Name: a deep-sequencing-assisted, spontaneous suppressor screen in the fission yeast schizosaccharomyces pombe
Uploaded: 2019-03-07T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe at JoVE.com

وأيد هذا العمل بالمعهد العامة الطبية العلوم الوطنية، منح 1R15GM119105-01 إلى K.Z. ونحن نشكر كافة المراجعين للتعليقات الثاقبة. ونشكر أيضا جيمس تاكر، أليسيا أندرسون، إليزابيث الأسود وغلين Marrs للمناقشة والتعليقات على هذه المخطوطة.

1-سلالة البناء وإعداد
<ol><li>توليد طفرة أو حذف من الجينات (يفم، والطفرات المفضلة الخاصة بك) باستخدام معيار الموقع الموجه الطفرات (SDM) كما هو موضح سابقا26.</li>
	<li>قبل بدء تشغيل الشاشة، باككروس (على النحو الأمثل) سلالات متحولة بسلالة البرية من نوع لتنظيف الخلفية الوراثية وتوليد خلايا متحولة ولد الطازجة السلالات الأبوية. خط السلالة الأبوية إلى مستعمرات فردية على لوحات قياسية الوسائط الغنية. اختيار ثمانية إلى ستة عشر مستعمرات مستقلة (replicates البيولوجية) عشوائياً مع الطفرات المرغوبة للمقايسة قارئ لوحة (انظر 3.1). ملاحظة: هذا البروتوكول فعالة إلا عندما تكون السلالات الأبوية على نمو عيب في وسائل الإعلام السائلة (الحد الأدنى أو الغنية، مع أو دون المخدرات، أو مع تحولات درجة الحرارة التي تسبب خلل النمو). ينبغي أن تكون جميع السلالات الأبوية فرداني وهكذا قادرة على تجاوزها وراثيا مع غيرها سلالات فرداني بنوع التزاوج تكميلية.</li>
</ol>2-لوحة قارئ الإنزيم
<ol><li>مع قضيب عقيمة، تأخذ كمية صغيرة من كل من المستعمرات إعدادها في الخطوة 1، 1 (لا الضبط المبلغ اللازم لتطعيم بدءاً الثقافة) وفي ميكروسكوبية البوليستيرين 96-جيدا. تعليق كل من المستعمرات في 200 ميليلتر لوسائل الإعلام السائلة المناسبة (غنية أو الحد الأدنى، مع أو بدون المخدرات). وتشمل كذلك فارغة لكل صف على اللوحة التي تحتوي على 200 ميليلتر من نفس الوسائط (لا الخلايا).</li>
	<li>تشغيل البروتوكول التالي في برامج الكشف عن قارئ لوحة متصلة إلى قارئ ميكروسكوبية الآلي: تعيين أحد برامج حركية 24 ساعة ودرجة الحرارة عند 30 درجة مئوية، مع الهز المداري السريع المستمر (425 cpm، السعة 3 مم). تعيين القراءة الضوئية لقياس الضوء المبعثر في موجه 600nm للكثافة البصرية، وعلى ضوء قراءة من أسفل اللوحة بتواتر قراءة من 2 دقيقة (721 قراءة المجموع على مدى فترة 24-ح كل بئر).</li>
	<li>بعد 24 ساعة، سجل قراءات الكثافة البصرية استبدالها النهائي (استبدالها OD600) واستخدم الصيغة التالية لتحديد حجم الحاجة إلى تمييع كل من العينات وصولاً إلى نقلت = 0.1: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59133/59133eq1v2.jpg"> ملاحظة: تصدير البيانات من برنامج قارئ لوحة واستخدام برامج جداول بيانات لإدراج الصيغة أعلاه كدالة لدفعة عملية تمييع وحدة التخزين ليتم استخدامها من كل بئر تجريبية.</li>
	<li>كل 24 ساعة، تضعف كل من العينات باستخدام نفس الوسائط كيوم 0 إلى نقلت = 0.1 (حوالي 1.5 × 106 خلايا/مل) باستخدام الصيغة المشار إليها في الخطوة 2، 3. حفظ كل نمو منحنيات المتولدة يوميا وملاحظة أي مستعمرة الفردية التي يبين معدل نمو المتزايد، يحكم نقلت نهائية التي أعلى بكثير من بقية الفوج مع نفس الخلفية الوراثية أو منحنى نمو التي مماثلة لتلك التي البرية من نوع المستعمرات. ملاحظة: هذا الفحص عادة ما يستغرق حوالي 7-14 يوما. تنفيذ كافة الخطوات تحت ظروف معقمة.</li>
</ol>3-اختيار المستعمرات القامع وتأكيدا للنمط الظاهري.
<ol><li>من آخر يوم من مقايسة قارئ لوحة (الخطوة 2، 4)، حفظ ثقافات السائلة التي لها معدل نمو ملحوظ المستردة، يفترض أن تكتسب طفرة القامع التي يمكن أن تخفف من النمط الظاهري للطفرة الأبوية. نقل ومزج 250 ميليلتر ثقافة السائل إلى كريوتوبي التي تحتوي على 250 ميليلتر من الجلسرين 50%. فلاش تجميد الخلايا في النتروجين السائل، وحفظ السلالات في-80oC إلى أجل غير مسمى.</li>
	<li>لتأكيد أن الطفرة القامع عنصر الموروثة جينياً، استخدام طرق عبور الجينية القياسية لعبور يفم ف (للسلالة الأبوية، المستخدمة في بداية الفحص قارئ لوحة) مع يفم S (للقامع، سلالة المحفوظة في النهاية للمقايسة قارئ لوحة). إذا كانت الطفرة القامع في الواقع عنصرا وراثيا الموروثة، يفم ف × يفم S ينبغي أن تسفر عن تيترادس التي لها مستعمرات هما النمط الظاهري المرض من السلالة الأبوية والمستعمرات اثنين معدل نمو المستردة القامع سلالة.</li>
	<li>من صليب خطوة 3.2، اختيار المستعمرات الثلاث مع النمط الظاهري القامع (السلالة S) والمستعمرات الثلاث مع النمط الظاهري الأبوية (السلالة ف) من نفس الوراثية عبر (replicates البيولوجية 3 لكل منهما)، والمضي قدما في استخراج الحمض النووي الجينومي و تسلسل الخطوات أدناه. ملاحظة: الخطوات 3.2 و 3.3 يوصي بشدة، ولكن غير مطلوبة. بدلاً من ذلك، واحد نشر ثقافة السائل المستردة التي جمعت من 3.1 في المتوسط الغنية في المستعمرات واحدة، ثم عشوائياً اختيار المستعمرات الثلاث تريبليكاتيس البيولوجية لتسلسل الجينوم الجامعة دون مزيد من تأكيد الوراثية. في هذه الحالة، ينبغي أن تستخدم ثلاث تريبليكاتيس البيولوجية للسلالة الأبوية لمقارنة تسلسل الجينوم.</li>
</ol>4-الجينوم الحمض النووي استخراج وإنتاج مكتبة وتسلسلها.
<ol><li>لاستخراج الحمض النووي، وإعداد مكتبة، وتسلسلها، تختار عشوائياً ثلاثة replicates البيولوجية كل سلالة يفم ف ، ويتطابق البيولوجية ثلاث سلالات فردياً نشأت يفم S كل من الصلبان الوراثية (الخطوة 3.2) أو من اللوحات التي انتشرت للحصول على مستعمرات واحد من سلالة S (ملاحظة الخطوة 3، 3).</li>
	<li>زراعة سلالات في الثقافات 10 مل في الوسائط الغنية إلى سجل منتصف المرحلة (نقلت = 0.5 – 0.8، حول 0.75 – 1.2 × 107 خلايا/مل)، واستخدام حاضنة تهتز لتنمو الثقافات السائل عند 30 درجة مئوية مع تهتز باستمرار في 250 دورة في الدقيقة. جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 1000 x ز.</li>
	<li>تعليق الخلايا الأعلاف في 400 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي (2% X-100 تريتون، 1% الحزب الديمقراطي الصربي، كلوريد الصوديوم، 100 ملم 10 ملم تريس Cl (pH 8.0)، 1 مم Na2-يدتا)، ثم قم بإضافة 400 ميليلتر من الزجاج الخرز و 400 ميليلتر من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1. الدوامة بشدة لمدة دقيقة 2 في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إضافة ميليلتر 200 إضافية من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي والمزيج بعكس عدة مرات. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 20,000 x ز.</li>
	<li>نقل المرحلة المائية إلى أنبوب نظيف وإضافة 20 ميكروغرام من مزيج رناسي A/T1 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>إضافة وحدة تخزين متساوية من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1، وتدور لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 20,000 س ز، ثم نقل في مرحلة مائي لأنبوب نظيفة.</li>
	<li>إضافة وحدة تخزين متساوية من كلوروفورم، تخلط بعكس عدة مرات، ثم تدور لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 20,000 س ز، ثم نقل في مرحلة مائي لأنبوب نظيفة.</li>
	<li>الحمض النووي المتعجل مع مجلدين من الإيثانول 100% بالإضافة إلى 10% حجم 3 م نواك (pH 4.3) في-20 درجة مئوية على الأقل ح 2، ثم تدور لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية 000 20 شخص × ز وجمع بيليه.</li>
	<li>أغسل بيليه (سرع DNA) مرتين مع برود 70% إيثانول (أجهزة الطرد المركزي في 20,000 س ز، دقيقة 5، 4 درجة مئوية) وتعليق بيليه في 50 ميليلتر من 10 ملم تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4).</li>
	<li>استخدام الإعدادية مكتبة كيت (انظر الجدول للمواد) كل توصيات الشركة المصنعة لإعداد المكتبة تسلسل الجينوم كل. ملاحظة: نوصي بمجموعة المواد المدرجة في الجدول للمواد لأنه يسمح ببناء مكتبة الجينوم دون [بكر] تضخيم، مما يقلل من حدوث طفرات الخطأ التي تم إنشاؤها أثناء [بكر] تضخيم. وبالإضافة إلى ذلك، أثناء إعداد مكتبة الجينوم، لا تسمح الخرز إلى جافة تماما بتقصير حبة تجفيف الوقت إلى 1 – 2 دقيقة.</li>
	<li>لإمالة المعلمات أثناء إعداد المكتبة، استخدم سونيكاتور مركزة (انظر الجدول للمواد) وتعيين عامل واجب إلى 20%، ذروة السلطة إلى 175 W، مع دورات 200 لكل دفعة، ووضع التردد كاسحة في 5.5oC إلى 6 درجة مئوية ل 45 س. بدلاً من ذلك، استخدم الحمض النووي والقص نظام تشوماتين (انظر الجدول للمواد) مع الإعدادات التالية: السعة 50% في 4 درجات مئوية مع وضع النبض، 15 s s 15 وعلى إيقاف لمدة 10 دقيقة، مع مجموع وقت تجهيز 20 دقيقة.</li>
	<li>من الضروري للتعامل مع المواد الخطرة المستخدمة في هذه الخطوة بعناية. ويتشاور مع المناسبة صحائف بيانات السلامة المادية والمؤسسة الصحة البيئية ومكتب السلامة للتعامل مع نواك، الإيثانول، والكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1 وكلوروفورم.</li>
	<li>التسلسل المكتبات الجينية الناتجة عن ذلك. ينبغي أن يشمل ما يلي التسلسل الكامل ثلاث مرات على الأقل للجينوم الكامل مع القرار في مجموعة واحدة من النوكليوتيدات. ينصح انتهت لإقران التسلسل (أو أحدث التكنولوجيا).</li>
</ol>5-المعلوماتية الحيوية التحليل للتعرف على الطفرات القامع
<ol><li>إجراء تحليل المعلوماتية التركيز على التغييرات الجينية التي يتم تحديدها دائماً بين الوالدين وسلالات قمعت يفم في جميع البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة. ملاحظة: عملية إكمال خط الأنابيب ويرد أدناه وصف، ولكن، بالإضافة إلى ذلك، ترد الملفين من السيناريو باش كنص عادي، fastq_to_vcf.sh و vcfprocess.sh، كمواد تكميلية لإظهار أمثلة لسير العمل من تجهيز ما يلي إلى متغير VCF الملفات وتجهيزها وتقاطع VCF الملفات، على التوالي.</li>
	<li>تقليم قصير-يقرأ باستخدام القص (https://github.com/jbpease/shear) بعد أسطر الأوامر (جميع سائر الخيارات الافتراضية): shear.py-fq1 $FASTQ1-fq2 $FASTQ2-out1 $OUTFQ1-out2 $OUTFQ2 \ -barcodes1 $BARCODE-تروسيق-تريمكوال منصة 20:20 \ تريمبوليات-0-تريمامبيج-فيلتيرلينجث 50-فيلتيرونبيريد</li>
	<li>يقرأ الخريطة إلى v2.30 الجينوم مرجع بومبي س. التي تم الحصول عليها من بومباسي (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) استخدام التحالف v0.7.1527. استخدام سطر الأوامر التالية (كافة الأخرى الخيارات الافتراضية): التحالف mem-تي $GENOME 8 $OUTFQ1 $OUTFQ2 > $SAM1</li>
	<li>ضع ملفات المحاذاة سام عن طريق جتك خط الأنابيب أفضل الممارسات28 لاستدعاء متغير باستخدام جتك v3.629، بيكاردتولس v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard)، وسامتولس v1.3.130. استخدم أسطر الأوامر والمعلمات (جميع سائر الخيارات الافتراضية) التالية: جافا--Xmx30g--جرة picard.jar "الإدخال أدوريبلاسيريدجروبس" = $SAM1 \ إخراج = رغيد $BAMMARKED = رجلب 1 = رجبل lib01 = إيلومينا \ رجبو = رجسم $BARCODE = $SAMPLENUMBER سامتولس فيكسماتي--يا أم $BAMMARKED $BAMFIXED سامتولس فرز أم-O-o $BAMSORTED/home/peasejb/tmp-تي $BAMFIXED فهرس سامتولس $BAMSORTED جافا--Xmx30g-GenomeAnalysisTK.jar-T جرة هابلوتيبيكالير \ -ص $GENOME--أنا $BAMSORTED-genotyping_mode اكتشاف \ --stand_emit_conf 10-stand_call_conf 30-o $VCFRAW</li>
	<li>ضغط وفهرسة ملفات VCF استخدام تابيكس: $VCFRAW.vcf بجزيب $VCFRAW.vcf.gz تابيكس</li>
	<li>مقارنة ملفات VCF بين الوالدين والقامع سلالات replicates التسلسل باستخدام بكفتولس v1.3.127. استخدم أسطر الأوامر والمعلمات (كل أخرى خيارات اليسار الافتراضي) التالية: isec بكفتولس-n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \ $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list ملاحظة: هذا الأمر أسفر عن ملف ترميز مع أنماط ثنائي حيث سيكون تسلسل المتغيرات التي تظهر في الطور الأولى فقط ترميز ثنائي ك "000100"، الطور الثاني إلا بوصفها "000010"، جميع طفرات الثلاث ك "000111"، إلخ. تم إنشاء هذه الملفات لكل مجموعة من الوالدين والمسخ إجراء نسخ متماثل ملفات VCF.</li>
	<li>ترجمة ملفات قائمة تقاطع البديل جنبا إلى جنب مع اسم الملف الملحقة بكل سطر باستخدام الأمر grep يونيكس: grep "." *.list > all.list</li>
	<li>إنشاء إسناد ترافقي لقائمة البديل كاملة مع ملف التعليق التوضيحي الحالي GFF3 (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) باستخدام برنامج نصي بايثون مخصص (variant_characterize.py) لتحديد مواقع SNP متسقة في مناطق (مترادفين وغير مترادفين) وتحيلها 5 و 3 ' ونكرنا ترميز البروتين. python3 variant_characterize.py-common_variants.list قائمة \ -السينمائي schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \ -فاستا Schizosaccharomyces_pombe. ASM294v2.30.dna.genome.fa \ -نمط 000100-خارج all.list.filter.000100 كرر هذا تعديل البرنامج النصي--نمط ولاحقة لملف الإخراج (-خارج) استخدام الثنائي أنماط: 000010، 000001، 000110، 000011، 000101، و 000111</li>
	<li>الجمع بين الإخراج من جميع هذه تشغيل البرنامج النصي في ملف مفصولة بعلامات جدولة، ليتم عرضه كجدول بيانات. يتضمن الجدول مشروحة من المتغيرات تلك التي تظهر في أحد أو كلا strain(s) متحولة بالنسبة للخلفية. ميدان العلم ثنائي يدل أما المظهر في سلالة متحولة واحدة (000100, 000010, 000001)، اثنين من سلالات متحولة (000011, 000101, 000110)، أو جميع سلالات متحولة الثلاثة (000111).</li>
	<li>تحليل القوائم إخراج المشروح من المتغيرات غير موجود في عينات الأبوية، ولكن وجدت في واحد أو اثنين أو كل ثلاث عينات المسخ. التعليق التوضيحي ترمز إلى كل موقع جينومي وفئة من البديل (مرادف/غير-مرادفة في منطقة ترميز، 3/5 ' UTR، غير الترميز، إلخ.). من هذه القائمة من الطفرات المرشح، قد يكون مثالاً للمرشحين بقوة ذات الصلة متغير غير مترادفين ترميز التي تظهر دائماً في كل ثلاث سلالات. نوع آخر من المرشح القوى سيكون تراكم الطفرات سلالات متحولة الظهور قريبة من بعضها البعض أو داخل نفس الجين التنظيمية المختلفة غير مترادفين أو المفترضة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McKay, J. K., Latta, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+population+divergence:+Markers,+QTL+and+traits.">Adaptive population divergence: Markers, QTL and traits.</a> Trends in Ecology and Evolution. 17 (6), 285-291 (2002).</li><li>Wood, V., Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PomBase:+A+comprehensive+online+resource+for+fission+yeast.">PomBase: A comprehensive online resource for fission yeast.</a> Nucleic Acids Research. 40 (D1), (2012).</li><li>de Visser, J. A. G. M., Cooper, T. F., Elena, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+causes+of+epistasis.">The causes of epistasis.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1725), 3617-3624 (2011).</li><li>Sailer, Z. R., Harms, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+high-order+epistasis+in+nonlinear+genotype-phenotype+maps.">Detecting high-order epistasis in nonlinear genotype-phenotype maps.</a> Genetics. 205 (3), 107911088 (2017).</li><li>Kuzmin, E., Costanzo, M., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+arrays:+Automation+of+yeast+genetics.">Synthetic genetic arrays: Automation of yeast genetics.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 326-332 (2016).</li><li>Tong, A. H. Y., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 313 (1), 171-192 (2006).</li><li>Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Mapping+of+Genetic+Interaction+Networks.">Systematic Mapping of Genetic Interaction Networks.</a> Annual Review of Genetics. 43 (1), 601-625 (2009).</li><li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast.">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).</li><li>Bai, X., Yang, Z., Jiang, H., Lin, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+suppressor+screens+in+haploids.">Genetic suppressor screens in haploids.</a> Methods in Cell Biology. , 129-136 (2011).</li><li>Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+suppression+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions+in+bacteria.">Allele-specific suppression as a tool to study protein-protein interactions in bacteria.</a> Methods. 20 (1), 18-34 (2000).</li><li>Motter, A. E., Gulbahce, N., Almaas, E., Barab&#225;si, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+rescues+in+metabolic+networks.">Predicting synthetic rescues in metabolic networks.</a> Molecular Systems Biology. 4, 168 (2008).</li><li>Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation.">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 595-599 (2004).</li><li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, S. C., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease.">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nature Genetics. 37 (5), 526-531 (2005).</li><li>Forsburg, S. L., Patton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens.">The art and design of genetic screens.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).</li><li>Johnston, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens.">The art and design of genetic screens.</a> Genetics. 3 (March), 176-188 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Caenorhabditis+elegans.">The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).</li><li>Gocke, E., M&#252;ller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+studies+in+the+mouse+to+define+a+threshold+for+the+genotoxicity+of+EMS+and+ENU.">In vivo studies in the mouse to define a threshold for the genotoxicity of EMS and ENU.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 678 (2), 101-107 (2009).</li><li>Suzuki, T., Hayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+genotoxicity+of+ethylnitrosourea+and+ethyl+methanesulfonate+in+lacZ+transgenic+mice+(Muta(TM)Mouse).">A comparison of the genotoxicity of ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta(TM)Mouse).</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 395 (1), 75-82 (1997).</li><li>Uttam, J., Alberico, C., De Stasio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU+Mutagenesis.">ENU Mutagenesis.</a> International C. elegans Meeting. , (1995).</li><li>Putrament, A., Baranowska, H., Ejchart, A., Prazmo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Mutagenesis+in+Yeast.">Manganese Mutagenesis in Yeast.</a> Methods in Cell Biology. 20, 25-34 (1978).</li><li>Bose, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+UV+mutagenesis.">Chemical and UV mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 111-115 (2016).</li><li>Ikehata, H., Ono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+of+UV+Mutagenesis.">The Mechanisms of UV Mutagenesis.</a> Journal of Radiation Research. 52 (2), 115-125 (2011).</li><li>Shrivastav, N., Li, D., Essigmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+of+mutagenesis+and+DNA+repair:+cellular+responses+to+DNA+alkylation.">Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation.</a> Carcinogenesis. 31 (1), 59-70 (2010).</li><li>De Stasio, E. A., Dorman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+ENU+mutagenesis+of+Caenorhabditis+elegans.">Optimization of ENU mutagenesis of Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 495 (1-2), 81-88 (2001).</li><li>Probst, F. J., Justice, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mutagenesis+with+the+chemical+supermutagen+ENU.">Mouse mutagenesis with the chemical supermutagen ENU.</a> Methods in Enzymology. 477 (C), 297-312 (2010).</li><li>B&#228;hler, J., Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows+&#8211;+Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows &#8211; Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fastQ+data+to+high-confidence+variant+calls:+The+genome+analysis+toolkit+best+practices+pipeline.">From fastQ data to high-confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 43, (2013).</li><li>Mckenna, A., Hanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+A+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Research. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Marayati, B. F., Drayton, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Elongation-Like+Factor+1+Spontaneously+Induces+Diverse,+RNase+H-Related+Suppressor+Mutations+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Loss of Elongation-Like Factor 1 Spontaneously Induces Diverse, RNase H-Related Suppressor Mutations in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genetics. 209 (4), 967-981 (2018).</li><li>Harris, M. A., Lock, A., B&#228;hler, J., Oliver, S. G., Wood, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FYPO:+The+fission+yeast+phenotype+ontology.">FYPO: The fission yeast phenotype ontology.</a> Bioinformatics. 29 (13), 1671-1678 (2013).</li><li>Xu, X., Wang, L., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Genome+Sequencing+of+Suppressor+DNA+Mixtures+Identifies+Pathways+That+Compensate+for+Chromosome+Segregation+Defects+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Whole-Genome Sequencing of Suppressor DNA Mixtures Identifies Pathways That Compensate for Chromosome Segregation Defects in Schizosaccharomyces pombe.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (3), 1031-1038 (2018).</li><li>Marayati, B. F., Hoskins, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fission+yeast+MTREC+and+EJC+orthologs+ensure+the+maturation+of+meiotic+transcripts+during+meiosis.">The fission yeast MTREC and EJC orthologs ensure the maturation of meiotic transcripts during meiosis.</a> RNA. 22 (9), 1349-1359 (2016).</li></ol>

الكتاب يعلن لا موافقات من قبل الشركات المصنعة للأدوات المستخدمة في هذا الأسلوب، ولا تضارب المصالح المالية.

البروتوكول هو موضح هنا يمثل الرواية وشاشة بسيطة للطفرات العفوية القامع لا يمكن اكتشافها من خلال استرداد المظهرية من الطفرات التي تخول النمو البطيء في انشطار الخميرة، النمط الظاهري مميزة لما يزيد على 400 الجينات في بومبي س.، الدالة للكثير منها ما زال غير معروف2،32. الأساليب السابقة اتخذت نهج أخرى للشاشة للطفرات القامع في الكائنات الحية الدقيقة، بما في ذلك استخدام والمطفرات21، أو تطبيق درجة حرارة التحول في الخلفيات متحولة حساسة لدرجة الحرارة33. وفي المقابل، يظهر هذا البروتوكول أن الانتعاش المظهرية يحدث دون تدخل البيئية الكيميائية الإضافية، ويسلط الضوء على اللياقة البدنية وميزة ظهور الطفرات قمع الاستيلاء في نهاية المطاف على الموارد المتاحة في السائل الثقافة. تسمح هذه الشاشة عزلة المكثفات تجاوز أو المكثفات التفاعل لأنها فعالة بالنسبة لكل الطفرات الخسارة من دالة مثل elf1∆ أو fal1∆ والطفرات مثل clr6-1، ما دام ذلك طفرات إظهار عيوب اللياقة البدنية في ثقافة السائل.
حتى الآن، أظهرت جميع سلالات S المستردة التي كنا قد حققت درجات متفاوتة من الانتعاش المظهرية. كما كشف عن طريق معبر الوراثية، النمط الظاهري المستردة يعزى إلى عنصر واحد وراثية والموروثة (الأمثلة هو مبين في الشكل 2). هذا هو واحد من أهم مزايا هذا الأسلوب مقارنة بالشاشات القامع المستندة إلى المادة الكيميائية أو المستندة إلى الأشعة فوق البنفسجية، التي كثيرا ما تستهدف المكاني الجينوم متعددة. ومن الشائع لمراقبة واحد أو اثنين من المستعمرات استردادها من أصل 16 المستعمرات/سلالة (حوالي 10%) في غضون أسبوع واحد. ومع ذلك، نحن فعلت إشعار التقيد بطفرات معينة، مثل فقدان الوظيفة Rrp6، فرعية اكسوسومي النووية الخاصة، تسترد ابدأ إلى معدل النمو تقريبا البرية من نوع في الخلايا elf1Δ 31. ومن المرجح أن وظيفة Rrp6 يمكن فقط الحصول على تعويض جزئي من المكثفات، خلافا لوظيفة أخرى طفرات اختبارها، بما في ذلك fal1∆، التي تبين أن يسبب عيب هو الالتهاب من خلال وظيفة هامة في تنظيم الربط34. ونحن نعتقد أن القامع البديلة فحص أساليب ستكون خاضعة لنفس المشكلة عندما يفج أدوار فريدة من نوعها، وعدم الاستبدال في نمو الخلايا.
قبل تنفيذ تسلسل الجينوم، الأمثل الخلف عبر المستعمرات phenotypically المستردة، حددت من اللوحة-القارئ، ومع الضغوط الوالدية لمسح الخلفية الوراثية والحصول على replicates البيولوجية. وباﻹضافة إلى ذلك، يحدد تسلسل العميق الجامع-الجينوم مئات التغييرات النوكليوتيدات واحدة، معظمها ليست متطابقة بين replicates البيولوجية التي تحظى باهتمام ضئيل للفحص. على سبيل المثال، وجدنا ما مجموعة 660 التعديلات الجينية عبر جميع الكروموسومات ثلاثة بين اثنين elf1Δ ف وخمس سلالات S مختلفة (الشكل 3). ونحن لم عادة يلاحظ الطفرات متماثلة بين التسلسل البيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة لكل سلالة، مما يوحي بأن الطفرات الجديدة قد تنشأ خلال استزراع الخلايا elf1Δ قبل بناء مكتبة الجينوم أو قد تكون أخطاء عشوائية وعرض خلال بناء مكتبة وتسلسلها. ومن ثم عزل الطفرات التي تتسق عبر replicates البيولوجية جانبا مهما في تحديد المكثفات باستخدام تسلسل الجينوم كل نجاح.
حددنا وأكد المكثفات اثنين في مناطق الأقراص المدمجة في خمس سلالات S متسلسلة. على الرغم من أن تم الكشف عن الطفرات في SPBPJ4664.02 في S-A1 و S A2 سلالات، أنه من المستبعد أن SPBPJ4664.02 هو القامع صالحة لأن S-A1 و S A2 لا تتضمن القامع في نفس الجين كما أنها ليست متكاملة مع بعضها البعض ( البيانات لا تظهر). ونحن أيضا لم تؤكد rli1 في S-A3، وعدم فصل يشترك مع النمط الظاهري S عندما باككروسيد مع elf1Δ. وبدلاً من ذلك، وجدنا طفرات محددة في مناطق غير الترميز S-A1, S-A2 و S-A3. فمن الممكن أن هذه المناطق الجينوم غيرت الترميز غير التخفيف من النمط الظاهري elf1Δ ، التي سيجري تناولها في دراساتنا المستقبلية. مقارنة بالطرق التقليدية مثل مقايسة ربط، الذي قد يستغرق سنوات لخريطة طفرة جينية، حددنا المكثفات اثنين خلال شهرين بعد التأكد من أن عنصر مونوجينيك بسبب النمط الظاهري S. مع التطور السريع للتكنولوجيا تسلسل الجينوم كلياً، نحن متفائلون بأن هذا الأسلوب سوف تكون أكثر فعالية لتحديد الطفرات الوراثية متسقة في المستقبل المنظور.
وباختصار، يوفر هذا البروتوكول توجيهات خطوة بخطوة لتحديد الطفرات القامع لأي الجينات للفائدة مع وجود خلل النمو البطيء في ثقافة السائل بنجاح. البساطة من هذا الفحص يسمح بفحص واسعة النطاق متعددة الخلفيات الوراثية للفائدة مع القليل من التدريب العملي. هناك مجال زيادة أتمتة العملية باستخدام روبوت مناولة سائل لإجراء تخفيف اليومية. منذ التلاعب مختبر الكائنات الدقيقة يتطلب حتما النمو في الثقافة السائل، وهي عملية التي من طبيعتها انتقائية للياقة البدنية، فإننا نقترح أن هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على نطاق واسع للكائنات نموذج السكانية الكبيرة الأخرى مثل البكتيريا و أنواع أخرى من الخميرة.

الأساس لفهم الصلات الوظيفية بين الجينات يعتمد على القدرة على تحديد الآليات الجزيئية التي تتباعد المعقدة الصفات الوراثية لإنتاج متنوعة تعمل1. في انشطار الخميرة، بومبي شيزوساكتشاروميسيس (S. بومبي)، غالبية الجينات ترميز البروتين يمكن الاستغناء عنها لبقاء2. ولا يتكلم هذه النتيجة إلى أونيمبورتانسي من هذه الجينات، ولكن بدلاً من ذلك إلى الآليات التعويضية المعقدة الكامنة وراء الممرات البيوكيميائية التي تنتمي إليها تلك الجينات. تشريح هذه الآليات التعويضية قد ولدت خرائط ابيستاسيس، والتي كشفت عن التفاعلات الجينية شاملة وتوسيع فهمنا لمسارات وظيفية البيوكيميائية3،4.
وقد وضعت أساليب الفائق (مثلاً، تحليل "صفيف الجينية الاصطناعية"، أو SGA) لتحديد التفاعلات الوراثية الجينوم على نطاق المنظومة في مهدها الخميرة، وقد توسعت للاستخدام في انشطار الخميرة5،6. مثل هذا النهج كثيرا ما تعتمد على مكتبة سلالات تحتوي على كل واحد ترميز البروتين مجدية الجينات الحذف (طفرات الحذف فرداني حوالي 3,300 تغطي أكثر من 92% جينوم الخميرة الأنشطار)، وتتطلب ذراع إليه لأداء الصلبان الوراثية بين سلالة من الفائدة وجميع سلالات الممكنة في library6. علاوة على ذلك، SGA تقنيات تعتمد على قدرة سلالات المكتبة أن يكون التزاوج سليمة وفعالة، وتتميز النمط الظاهري الذي حاليا غير طبيعي إلى 444 الجينات في بومبي س.2.
وعلى الرغم من تعقيد التفاعلات الجينية، مقارنة النمط الظاهري من سلالة تحمل طفرات في اثنين من الجينات للنمط الظاهري سلالات اثنين تحمل الطفرات الفردية لكل الجينات يمكن أن يكون واحداً من اثنين من النتائج الجديرة بالذكر: 1) النمط الظاهري متحولة مزدوجة أسوأ من تعمل الأبوية المضاعف المتوقع في شكل مرض، أو في الحالة الأكثر تطرفاً، القدرة على الفتك. هذا يشار إلى وجود تفاعل وراثية سلبية، وهو علامة على أن تتصرف اثنين من الجينات في مسارات بيولوجية موازية عموما. 2) النمط الظاهري متحولة مزدوج أفضل من الجمع بين الوالدين تعمل، المعروف أيضا تفاعل إيجابي وراثية المتوقعة. تفاعل إيجابي وراثية مثيرة للاهتمام لا سيما لأنها تشير إلى أن هذه الجينات تعمل في نفس العملية. اثنين من الجينات التفاعل إيجابيا علاقات محتملة ثلاثة: مورثة متحولة قد تصل-تنظيم التعبير عن الجينات الأخرى في مسار مواز، قد تعمل اثنين من الجينات في الحفل ضمن المسار نفس المصب من بعضها البعض، أو ترميز الجينات اثنين البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع بعضها البعض. ولذلك، يمكن استخدام التفاعلات الجينية الإيجابية لخريطة الجينات العقد التنظيمي وتصنيف الجينات أونتشاراكتيريزيد في المسارات البيوكيميائية7،8.
القامع هو الطفرات التي يمكن أن تخفف من النمط الظاهري المرض من تحور الجين آخر، عادة ما تمثل وراثية تفاعل إيجابي بين9،اثنين من الجينات10. وتعرف الطفرات القامع على موضع مختلف عن الطفرة أنها قمع المكثفات اكستراجينيك. وذات قيمة خاصة في دراسة الطفرات الوراثية غير قادر على الاستمرار بإنقاذ صناعيا الفتاكة النمط الظاهري (يعرف أيضا باسم تأثير لازاروس)11. كما أن لها تطبيقات علاجية محتملة في علاج الأمراض الوراثية12،13.
لكل هذه الأسباب، تم تحديد الطفرات القامع في مختلف نموذج الكائنات تستخدم على نطاق واسع لتسهيل فهمنا لمختلف المسارات البيوكيميائية14،،من1516. فحص المكثفات يستند عادة على النمط الظاهري للطفرة في السؤال، ويتطلب إجراء الطفرات العشوائية لعزل الطفرات التي من شأنه أن يخفف النمط الظاهري. وقد أنشأت تقريبا كل نموذج الكائنات أساليب الطفرات العشوائية. على سبيل المثال، N-إيثيل-ن-نيتروسوريا (ENU) واثيلميثانيسولفوناتي (EMS)، والمطفرات اثنين التي هي قادرة على استحثاث الطفرات في الحمض النووي، وهي تستخدم على نطاق واسع في نماذج مختلفة من البكتيريا للفئران17،،من1819 . وباﻹضافة إلى ذلك، كلوريد المنغنيز طالما استخدمت في الخمائر لقدرة الموجبة المنغنيز تمنع الحمض النووي إصلاح مسارات20. نهج مشترك آخر هو الطفرات المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية، الذي يولد على نطاق الجينوم مطفرة بيريميدين dimers21،22.
على الرغم من أن قد تم استغلال الطفرات الكيميائية التعرف على الطفرات القامع شعبية، الأسلوب يحتوي على العديد من العوائق، بما في ذلك استخدام المواد الكيميائية الخطرة ومعدلات نجاح عالية المتغير، والأخذ بالمتغيرات التباس إضافية وعرض الآثار الجانبية السلبية مطفر في العمليات الخلوية متعددة،من2324. بالإضافة إلى ذلك، يدفع الطفرات الكيميائية غالباً متعددة الطفرات في الجينوم الذي يضيف إلى تعقيد استخدام الوراثية وتقنيات التسلسل لتحديد الطفرة الدقيقة التي تمنح النمط الظاهري القامع في الكائن الحي25.
لمعالجة أوجه قصور النهج الطفرات الحالية، نقدم طريقة إلى الشاشة للطفرات العفوية القامع في انشطار الخميرة التي لا تعتمد على أي المطفرة أو مكتبة حذف. الأسلوب الذي يعزل المكثفات من خلال مقايسة تحديد إيجابي. يستند مبدأ هذا الأسلوب ميزة النمو يتدنى القامع تحور في الثقافة السائلة، التي يمكن رصدها بقارئ لوحة الآلي. التزاوج والانقسام الاختزالي تستخدم فقط إذا كان أحد يود أن تنظيف الخلفية الجينية أو تأكيد وجود الآليلات monogenic المكثفات قبل تسلسل الجينوم كلياً. النمط الظاهري القامع إذا كان النمط الظاهري قمع سببه طفرة واحدة، سيتم فصل 2:2 بعد باككروسينج مع السلالات الأبوية. يمكن ثم تحديد الطفرات القامع استخدام تسلسل الجينوم كلياً. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب الواجب التطبيق لفحص المكثفات في جميع الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تنمو لعدد كبير من سكان في ثقافة السائل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine, Powder</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147441000</td>
			<td>Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriology Petri Dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>C351029</td>
			<td>100&#215;15mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous, Powder</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-1</td>
			<td>Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar, Granuated</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>214530</td>
			<td>Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris Inc.</td>
			<td>S220</td>
			<td>Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Collection and Analysis Software</td>
			<td>Biotek, Inc.</td>
			<td>GEN5SECURE</td>
			<td>Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid 1N, Liquid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SA48-4</td>
			<td>Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Rich Media (liquid YEA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek, Inc.</td>
			<td>BTH1MG</td>
			<td>Or equivalent, must read visible light at 600nm wavelength range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rich Media agar plates (YEA plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A/T1 mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0551</td>
			<td>Use according to manufacturer recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Polystyrene Inoculating Loop</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>OS101</td>
			<td>Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile workspace and burners</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>C353072</td>
			<td>Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina, Inc.</td>
			<td>20015962</td>
			<td>Use to prepare the whole-genome sequencing library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract, Powder</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a deep-sequencing-assisted, spontaneous suppressor screen in the fission yeast schizosaccharomyces pombe

شاشة وراثية للمسخ الآليلات التي تقمع المظهرية العيوب الناجمة عن طفرة هو نهج قوية لتحديد الجينات التي تنتمي إلى المسارات البيوكيميائية ارتباطاً وثيقا. الأساليب السابقة مثل تحليل صفيف الجينية الاصطناعية (SGA)، وتقنيات الطفرات العشوائية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو المواد الكيميائية مثل إيثيل ميثانيسولفوناتي (EMS) أو N-إيثيل-ن-نيتروسوريا (ENU)، وقد استخدمت على نطاق واسع ولكن غالباً ما تكون مكلفة و شاقة. أيضا، هذه الأساليب المستندة إلى مطفر الفرز كثيرا ما يرتبط مع آثار جانبية حادة في الكائن الحي، وحمل العديد من الطفرات التي إضافة إلى الطابع المعقد لعزل المكثفات. نقدم هنا، بروتوكول بسيطة وفعالة للتعرف على الطفرات القامع في طفرات الذي يضفي على وجود خلل نمو في بومبي شيزوساكتشاروميسيس. يمكن رصد اللياقة البدنية للخلايا مع نقص نمو في وسائل الإعلام السائلة الغنية القياسية أو وسائل الإعلام السائلة الاصطناعية للاسترداد باستخدام قارئ الآلي 96-كذلك لوحة لفترة طويلة. وبمجرد خلية يكتسب طفرة القامع في الثقافة، توابعه أووتكومبيتي تلك الخلايا الأبوية. يمكن عزل الخلايا المستردة التي تتمتع بميزة تنافسية نمو عبر الخلايا الأبوية وباككروسيد مع الخلايا الأبوية. ثم تحديد الطفرات القامع استخدام تسلسل الجينوم كلياً. باستخدام هذا النهج، نحن قد عزلت بنجاح المكثفات المتعددة التي تخفف من عيوب النمو الحاد الناجم عن فقدان Elf1، أأأ أسرة ATPase أن المهم في النقل النووي مرناً وصون الاستقرار المجيني. هناك حاليا أكثر 400 الجينات في بومبي س. مع طفرات منح خلل نمو. كما أن العديد من هذه الجينات أونتشاراكتيريزيد، فإننا نقترح أن لدينا أسلوب سوف يعجل تحديد التفاعلات الوظيفية الرواية مع هذا النهج سهلة الاستعمال، والفائق.

تظهر طفرات النمو البطيء الانتعاش المظهرية في ثقافة السائل اخترنا ثلاث طفرات تشارك في مجموعة متنوعة من المسارات البيولوجية مع النمط الظاهري والمرضى، وبطيئة النمو،: AAA الأسرة ATPase Elf1، Deacetylase Clr6 هيستون واكسون تقاطع معقدة المكون Fal1. كانت السنة اللهب أثناء سلالة البرية من نوع وسلالات تحمل طفرات الجينات الثلاثة هذه التي قد تم باككروسيد مع السلالات البرية من نوع إلى مستعمرات فردية، ومستعمرات واحدة 16 اختيرت عشوائياً لتكون مثقف في الوسائط السائلة الغنية باستخدام لوحة 96-جيدا الموصوفة أعلاه. وسجلت منحنيات نمو المستعمرات الفردية في النقطة الزمنية الأولى (يوم 0) و لمدة 6 أيام مع الرصد المستمر باستخدام قارئ لوحة. كما هو متوقع، تظهر المستعمرات البرية من نوع لا تغييرات ملحوظة في منحنيات النمو بهم طوال التجربة31 (الشكل 1). جدير بالذكر أن أربع مستعمرات مع الخلفية elf1∆ وواحد fal1∆ مستعمرة تظهر تحولاً مثيرا في النمو من النمو البطيء لبعض مستويات متفاوتة من النمو مماثلة أو قريبة من مستعمرات البرية من نوع. جذريا، إظهار جميع clr6-1 طفرات انتعاش المظهرية متسقة، تنمو بمعدل أسرع في نهاية المقايسة31 (الشكل 1). تميز تعمل مختلف، نشير إلى السلالات الأصلية التي بطيئة النمو مثل "سلالات ف" (أو السلالات الأبوية) وعلى سلالات عرض الاسترداد المظهرية "S سلالات" (أو سلالات قمعت). يرجى ملاحظة أن الرقم 1 هو مثال لجولة واحدة من تجربة الفرز، ولا تمثل المكثفات غير مكملة الإجمالية المحددة والتسلسل في النتائج التمثيلية التالية.
ويعزى الانتعاش المظهرية إلى السمات الموروثة يمكن أن تنمو بومبي س. فرداني في الوسائط الغنية، ولكن اثنين من السلالات فرداني مع رفيقه أنواع التزاوج التكميلية تحت المجاعة النيتروجين. الانقسام في انشطار الخميرة يستتبع جولة ازدواجية متبوعاً بجولتين من انقسام الخلية. نتائج دورة الجنسي في تشكيل أربعة جراثيم فرداني تحمل المادة الوراثية للسلالة الأبوية مع الفصل 2:2 من الصفات الوراثية التقيد بقواعد علم الوراثة مندلية الكلاسيكي (الشكل 2A). ونحن عندما نمت على نفس اللوحة لنفس المقدار من الوقت، أكد الفصل 2:2 عند كل معبر العودة قمعت سلالات (سلالات S) مع على السلالات الأبوية (سلالات ف)، مما أسفر عن 2 صغيرة (خلل النمو) و 2 كبيرة (القامع النمط الظاهري) المستعمرات. تظهر الأمثلة الفردية للخلايا elf1∆و clr6-1 و fal1∆ قمعت في الشكل 2. وقد أكدنا أن جميع سلالات S المعزولة تحمل عنصر monogenic الجينية الذي يقمع النمط الظاهري بطيئة النمو على سلالات ف (البيانات لا تظهر).
يحدد تسلسل الجينوم الجامعة بنجاح الطفرات القامع كمثال على ذلك، قمنا باستخدام تسلسل الجينوم كله نهاية الاقتران لتحديد العناصر الوراثية المسؤولة عن استرداد المظهرية في سلالات elf1∆ S . هو وصف أكثر اكتمالا لتحليل البيانات المتاحة على الإنترنت31. بإيجاز، استخدمنا تريبليكاتيس البيولوجية لاثنين من سلالات ف elf1∆ الذي تم إنشاؤه بشكل مستقل والتكرارات البيولوجية من خمس مجموعات غير متكاملة من سلالات elf1∆ S ، كل منها يحتوي على المكثفات مختلفة. بعد أن حصلنا على قائمة بالمتغيرات المشروح من تحليل المعلومات البيولوجية (6.1-10)، ونحن الأولوية لفئات معينة من المتغيرات ذات الصلة بتحليلنا. وركزنا على الكشف عن التغيرات الجينية متسقة أن كانت متطابقة في جميع replicates البيولوجية الفردية سلالات elf1∆ S مقارنة سلالات ف elf1∆ الأبوية (الشكل 3 و تكميلية الجداول 1-4 ). وقد حددنا خمسة تغييرات نونسينونيموس في مناطق الأقراص المدمجة في جميع سلالات elf1∆ S مختلفة الخمس، بما في ذلك rli1 +، SPBPJ4664.02، cue2 + و rpl2702 +. S-A1 و S A2 تتضمن تحور SPBPJ4664.02، على الرغم من الطفرات تحدث في الأحماض الأمينية المختلفة. لأن SPBPJ4664.02 جين طويلة (11,916 النيوكليوتيدات) مع مئات يكرر، الطفرات لم يتمكنوا من تأكيد إجراء PCR متبوعاً بالتسلسل. S-A3 تحتوي على متحولة حذف في rli1 الذي يتسق في كل التكرارات البيولوجية. بيد المسخ لا يشترك فصل مع النمط الظاهري S في الخلفية elf1∆ . وقد حددنا متحولة cue2 (cue2-1) في S-B1، مع الأحماض الأمينية 396-400 في عداد المفقودين. S-B2 يحتوي على المسخ rpl2702 (rpl2702-1)، مما يؤدي إلى تغيير الأحماض الأمينية في موقف 45 من جليكاين إلى اسبارتاتي31. وتأكدت cue2-1 و rpl2702-1 المكثفات elf1∆ كما هو موضح أدناه.
يقوم بالتحقق من تأكيد القامع تحديد الطفرات الوراثية التوريث من النمط الظاهري الانتعاش اثنين من التغييرات المحددة نونسينونيموس، cue2-1 و rpl2702-1، أعيد في المختبر باستخدام البروتوكولات القياسية للطفرات الموجهة من الموقع. سلالات متحولة مزدوجة cue2-1 ف elf1∆ و rpl2702-1 ف elf1∆ وقد عبرت على المجاملة ف elf1∆ سلالة31 (الشكل 4). إذا الطفرات نونسينونيموس، يتم تحديدها من خلال هذه الشاشة، كانت كافية لقمع ف elf1∆، ثم tetrads الناتجة سوف تظهر 2:2 الصغيرة بنسبة كبيرة في المستعمرات الناتجة عن جراثيم 4 في كل تتراد. وفي الواقع، أظهرت العبور الوراثي أن الطفرات القامع المحددة هي النجاح في القضاء النمط الظاهري بطيئة النمو ف elf1∆ والموروثة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig1v2.jpg"> رقم 1: يمكن رصد المظهرية الانتعاش عن طريق تسجيل منحنيات النمو في قارئ لوحة. ووضعت ستة عشر مستعمرات واحدة البرية من نوع (WT)، elf1∆، clr6-1، و fal1∆ في صفيحة 96-جيدا. وسجلت منحنيات النمو على مدى فترة 24-ح والمستعمرات كانت إعادة المخفف يوميا في وسائل الإعلام الغنية. ويتضح خلل النمو بامتصاص منخفضة (نقلت) في نهاية فترة 24 ساعة في اليوم 0. سلالات phenotypically المستردة هي تلك التي عرض منحنى نمو مماثل، أو بالقرب منها، التي من نوع البرية على مدى فترة 24-ح في يوم 6. وأظهرت أربع مستعمرات elf1∆ومستعمرة واحدة من fal1∆، وجميع المستعمرات clr6- 1 مستويات مختلفة من استرداد المظهرية بعد 6 أيام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig1v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig2v2.jpg"> رقم 2: عبور الوراثية يمكن تأكيد أن الانتعاش المظهرية يعزى إلى اليل الموروثة واحد. (أ) عند انشطار الخميرة الخلايا تتعرض للمجاعة النيتروجين، خليتين فرداني بنوع التزاوج تكميلية يمكن أن تولد من الزيجوت الذي سبورولاتيس لتوليد tetrad الأبواغ 4. سيتم عزل المواد الوراثية الوالدين أثناء الانقسام الاختزالي التقيد بقواعد الوراثة مندلية. (ب) فينوتيبيكالي استرداد المستعمرات (S المسمى، لقمعها) مع ذكر الأنماط الجينية الأبوية قد عبرت مرة أخرى مع مستعمرتهم الأبوية مجاني (الذي يظهر لا انتعاش المظهرية، المسمى ف، للوالدين). الوراثية الصلبان عرض 2:2 صغيرة (ضعف اللياقة البدنية) إلى مستعمرات كبيرة (اللياقة البدنية المستردة) إثبات أن الانتعاش المظهرية الموروثة ويمكن أن يعزى إلى عنصر وراثية واحد. مربعات حمراء مستعمرات تحمل اليل القامع، ومربعات زرقاء مستعمرات تحمل اليل الأبوية. لقد تم تعديل هذا الرقم من ماراياتي et al., 201831. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig3v2.jpg"> رقم 3: تحليل البيانات تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة لتحديد العناصر الجينية المسؤولة عن استرداد المظهرية. يتطابق البيولوجية ثلاث سلالات "P" الأبوية اثنين (فا وب ف)، وتحولت replicates البيولوجي اثنين من خمسة phenotypically تعافي سلالات "S" (S-A1 و S A2 S-A3 استردادها من فا؛ S-B1 و S-B2 من فب)، تم تعيين تسلسل والطفرات نظمت كقائمة لكل طفرة في سلالة المستردة بالمقارنة مع أن الجينوم السلالة الأبوية أنها مستمدة من (مثلاً، با مقابل S-A1، إلخ.). وكان العدد الإجمالي للكشف عن الطفرات عبر الجينوم الكامل لجميع هذه المقارنات العشوائية 660. تم تحديد ما مجموعة 44 الطفرات عندما اختيرت فقط الطفرات التي تحدث في كلا replicates البيولوجية من نفس السلالة "S". من أصل 44 الطفرات، كانت الطفرات 12 الإدراج/الحذف (إينديل) أو الطفرات غير مترادفين. من أصل 12 إينديل أو الطفرات غير مترادفين، حدثت خمس حالات في البروتين الترميز تسلسل. التحولات الخمسة يحتمل أن ترتبط بعنصر واحد الوراثية المسؤولة عن سلالات phenotypically المستردة: طفرة غير مترادفين في SPBPJ4664.02 وجدت في S-A1 و S-A2، العثور على إينديل في rli1 في S-A3، إينديل في cue2 الموجودة في S-B1، والطفرات غير مترادفين في rpl2702 الموجودة في S-B2. يتم تضمين معلومات تسلسل مفصل عن الطفرات والخلفية التي تمت تصفيتها في تكميلية الجداول 1-4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig4v2.jpg"> الشكل 4: تأكيد للمكثفات يتم تحديدها من خلال تسلسل الجينوم الجامعة. تأكدت النتائج من تسلسل الجينوم كلياً بتوليد الطفرات بشكل مستقل وأداء تقاطع الوراثية للتأكد من استرداد المظهرية طريق عبور سلالة elf1∆ cue2-1 مع سلالة ف elf1∆ ، و elf1∆ rpl2702-1 مع سلالة elf1∆ ف . تظهر ثلاثة tetrads الرأسي الممثل. مربعات حمراء هي المستعمرات مزدوجة--المسخ (elf1 cue2-1، أو elf1 rpl2702-1)؛ مربعات زرقاء هي المستعمرات elf1∆ . لقد تم تعديل هذا الرقم من ماراياتي et al., 201831. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig4v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
تكميلية الجدول 1- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a> 
تكميلية الجدول 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a> 
3 الجدول الإضافي . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a> 
تكميلية الجدول 4 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_4.xlsx" target="_blank">اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a> 
ترميز ملفات تكميلية . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">اضغط هنا لتحميل الملفات.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe at JoVE.com

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

نقدم بروتوكول شاشة القامع بسيطة في انشطار الخميرة. يعد هذا الأسلوب كفاءة خالية مطفر والانتقائي للطفرات التي غالباً ما تحدث في موضع الجينوم واحد.  البروتوكول مناسبة لعزل المكثفات التي تخفف من عيوب النمو في الثقافة السائلة التي تنتج عن طفرة أو دواء.

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

يصف هذا البروتوكول شاشة القامع بسيطة وفعالة لتحديد الطفرات القامع في المسوخ التي لها عيب في النمو في الخميرة الانشطارية. تستخدم طرق الطفرات التقليدية المواد الكيميائية السامة أو الأشعة فوق البنفسجية التي يمكن أن تولد طفرات متعددة في الخلية. على العكس من ذلك، يمكن لهذا البروتوكول إثراء متحولة القامع واحد في الخلايا الفردية دون استخدام الأساليب المحفزة للطفرات.ابدأ هذا الإجراء مع بناء السلالات والإعداد كما هو موضح في بروتوكول النص. إضافة 200 ميكرولترات من وسائل الإعلام السائلة إلى كل بئر من 96 بئر البوليسترين microplate. مع قضيب عقيم ، خذ كمية صغيرة من كل من المستعمرات المعدة وتعليق كل مستعمرة في آبار فردية تحتوي على الوسائط السائلة.وتشمل بئر فارغة لكل صف على لوحة تحتوي على 200 ميكرولترات من نفس وسائل الإعلام. الآن إعداد البروتوكول على قارئ لوحة الكشف عن البرمجيات المتصلة قارئ microplate الآلي. تعيين درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية وتعيين برنامج الحركية لمدة 24 ساعة مع تردد القراءة من دقيقتين.وينتج عن ذلك 721 قراءة إجمالية على مدار 24 ساعة في البئر. تعيين اهتزاز إلى اهتزاز مداري سريع مستمر. قم بتعيين القراءات البصرية لقياس التشتت الضوئي عند طول موجة 600 نانومتر لقياس الكثافة البصرية وتعيين الضوء على القراءة من أسفل اللوحة.بعد 24 ساعة، قم بتسجيل قراءات الكثافة البصرية الفارغة النهائية واستخدم الصيغة في بروتوكول النص لتحديد الحجم اللازم لتمييع كل عينة من العينات وصولاً إلى كثافة بصرية قدرها 0.1. لمعالجة دفعة وحدة تخزين التخفيف التي سيتم استخدامها من كل بئر تجريبية، قم بتصدير البيانات من برنامج قارئ اللوحة واستخدم برنامج جدول بيانات لإدراج نفس الصيغة كدالة. كل 24 ساعة، استخدم نفس الوسائط التي يستخدمها اليوم صفر لتمييع كل عينة من العينات إلى كثافة بصرية قدرها 0.1 باستخدام الصيغة.تأكد من استخدام الصيغة لتمييع جميع الآبار وصولا الى كثافة بصرية قدرها 0.1. وهذا يشمل الآبار التي ربما بدأت تظهر بعض الانتعاش في عيب نموها. حفظ جميع منحنيات النمو التي تم إنشاؤها يوميا.لاحظ أي مستعمرة فردية تظهر زيادة معدل النمو الحكم عليها من قبل كثافة بصرية نهائية أعلى بكثير من بقية الفوج مع نفس الخلفية الوراثية أو من قبل منحنى النمو الذي يشبه ذلك من المستعمرات من النوع البري. هذا الفحص عادة ما يستغرق حوالي سبعة إلى 14 يوما. تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة.من اليوم الأخير من اختبار قارئ لوحة، وبعض الثقافات السائلة لديها معدل النمو تعافى بشكل ملحوظ يفترض من خلال الحصول على طفرة القامع التي يمكن أن تخفف من النمط الظاهري من طفرة الوالدين. لتخزين الثقافات المستردة بشكل ظاهري، نقل وخلط 250 ميكرولترات من الثقافة السائلة إلى أنبوب التبريد الذي يحتوي على 250 ميكرولترات من 50٪ الجلسرين. فلاش تجميد الخلايا في النيتروجين السائل وحفظ السلالات في ناقص 80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.للتأكد من أن الطفرة القامع هو عنصر وراثي وراثي، استخدم أساليب عبور الجينية القياسية لعبور الخلايا P متحولة المفضلة لديك مع الخلايا المفضلة لديك طفرات S. عندما يتم خلط اثنين من الخلايا الهابلويد مع نوع التزاوج مجانية ويتعرضون لتجويع النيتروجين، فإنها يمكن أن تولد zygote أن sporulates لتشكيل رباعي من أربعة جراثيم. المواد الوراثية الأبوية سوف فصل خلال الداء اليميني اتباع قواعد علم الوراثة مندلي.بعد التغظ، يمكن تشريح الجراثيم الفردية من نفس رباعيات وتشكيل أربع مستعمرات فردية كما لوحظ عموديا على لوحة. وضع بالتساوي جراثيم واحدا تلو الآخر على لوحة باستخدام microneedle. بعد تشريحها، ترك الخلايا لتنمو في حاضنة 30 درجة مئوية لبضعة أيام حتى تظهر المستعمرات.إذا كانت الطفرة القامع هو عنصر وراثي وراثي، ينبغي أن ينتج هذا الصليب رباعيات التي اثنين من المستعمرات لديها النمط الظاهري المرض من سلالة الوالدين ومستعمرتين لديها معدل نمو الانتعاش من سلالة القامع. اختيار ثلاث مستعمرات مع النمط الظاهري القامع وثلاث مستعمرات مع النمط الظاهري الوالدين من نفس الصليب الجينية والمضي قدما مع استخراج الحمض النووي الجينومي وتسلسل الخطوات كما هو مفصل في بروتوكول النص. ثم قم بإجراء تحليل المعلوماتية الحيوية لتحديد الطفرات القامع كما هو مفصل في النص.تم تسجيل منحنيات النمو للمستعمرات الفردية في الوقت الأولي لمدة ستة أيام مع المراقبة المستمرة باستخدام قارئ اللوحة. كما هو متوقع، مستعمرات نوع البرية تظهر أي تغييرات ملحوظة في منحنيات نموها طوال التجربة. وتجدر الإشارة إلى أن أربع مستعمرات ذات خلفية حذف elf1 ومستعمرة حذف واحدة من fal1 تظهر تحولاً كبيراً في النمو من النمو البطيء إلى بعض مستويات النمو المختلفة المماثلة لتلك التي في مستعمرات الأنواع البرية.بشكل كبير، تظهر جميع المسوخ clr6 انتعاش الظاهري ثابت ينمو بمعدل أسرع بحلول نهاية الفحص. تم إعادة بناء اثنين من التغييرات غير مترادفة التي تم تحديدها ، طفرة cue2 وطفرة rpl2702 في المختبر باستخدام بروتوكولات قياسية لطفرات الموقع الموجهة. تم عبور Cue2 elf1 المسوخ المزدوجة وrpl2702 elf1 mutants المزدوجة مع سلالة متحولة حذف elf1 المجانية.وأظهرت الجينية العبور أن الطفرات القامع التي تم تحديدها ناجحة في قمع النمط الظاهري بطيئة النمو من elf1 حذف متحولة وقابلة للوراثة. خلال التخفيف اليومي من لوحة 96-جيدا، من المهم أن تمييع جميع الآبار إلى نفس التركيز من أجل تجنب انتعاش النمو الاصطناعي. هذه الطريقة تسمح لعزل الطفرات القامع في طريقة إنتاجية عالية تسريع اكتشاف مئات الجينات التي لم تتميز بشكل جيد في الخميرة الانشطار والكائنات الدقيقة الأخرى.يمكن استخدام هذه الطريقة لعزل القامع لجميع الكائنات الحية الدقيقة التي لديها طفرة تسبب عيب في النمو والتي يمكن زراعتها إلى عدد كبير من السكان في الثقافة السائلة. تحديد الطفرات القامع في الخميرة الانشطارية يمكن أن يكون لها آثار محتملة في العثور على الجينات المسببة للأمراض في مسارات متداخلة خاصة عندما يتعلق الأمر بمسارات عالية الحفظ من الخميرة إلى البشر.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

تحديد "معدل إخصاب البيض" من حيث دراسة استخدام "تقنية الخلوية الوراثية"

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...