on+Cellular+Biology+of+the+Heart+of+the+European+Society+of+Cardiology.">Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology.</a> Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).</li></ol>

Geleneksel FC teknik EV yüzeyine ifade işaretçileri özelleştirmek için en kolay analitik yöntem kalır. Bu bağlamda, en uygun iletişim kuralını seçme sınırlamaları enstrüman duyarlılık nedeniyle kaçınarak bireysel parçacık kesirler ilgi yararlı bilgiler elde etmek çok önemlidir. Manyetik parçacıklar Exo ve aşağı akım FC uygulama için uygun olan küçük EV yüzey antijenleri tanır antikorlar ile birleştiğinde kullanarak bir yöntemi açıklanmıştır. Biz iki farklı hücre türleri'ni...

Hücreleri ekstrasellüler veziküller (EV) microvesicles (MV) ve exosomes (dış) dahil olmak üzere farklı boyutlardaki salgılar. İkinci MV boyutu ve menşe hücre altı yuvası tarafından ayrılır. MV (200-1000 nm boyutunda) plazma zarı dökülme tarafından üst hücrelerden salınır. Tersine, Exo (30-150 nm) ve endosomal membran köken multivesicular organları (MVB) ile hücre zarının1,2sigorta ekstraselüler uzaya serbest bırakılır.
EV vardır giderek tanılama biyolojik de gibi büyük olasılıkla, Onkoloji, Nöroloji, Kardiyoloji ve kas-iskelet hastalıkları3,4,5de dahil olmak üzere birçok alanlarda tedavi aletleri used. Devam eden çalışmalar terapötik ajanlar veziküller ortamdan hücre şartına (CM) tüp bebek kültürlü hücre izolasyon yararlanma gibi EV kullanarak büyük bir çoğunluğu. Mezenkimal kök hücre (MSCs) çeşitli bağlamlarda yararlı etkileri uygulamak ve MSC kaynaklı EV miyokardiyal iskemi/reperfüzyon hasarı6 ve beyin hasarı7modellerinde faydalar göstermiştir. MSC kaynaklı EV ayrıca bağışıklık ret, tedavi etmek için bir terapi-refrakter graft - versus - host hastalığı8modelinde gösterildiği şekilde yararlanılabilir immün düzenleyici faaliyetleri sergi. Amniyotik sıvı kök hücreleri (hAFS) aktif CM MVs ve Exo heterogeneously boyutu (50-1000 nm), hangi hızla çoğalmak-in farklılaşmış hücreler, anjiogenez, fibrozis, inhibisyonu gibi birçok biyolojik etkileri arabuluculuk dağıtılmış, zenginleştirmek ve cardioprotection4. Biz son zamanlarda göstermiştir EV ve özellikle Exo (Exo-TBM) insan kalp kaynaklı progenitör hücreler tarafından salgılanan, fareler5,9miyokard enfarktüsü boyutunu küçültün.
Exo paylaşım proteinler onların yüzeyinde, tetraspanins (CD63, CD81, CD9) ve MHC kompleksi de dahil olmak üzere ortak bir dizi sınıf ı (MHC-ben). Proteinler bu ortak kümesinin yanı sıra, Exo da proteinler özel EV alt yapımcı hücre türü için içerir. Onlar arası hücresel iletişim, böylece birçok biyolojik süreçlerin5,10düzenleyen çok önemli bir rol oynamak çünkü Exo işaretleri büyük önem kazanmaktadır. Küçük boyutlarından dolayı zor bir görev EV klasik akış sitometresi (FC) kalıntıları kullanarak analiz etmek için kolay bir yol bulmak.
Burada, önceden zenginleştirilmiş örnekleri ultrasantrifüj ile elde edilen veya doğrudan CM (Şekil 1) uygulanabilir FC EV analizi için basitleştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut. Yöntem kurallı Exo ilişkili yüzey epitopları (CD63, CD9, CD81) bağlar spesifik bir antikor ile kaplı boncuk ek yıkama kullanır. FC analizleri ayarlamalar ölçümleri öncesinde gerek yok ile geleneksel sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Akış cytometers kullanarak bireysel küçük parçacıklar antijenlere karakterizasyonu için yöntemleri diğer gruplar ile ilgili çeşitli uygulamalar11,12,13tarafından tarif edilmiştir. Burada, functionalized manyetik boncuklar küçük parçacıklar ve Exo FC tarafından yakalanan parçacıkların fenotipleme ardından, yakalanması için kullanılır. Her ne kadar küçük veziküller herhangi bir hücre tipi tüp bebek tarafından yayımlanan antijenik kompozisyon tanımlamak için bu yöntem kullanılabilir, burada geçerli olan belirli hücre kültür koşulları kültür insan kalp progenitör hücre (TBM) ve en iyi için verdiğimiz Bu hücreler tarafından EV imalatı için uygun ortam.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:816px;" width="816">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:369px;">IMDM</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:235px;">12440061</td>
			<td style="width:99px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100&#160;kDa&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CytoFlex, Flow Cytometer Platform</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CytoFlex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s PBS (PBS) Ca- and Mg-free</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD63 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C63-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD81 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C81-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ExoCap CD9 Capture Kit</td>
			<td>JSR Life Sciences</td>
			<td>Ex-C9-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-Depleted FBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Exosome-depleted FBS Media Supplement</td>
			<td>SBI</td>
			<td>EXO-FBS-250A-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS-Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-human CD9 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>312104&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID: AB_2075894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer analysis software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Kaluza</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight LM10</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoSight Software</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA 2.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima Max-XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD63 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>353004&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10897809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349505&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; RRID:AB_10642024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382 000 015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TLA-110</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-110 rotors</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of extracellular vesicles from cell-conditioned media

Akış Sitometresi (FC) hücre yüzey antijeni işaretlerinin yarı kantitatif ölçüm için seçim yöntemidir. Son zamanlarda, bu teknik ekstraselüler veziküller (EV) exosomes (dış) periferik kan ve diğer vücut sıvıları da dahil olmak üzere fenotipik analizleri için kullanılmıştır. EV küçük boyutlu bir algılama eşiği çevresinde sahip özel aletlerin kullanımı zorunlu kılar 50-100 nm. Alternatif olarak, EV FC tarafından tespit edilebilir lateks lastikteki ilişkili olabilir. Lastikteki EV ilişkili işaretçileri/küme farklılaşma CD63, CD9 ve CD81 tanımak antikorlar ile Birleşik,-ebilmek var olmak kullanılmış EV yakalama için. Exo CM izole veya ön zenginleştirme olmadan ultrasantrifüj tarafından çözümlenebilir. Geleneksel FC aletler kullanarak EV analizleri için uygun bir yaklaşımdır. Bizim sonuçlar demek floresan yoğunluğu (MFI) değerleri ve EV konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki gösterilmektedir. EV sonication önemli ölçüde bozmakta MFI, yöntemi membran enkaz algılamaz gösteren azalmıştır. Biz herhangi bir laboratuvarda olabilir uygulamaya kolayca EV yüzey antijenleri analizi için doğru ve güvenilir bir yöntem raporu.

Tek boyama için parçacıklarının toplam sayısı
Tek bir boncuk birden çok parçacık bağlayabilirsiniz, biz erken üssel faz MFI eğrinin ulaşmak için toplam EV (tüp başına tek antikor) en az miktarda ayarlamak için farklı koşullarda test. 5 x 105 2.5 x 10 için değişen parçacıklar toplam sayısı ise antikor sabit bir konsantrasyon kullanılan8. Şek...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Protokol hücre kültür supernatants ile kullanılmak üzere tasarlanmış küçük hücre dışı veziküller (EV) üzerinde yüzey epitopları algılamak için tekrarlanabilir yöntemi açıklanır. Yüzey antijeni CD9, tanıyan antikorlar ile CD63 ve CD81 birleştiğinde boncuk kullanarak belirli EV immunoprecipitation kullanır. Yöntem aşağı akım akış sitometresi analizi için optimize edilmiştir.

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Ekstrasellüler Veziküller giderek birçok alanda tanısal biyomarker ve potansiyel tedavi aracı olarak kullanılmaktadır. Akış Sitometrik takım elbise yüzlü işaretçilere göre karakterize etmek için en düz ileri analitik yöntemdir bu protokol bir boyutlandırılmış parçacığın analizinde kullanılabilir, hızlıdır ve özel ayarına veya özel alete gerek kalmadan geleneksel sismometreler için geçerlidir. Bu protokol, ekstrasellüler vezikülleri belirtilen durum ve ortamdan ayırmak için kullanılmasına rağmen, hastalarda invaziv doku biyopsilerinin yerine, gelen kanın kategorize edilmesine doğru genişletilebilir.Protokole yeni başlayan araştırmacılar için kurulum yöntemi bölümünde açıklanan adımları gerçekleştirmek ve pbs'de 55 santimetre karelik Petri-tabakları %02 domuz derisi jelatini ile kaplayarak elde etme stratejilerini yakından takip etmek önemlidir. 15 dakika sonra, iscove's Modifiye Dulbecco's Medium veya IMDM, % 20 fetal sığır serumu ile desteklenen ve 37 derece santigrat derece ve% 5 karbon dioksit onların kuluçka için% 1 penisilin ve streptomisin ile desteklenen her çanak üzerine çanak ve plaka 4.4 kez 10. Hücreler yaklaşık % 80 biraraya geldiğinde, kalsiyum ve magnezyum olmadan Dulbecco PBS ile iki kez kültürleri yıkayın ve serum ücretsiz ekzozom üretim ortamı 10 milileters ile hücreleri beslemek.7 gün sonra, havuz her plaka dan klimalı orta, tek bir polipropilen santrifüj tüp içine ve herhangi bir hücre enkaz kaldırmak için orta santrifüj. Supernatent'i 100 kilodalton santrifüj filtre tüpüne aktarın ve temizlenmiş, şartlı, orta yı ek bir santrifüjle yoğunlaştırın. Son bir tezgah üstü santrifüj için bir mikro santrifüj tüp içine konsantre aktarın ve bir polikarbonat kalın duvar mikro santrifüj tüp içine supernatent ekleyin.Tüpü PBS ile doldurun, son hacmi 3,2 milileters için, ve titanyum sabit melekli rotor içine örnek yükleyin. Daha sonra rotoru ultrasantrifüj için bir masa üstü ultracentrifuge'a yükleyin ve peleti 100 mikrolitre taze PBS'de yeniden askıya alın. Nanopartikül izleme ve analiz nicelemesi için, 999 mikrolitre PBS'de ultrasantrifüjlü numunenin 1 mikrolitresini seyreltin ve numuneyi kabarcıksız 1 milileter şırıngasına yükleyin.Şırıngayı muayene odasının giriş noktasına yükleyin ve lazeri açın. Kamerayı açmak ve odağı ayarlamak için yakalama düğmesini kullanın. Ardından, her biri 60 saniyelik en az üç farklı kare kaydedin ve üç farklı satın almayı analiz etmek için yazılımdaki toplu işlem seçeneğini kullanın.Satın alma için örnek hazırlamak için, ilk bir mikro santrifüj tüpü içine, 1:1:1 oranında uygun deneysel monoklonal antikor konjuge yakalama boncuk ekleyin ve elde edilen yakalama boncuk havuzu girdap. Daha sonra, 1 mikrolitre yakalama boncuk havuzuna uygun numune hacmini ekleyerek 8 parçacıka 10 katı artı test konsantrasyonu başına 5.boncuk sayısına 1.2 kat 10 oluşturun. Negatif kontrol olarak boncuk etiketli bir tüp e 1 mikrolitre boncuk ekleyin ve taze PBS ile 100 mikrolitre her tüp hacmini ayarlayın.Sonra bir termo mikser tüpler yerleştirin, sallayarak, dakikada 400 rotasyonlar, ve 4-10 Santigrat, bir gecede. Ertesi gün, yuvarlak bir alt 96 iyi plaka örnekleri aktarın ve her kuyuya uygun floresan konjuge antikorlar ekleyin. 4 ila 10 santigrat derece bir 1 saat kuluçka sonra, her kuyu için PBS 100 mikrolitre ekleyin ve satın alma yazılımı açın.Aleti başlatmak ve yeni bir deneme açmak için sitometre yi ve sistem başlangıç programını seçin. Deneysel bir şablon oluşturun ve plakayı seçin ve plaka ekleyin. Plakadaki örneklerin konumunu seçin ve örnek olarak ayarla'yı tıklatın.Adlandırma kurallarına örnek adı girin, kanal sekmesini açın ve uygun floresan sinyal kanallarını seçin. Şimdi plakayı alete yükleyin. Ve nokta çizimi, yan dağılım alanı nokta çizimkarşı yeni bir ileri dağılım alanı oluşturmak için tıklatın.Lazer ve akışkanbaşlatmak için başlat'ı seçin ve satın alma başlatmak için çalıştır'ı tıklatın. Ölçeği, ileri ve yan dağılım çiziminin ortasındaki popülasyonu göstermek için ayarlayın ve enkazı dışlamak için tüm örnek popülasyonun etrafına bir boncuk kapısı çizin. İleri dağılım yüksekliği ne kadar ileri dağılım alanı nokta çizimi oluşturmak için dur ve nokta çizimini tıklatın ve örneği boncuk popülasyonuna kapama.Büyük nüfus etrafında yeni bir kapı çizin ve Singlets adını ve kullanılan deneysel florofor başına, yan dağılım alanı nokta arsa karşı bir floresan sinyal oluşturmak için nokta çizim tıklayın. Singlets yeni nokta arsa kapısı. Ardından kaydedilecek olay sayısını seçin ve deneysel edinimi başlatmak için kaydı seçin.Analizin sonunda, edinme dosyalarını uygun analiz yazılımına yükleyin ve yeni bir protokol açın. Her dosya için yalnızca gösterildiği gibi nokta çizimleri oluşturun ve tüm dağılım eksenini doğrusal ölçek ve floresan eksenin tümünün günlük ölçeğine ayarlayın. Daha sonra, farklı hücre dışı vezikül preparatlarında, ortalama floresanyoğunluğundaki tam değişimi hesaplamak için, ilgili sinyal kanallarındaki floresan geometrik ortalamayı gösterin.Ortalama floresans yoğunluğu eğrisinin erken üstel fazına ulaşmak için en küçük toplam hücre dışı vezikül miktarını ayarlamak için farklı koşullar test edildikten sonra, en az partikül sayısının 1 çarpı 10 ile 8 partikül arasında olduğu belirlenmiştir. Spesifik olmayan antikor bağlama olmadan en yüksek sinyali elde etmek için 8 partiküle 1 kez 10 için en uygun antikor konsantrasyonu, hem anti CD9_FITC hem de anti CD63_PE antikorları için mililitre başına 10 mikrogram ve anti CD81_PE antikor için mililitre başına beş mikrogram olarak belirlendi. Yöntemin uygunluğunu doğrulamak için, fincan şeklindeki hücre dışı vezikülleri analiz etmek için, membran enkazı değil, hücre dışı veziküller sonicated edildi, ortalama floresans yoğunluğunda bir azalma ile sonuçlanan, sonication kadar az 30 saniye sonra, mekanik bozulma bir dakika sonra hiç floresan salgılanan ile.Gösterildiği gibi kardiyak progenitor hücrelerinden X kendi saflaştırma, ekstrasellüler veziküller verir, CD9 düşük düzeyde ve CD63 ve CD81 yüksek düzeyde her iki hücre popülasyonlarından ifade. Ayrıca, X'in kendi yüzey belirteçleri ultrasantrifüj olmadan açıkça tanımlanabilir olsa da, bu zenginleştirme adımı bu belirteçlerin ortalama floresan yoğunluğunu büyük ölçüde artırır. Ekstrasellüler veziküller ile çalışırken, daha dikkatsiz nano parçacık pelet kolayca cevapsız olabilir.Bu nedenle, protokolde gösterildiği gibi tüm adımı takip etmek esastır. Bir biyomarker olarak ekstrasellüler veziküller kullanarak şimdi en gelişmekte olan alan araştırma biridir. Ve yakında, alternatif bir tarama aracı olarak kullanılan klinik tanıya çevrilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...