Name: a deep-sequencing-assisted, spontaneous suppressor screen in the fission yeast schizosaccharomyces pombe
Uploaded: 2019-03-07T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe at JoVE.com

Эта работа была поддержана, Национальный институт Генеральной медицинских наук, гранты 1R15GM119105-01 для К.Ж Мы благодарим всех рецензентов для проницательные комментарии. Мы также благодарим Джеймса Такер, Алисия Андерсон, Элизабет Black и Глен Маррс для обсуждения и комментариев на этой рукописи.

<ol>
	<li>McKay, J. K., Latta, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+population+divergence:+Markers,+QTL+and+traits.">Adaptive population divergence: Markers, QTL and traits.</a> Trends in Ecology and Evolution. 17 (6), 285-291 (2002).</li><li>Wood, V., Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PomBase:+A+comprehensive+online+resource+for+fission+yeast.">PomBase: A comprehensive online resource for fission yeast.</a> Nucleic Acids Research. 40 (D1), (2012).</li><li>de Visser, J. A. G. M., Cooper, T. F., Elena, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+causes+of+epistasis.">The causes of epistasis.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1725), 3617-3624 (2011).</li><li>Sailer, Z. R., Harms, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+high-order+epistasis+in+nonlinear+genotype-phenotype+maps.">Detecting high-order epistasis in nonlinear genotype-phenotype maps.</a> Genetics. 205 (3), 107911088 (2017).</li><li>Kuzmin, E., Costanzo, M., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+arrays:+Automation+of+yeast+genetics.">Synthetic genetic arrays: Automation of yeast genetics.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 326-332 (2016).</li><li>Tong, A. H. Y., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 313 (1), 171-192 (2006).</li><li>Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Mapping+of+Genetic+Interaction+Networks.">Systematic Mapping of Genetic Interaction Networks.</a> Annual Review of Genetics. 43 (1), 601-625 (2009).</li><li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast.">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).</li><li>Bai, X., Yang, Z., Jiang, H., Lin, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+suppressor+screens+in+haploids.">Genetic suppressor screens in haploids.</a> Methods in Cell Biology. , 129-136 (2011).</li><li>Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+suppression+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions+in+bacteria.">Allele-specific suppression as a tool to study protein-protein interactions in bacteria.</a> Methods. 20 (1), 18-34 (2000).</li><li>Motter, A. E., Gulbahce, N., Almaas, E., Barab&#225;si, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+rescues+in+metabolic+networks.">Predicting synthetic rescues in metabolic networks.</a> Molecular Systems Biology. 4, 168 (2008).</li><li>Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation.">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 595-599 (2004).</li><li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, S. C., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease.">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nature Genetics. 37 (5), 526-531 (2005).</li><li>Forsburg, S. L., Patton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens.">The art and design of genetic screens.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).</li><li>Johnston, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens.">The art and design of genetic screens.</a> Genetics. 3 (March), 176-188 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Caenorhabditis+elegans.">The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).</li><li>Gocke, E., M&#252;ller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+studies+in+the+mouse+to+define+a+threshold+for+the+genotoxicity+of+EMS+and+ENU.">In vivo studies in the mouse to define a threshold for the genotoxicity of EMS and ENU.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 678 (2), 101-107 (2009).</li><li>Suzuki, T., Hayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+genotoxicity+of+ethylnitrosourea+and+ethyl+methanesulfonate+in+lacZ+transgenic+mice+(Muta(TM)Mouse).">A comparison of the genotoxicity of ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta(TM)Mouse).</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 395 (1), 75-82 (1997).</li><li>Uttam, J., Alberico, C., De Stasio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU+Mutagenesis.">ENU Mutagenesis.</a> International C. elegans Meeting. , (1995).</li><li>Putrament, A., Baranowska, H., Ejchart, A., Prazmo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Mutagenesis+in+Yeast.">Manganese Mutagenesis in Yeast.</a> Methods in Cell Biology. 20, 25-34 (1978).</li><li>Bose, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+UV+mutagenesis.">Chemical and UV mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 111-115 (2016).</li><li>Ikehata, H., Ono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+of+UV+Mutagenesis.">The Mechanisms of UV Mutagenesis.</a> Journal of Radiation Research. 52 (2), 115-125 (2011).</li><li>Shrivastav, N., Li, D., Essigmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+of+mutagenesis+and+DNA+repair:+cellular+responses+to+DNA+alkylation.">Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation.</a> Carcinogenesis. 31 (1), 59-70 (2010).</li><li>De Stasio, E. A., Dorman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+ENU+mutagenesis+of+Caenorhabditis+elegans.">Optimization of ENU mutagenesis of Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 495 (1-2), 81-88 (2001).</li><li>Probst, F. J., Justice, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mutagenesis+with+the+chemical+supermutagen+ENU.">Mouse mutagenesis with the chemical supermutagen ENU.</a> Methods in Enzymology. 477 (C), 297-312 (2010).</li><li>B&#228;hler, J., Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows+&#8211;+Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows &#8211; Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fastQ+data+to+high-confidence+variant+calls:+The+genome+analysis+toolkit+best+practices+pipeline.">From fastQ data to high-confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 43, (2013).</li><li>Mckenna, A., Hanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+A+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Research. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Marayati, B. F., Drayton, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Elongation-Like+Factor+1+Spontaneously+Induces+Diverse,+RNase+H-Related+Suppressor+Mutations+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Loss of Elongation-Like Factor 1 Spontaneously Induces Diverse, RNase H-Related Suppressor Mutations in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genetics. 209 (4), 967-981 (2018).</li><li>Harris, M. A., Lock, A., B&#228;hler, J., Oliver, S. G., Wood, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FYPO:+The+fission+yeast+phenotype+ontology.">FYPO: The fission yeast phenotype ontology.</a> Bioinformatics. 29 (13), 1671-1678 (2013).</li><li>Xu, X., Wang, L., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Genome+Sequencing+of+Suppressor+DNA+Mixtures+Identifies+Pathways+That+Compensate+for+Chromosome+Segregation+Defects+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Whole-Genome Sequencing of Suppressor DNA Mixtures Identifies Pathways That Compensate for Chromosome Segregation Defects in Schizosaccharomyces pombe.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (3), 1031-1038 (2018).</li><li>Marayati, B. F., Hoskins, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fission+yeast+MTREC+and+EJC+orthologs+ensure+the+maturation+of+meiotic+transcripts+during+meiosis.">The fission yeast MTREC and EJC orthologs ensure the maturation of meiotic transcripts during meiosis.</a> RNA. 22 (9), 1349-1359 (2016).</li></ol>

Авторы заявляют не утвержденных производителей инструментов, используемых в этот метод, а не конкурирующих финансовых интересов.

Протокол, описанные здесь представляет Роман и простой экран для спонтанного подавитель мутации обнаруживаемой через фенотипические восстановления мутаций, присвоении медленный рост дрожжей деления, фенотип, характерные для более чем 400 генов в S. pombe, функции многих из которых остается неизвестным2,32. Предыдущие методы взяли другие подходы к экран для подавитель мутации в микроорганизмов, включая использование мутагенов21, или применение изменения температуры в чувствительных к температуре мутант стола33. Напротив этот протокол показывает, что Фенотипическая восстановления происходит без дополнительного вмешательства экологических химической и подчеркивается преимущество фитнес подъем подавления мутаций со временем принимая за ресурсы, имеющиеся в жидкости культуры. Этот экран позволяет изоляции объездной Подавители или взаимодействия супрессоров, потому что он является эффективным для обеих функция потерь мутации, например elf1∆ или fal1∆ и точечные мутации как clr6-1, покуда мутантов продемонстрировать фитнес дефектов в жидких культуры.
Пока все восстановленные S штаммов, которые мы исследовали продемонстрировали различной степени фенотипические восстановления. Как обнаружил через генетических, восстановленные фенотип объясняется до одноэлементных генетических и является наследственным (примеры показаны на рисунке 2). Это один из наиболее значительных преимуществ этого метода по сравнению с химической основе или на основе УФ подавитель экраны, которые часто ориентированы на нескольких локусов генома. Это часто можно наблюдать одну или две колонии, восстановленные из 16 колоний в штамм (около 10%) в течение недели. Однако мы заметили, что некоторые мутантов, такие как потеря функции Rrp6, exosome конкретного подразделения, никогда не восстановить темпы роста почти одичал типа наблюдается в elf1Δ клетки31. Вполне вероятно, что функция Rrp6 может только частично компенсируется супрессоров, в отличие от функции других мутантов испытания, включая fal1∆, который был показан причинять серьезный дефект meiotic через свою важную функцию регулирования сплайсинга34. Мы считаем, что альтернативные супрессор, методы фильтрации будет зависеть от той же проблемой, когда yfg имеет уникальный, несъемными ролей в рост клеток.
Перед выполнением геномные последовательности, является оптимальным для обратно крест фенотипически восстановленные колоний, определены от плиты читателя, с родительского штаммов очистить генетический фон и получения биологических реплицирует. Кроме того глубоко всего генома определяет сотни единичных нуклеотидных изменений, большинство из которых не являются идентичными между биологической реплицирует, которые имеют мало интереса для скрининга. Например мы обнаружили в общей сложности 660 геномных изменений во всех трех хромосом между двумя elf1Δ P и пять различных штаммов S (Рисунок 3). Мы не наблюдали часто идентичны мутаций между виртуализированного биологического реплицирует каждого штамма, предполагая, что новые мутации могут возникать во время культивирования клеток elf1Δ до строительства геномная библиотека или случайные ошибки могут быть представил во время строительства библиотеки и последовательности. Следовательно изолируя мутации, которые согласуются через биологические реплицирует является важным аспектом в успешной идентификации супрессоров, используя всего генома.
Мы определили и подтвердил два перенапряжения в регионах компакт-диски в пяти виртуализированного S штаммов. Хотя в S-A1 и S-A2 штаммы были обнаружены мутации в SPBPJ4664.02 , маловероятно, что SPBPJ4664.02 является допустимым супрессор, потому что S-A1 и S-A2 не содержит супрессорной на же ген, как они не дополняют друг друга ( данные не показаны). Мы также не подтвердить rli1 в S-A3, который сделал не совместного разделения с фенотипом S при backcrossed с elf1Δ. Кроме того мы нашли специфических мутаций в регионах-кодирования в S-A1, S-A2 и S-А3. Вполне возможно, что эти измененные некодирующих геномной регионов облегчить elf1Δ фенотип, который будет рассматриваться в наших будущих исследований. По сравнению с традиционными методами например пробирного связь, которая может занять годы для сопоставления генетической мутации, мы определили два перенапряжения в течение двух месяцев после подтверждения, что Моногенные элемент вызвал S фенотип. С быстрым развитием технологии всего генома мы настроены оптимистично, что этот метод будет более эффективным для определения последовательного генетические мутации в обозримом будущем.
Таким образом этот протокол предоставляет пошаговые инструкции для успешного выявления мутации подавитель для любого гена интереса с дефектом медленно растущих в жидком культуры. Простота этот assay позволяет для крупномасштабных показ нескольких генетический фон интерес с мало практической подготовки. Есть комната для дальнейшей автоматизации процесса с помощью робота жидкого обработки для выполнения ежедневных разведениях. Так как лаборатория манипуляция микроорганизмов неизбежно требует роста культур в жидкой среде, процесс, который по своей сути селективный для фитнеса, мы предлагаем, что этот протокол может широко применяется для других организмов модель большого населения, таких как бактерии и другие виды дрожжей.

Основы понимания функциональных связей между генов опирается на способность определить молекулярных механизма(ов), в которой сложных генетических признаков расходятся производить разнообразные фенотипов1. В деления дрожжи, Делящиеся дрожжи (S. pombe), большинство белков кодирование генов являются необязательным для жизнеспособности2. Этот результат не говорю незначительность этих генов, а скорее замысловатые компенсаторные механизмы, лежащие в основе биохимические пути, к которым принадлежат такие гены. Пройдя эти компенсаторные механизмы вызвала Эпистаз карты, которые обнаружили всеобъемлющей генетических взаимодействий и расширить наше понимание функциональных биохимические пути3,4.
Разработаны методы высокой пропускной способностью (например, синтетические генетических массив анализа или SGA) для выявления генетических взаимодействий генома общесистемной в многообещающий дрожжей и были расширены для использования в деления дрожжевой5,6. Такие подходы часто полагаются на Библиотека штаммов, содержащий все жизнеспособные одного белка кодирование гена удаления (около 3300 гаплоидным удаления мутантов охватывающих свыше 92% генома деления дрожжей) и требуют робот-манипулятор для выполнения генетических кресты между штамм интерес и все возможные штаммов в library6. Кроме того SGA методов зависит от способности библиотека штаммов для надлежащего и эффективного спаривания, фенотип, что является ненормальным на 444 в настоящее время характеризуется генов в S. pombe2.
Несмотря на сложности генетических взаимодействий, сравнивая фенотип штамм, перевозящих мутации в двух генов к фенотипу двух штаммов, перевозящих отдельные мутации каждого гена может иметь один из двух заметных результатов: 1) является двойной фенотипом мутанта хуже, чем ожидаемый мультипликативной родителей фенотипы в форме болезни или, в самых крайних случая, летальность. Это называется негативных генетических взаимодействия и обычно является признаком того, что два гены действуют в параллельных биологические пути. 2 двойной фенотипом мутанта лучше чем ожидаемый сочетание родительского фенотипов, также известный как позитивного взаимодействия генетические. Позитивное взаимодействие генетических особенно интересно, потому что она показывает, что эти гены работают в том же процессе. Два взаимодействующих положительно гены имеют три возможных отношений: мутантный ген может вверх регулировать экспрессии гена, в параллельные пути, двух генов может работать согласованно в рамках же путь вниз по течению друг друга или два гены кодировать белки, которые взаимодействуют непосредственно друг с другом. Таким образом позитивные генетических взаимодействий может использоваться для сопоставления гена регулирующих узлов и классифицировать uncharacterized генов в биохимические пути7,,8.
Подавитель это мутации, которые могут облегчить болезни фенотип мутации гена другой, обычно представляющий позитивного генетических взаимодействия между двумя генами9,10. Подавитель мутации на различных локус, мутации, которые они подавляют известны как extragenic супрессоров. Они особенно ценны в изучении нежизнеспособных генетические мутации, синтетически спасать смертоносных фенотип (также известный как эффект Лазаря)11. Они также имеют потенциал терапевтического применения в лечении наследственных заболеваний12,13.
По всем этим причинам выявление подавитель мутаций в различных модельных организмов широко использовались для облегчения нашего понимания различных биохимических pathways14,,1516. Скрининг для перенапряжения обычно основывается на фенотип мутации в вопрос и требует проведения случайных мутагенеза изолировать мутации, которые облегчат фенотипа. Почти все модели организмов создали методы случайного мутагенеза. Например N-этил N-Нитрозомочевина (ENU) и ethylmethanesulfonate (EMS), два мутагенов, которые способны индуцировать точечные мутации в ДНК, широко используются в различных моделях мышей17,18,19 от бактерий . Кроме того хлорид марганца уже давно используется в дрожжи для марганца катиона способностью ингибировать ДНК ремонт пути20. Другой распространенный подход — УФ индуцированного мутагенеза, который генерирует генома общесистемной мутагенных пиримидина димеры21,22.
Хотя использование химического мутагенеза для выявления мутаций подавитель был популярен, метод имеет много недостатков, в том числе использование опасных химических веществ, крайне непостоянны успех ставки и введение дополнительных смешанных переменных представлено негативные побочные эффекты мутаген несколько клеточных процессов23,24. Кроме того химический мутагенез часто вызывает несколько мутаций в геном, который добавляет сложности использования генетических и последовательности методов для определения точного мутации, которая наделяет подавитель фенотип организма25.
Для устранения недостатков нынешних подходов мутагенеза, мы представляем метод экран для спонтанного подавитель мутации в деления дрожжей, которые не полагаться на любой мутагены или удаление библиотеки. Этот метод изолирует Подавители через пробирного позитивного выбора. Принцип этого метода на основе роста преимущество мутировавших супрессорной субпопуляции в жидкой культуры, который может контролироваться читатель автоматизированной пластины. Спаривание и мейоз используются только если хотите очистить генетический фон или подтвердить наличие Моногенные аллели супрессоров до всего генома. Если подавление фенотип вызвана одной мутации, подавитель фенотип будет отделять 2:2 после Опылив с родительского штаммов. Подавитель мутации могут быть определены с помощью всего генома. Мы предлагаем, что этот метод применим для скрининга перенапряжения в всех микроорганизмов, которые могут расти в большой численностью населения в жидком культуры.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine, Powder</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147441000</td>
			<td>Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriology Petri Dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>C351029</td>
			<td>100&#215;15mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous, Powder</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-1</td>
			<td>Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar, Granuated</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>214530</td>
			<td>Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris Inc.</td>
			<td>S220</td>
			<td>Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Collection and Analysis Software</td>
			<td>Biotek, Inc.</td>
			<td>GEN5SECURE</td>
			<td>Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid 1N, Liquid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SA48-4</td>
			<td>Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Rich Media (liquid YEA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek, Inc.</td>
			<td>BTH1MG</td>
			<td>Or equivalent, must read visible light at 600nm wavelength range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rich Media agar plates (YEA plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A/T1 mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0551</td>
			<td>Use according to manufacturer recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Polystyrene Inoculating Loop</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>OS101</td>
			<td>Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile workspace and burners</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>C353072</td>
			<td>Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina, Inc.</td>
			<td>20015962</td>
			<td>Use to prepare the whole-genome sequencing library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract, Powder</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a deep-sequencing-assisted, spontaneous suppressor screen in the fission yeast schizosaccharomyces pombe

Генетических экран для мутантных аллелей, которые подавляют фенотипические дефекты, вызванные мутация представляет собой мощный подход к идентификации генов, которые принадлежат к тесно связанных биохимические пути. Предыдущие методы, такие как синтетические генетических массив (SGA), методам анализа и случайных мутагенеза с помощью ультрафиолетового (УФ) или химических веществ, как этиловый метансульфонат (EMS) или N-этил N-Нитрозомочевина (ENU), широко используется, но часто являются дорогостоящими и кропотливая. Кроме того эти методы на основе мутаген скрининга, часто связаны с серьезных побочных эффектов на организм, вызывая несколько мутаций, которые добавить сложности изоляции супрессоров. Здесь мы представляем простой и эффективный протокол для выявления подавитель мутации в мутантов, которые наделяют рост дефекта в Делящиеся дрожжи. Для восстановления с использованием автоматизированных 96-луночных пластины читателя в течение продолжительного периода может контролироваться фитнес клеток с роста дефицита в стандартной жидкости мультимедиа или синтетических жидких сред. Когда ячейка приобретает подавитель мутации в культуре, его потомки переиграть родительских клеток. Восстановленные клетки, которые имеют преимущество конкурентной роста над родительской клетки можно затем изолированные и backcrossed с родительской ячейки. Подавитель мутации затем идентифицируются с помощью всего генома. Используя этот подход, мы успешно изолированы несколько перенапряжения, которые смягчить серьезный рост дефекты, вызванные потерей Elf1, семейству AAA + АТФазы, что важно в ядерный транспорт мРНК и поддержание геномной стабильности. Есть в настоящее время над 400 генами в S. pombe с мутантами, присвоении рост дефекта. Как многие из этих генов uncharacterized, мы предлагаем, что наш метод будет ускорить выявление Роман функционального взаимодействия с этой удобной, высок объём подходом.

Watch this Scientific Journal Video about A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe at JoVE.com

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Мы представляем протокол простого супрессор экрана в деления дрожжей. Этот метод является эффективным, мутагены бесплатно и селективного мутаций, которые часто происходят в одном локусе геномной.  Протокол подходит для изоляции перенапряжения, которые облегчить роста дефектов в жидких культуры, которые вызваны мутации или наркотиков.

При содействии Deep последовательности, спонтанное подавитель экран в деления дрожжевой Делящиеся дрожжи

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Этот протокол описывает простой и эффективный экран супрессора для выявления мутаций супрессора у мутантов, которые имеют дефект роста в расщепляющихся дрожжей. Традиционные методы мутагенеза используют токсичные химические вещества или УФ, которые могут генерировать несколько мутаций в клетке. И наоборот, этот протокол может обогатить одного мутанта-супрессора в отдельных клетках без использования методов индуцирования мутаций.Начните эту процедуру с напряжения строительства и подготовки, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 200 микролитров жидкого мультимедиа к каждой колодец из 96-хорошо полистирола микроплита. С помощью стерильного аппликатора возьмите небольшое количество каждой из подготовленных колоний и приостановите каждую колонию в отдельных колодцах, содержащих жидкие средства массовой информации.Включите пустой колодец для каждого ряда на тарелке, содержащей 200 микролитров одного и того же средства массовой информации. Теперь наймите протокол на программное обеспечение обнаружения считыватель пластин подключен к автоматизированному считыватель микроплатформ. Установите температуру на уровне 30 градусов по Цельсию и установите кинетическую программу на 24 часа с частотой чтения двух минут.Это приводит к 721 всего читает в течение 24-часового периода на колодец. Установите встряхивания непрерывной быстрой орбитальной тряски. Установите оптические считывает для измерения рассеяния света на длине волны 600 нанометров для измерения оптической плотности и установить свет для чтения из-под пластины.Через 24 часа завечите окончательные пустые показания оптической плотности и используйте формулу в текстовом протоколе, чтобы определить объем, необходимый для разбавления каждого из образцов до оптической плотности 0,1. Для пакетного процесса объем разбавления, который будет использоваться из каждой экспериментальной системы, экспорт данных из программного обеспечения для чтения пластин и использование программного обеспечения электронной таблицы для вставки той же формулы, что и функция. Каждые 24 часа используйте те же средства массовой информации, что и нулевой день, чтобы разбавить каждый из образцов до оптической плотности 0,1 с помощью формулы.Убедитесь в том, чтобы использовать формулу, чтобы разбавить все скважины до оптической плотности 0,1. Это включает в себя скважины, которые, возможно, начали показывать некоторое восстановление в их дефект роста. Сохранить все кривые роста генерируется ежедневно.Обратите внимание на любую индивидуальную колонию, которая показывает увеличение темпов роста, судя по окончательной оптической плотности, которая значительно выше, чем остальная часть когорты с тем же генетическим фоном или кривой роста, которая похожа на колонии дикого типа. Этот анализ обычно занимает от семи до 14 дней. Выполните все шаги в стерильных условиях.С последнего дня анализа считывателя пластин, некоторые жидкие культуры имеют заметно восстановленные темпы роста, предположительно, путем получения мутации супрессора, которая может облегчить фенотип родительской мутации. Для хранения фенотипически восстановленных культур перенесите и смешайте 250 микролитров жидкой культуры на криотрубку, содержащую 250 микролитров 50%глицероля. Вспышка заморозить клетки в жидком азоте и сохранить штаммы в минус 80 градусов по Цельсию на неопределенный срок.Чтобы подтвердить, что мутация супрессора является генетически наследуемым элементом, используйте стандартные методы генетического скрещивания, чтобы пересечь ваши любимые мутантные P-клетки с вашими любимыми мутантными клетками S. Когда две гаплоидные клетки с бесплатным типом спаривания смешиваются и подвергаются азотной голоданию, они могут генерировать зиготу, которая спорит, чтобы сформировать тетраду из четырех спор. Родительские генетические материалы будут сегрегироваться во время мейоза в соответствии с правилами генетики Менделея.После sporulation, индивидуальные споры от таких же tetrads можно вскрыть и сформировать 4 индивидуальных колонии как наблюдаемые вертикально на плите. Равномерно поместите споры один за другим на тарелку с помощью микроиглы. После вскрытия оставьте клетки расти в 30 градусов по Цельсию инкубатор в течение нескольких дней, пока колонии появляются.Если мутация супрессора является генетически наследуемым элементом, этот крест должен дать тетрады, в которых две колонии имеют фенотип болезни родительского штамма и две колонии имеют темпы роста восстановления штамма супрессора. Выберите три колонии с фенотипом супрессора и три колонии с родительским фенотипом из того же генетического креста и приступайте к шагам по извлечению и секвенированию геномной ДНК, описанным в текстовом протоколе. Затем выполните биоинформатический анализ для идентификации мутаций супрессора, как описано в тексте.Кривые роста отдельных колоний были зарегистрированы в начальной точке времени и в течение шести дней с непрерывным мониторингом с помощью считыватель пластин. Как и ожидалось, колонии дикого типа не показывают заметных изменений в кривых роста на протяжении всего эксперимента. Примечательно, что четыре колонии с фоном удаления elf1 и одной колонией удаления fal1 показывают резкий сдвиг в росте от медленного роста к некоторым различным уровням роста, аналогичным уровню колоний дикого типа.Драматически, все мутанты clr6 показывают последовательное фенотипическое восстановление, растущее более быстрыми темпами к концу анализа. Два из выявленных не синонимных изменений, мутация cue2 и мутация rpl2702 были реконструированы в лаборатории с использованием стандартных протоколов для сайта направленного мутагенеза. Двойные мутанты Cue2 elf1 и двойные мутанты rpl2702 elf1 были скрещены с бесплатным штаммом мутантов elf1.Генетическая скрещивание показало, что выявленные мутации супрессора успешны в подавлении медленно растущего фенотипа мутанта удаления эльф1 и являются напыльными. Во время ежедневного разбавления пластины из 96 скважин важно разбавить все скважины до одинаковой концентрации, чтобы избежать искусственного восстановления роста. Этот метод позволяет изоляции мутаций супрессора в высокой пропускной способности образом ускорения открытия сотен генов, которые не были хорошо охарактеризованы в расщепляющихся дрожжей и других микроорганизмов.Этот метод может быть использован для изоляции супрессоров для всех микроорганизмов, которые имеют мутации, вызывающие дефект роста и которые могут быть выращены до большой популяции в жидкой культуре. Выявление мутаций супрессора в расщепляющихся дрожжах может иметь потенциальные последствия в поиске болезнетворных генов в перекрывающихся путях, особенно когда дело доходит до высокосхраняющихся путей от дрожжей до людей.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Измерение уровня мРНК со временем во время дрожжей S. cerevisiae гипоксических ответа

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Обобщённые индуцируемый экран для повторной активации MeCP2 на неактивных Х-хромосома

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Джин целевой случайных мутагенеза выбрать дестабилизирующих гетерохроматин протеасом мутантов в деления дрожжевой

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Информатики анализ последовательности данных из пакетного дрожжи 2-гибрид экраны

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

На основе спаривания гиперэкспрессия библиотека скрининга в дрожжи

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Характеризуя гистона столб-поступательные изменения изменения в моделях Neurodegenerative Proteinopathy дрожжей

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Определения скорости оплодотворение яйца Bemisia tabaci с помощью цитогенетического техника

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...