Name: a deep-sequencing-assisted, spontaneous suppressor screen in the fission yeast schizosaccharomyces pombe
Uploaded: 2019-03-07T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of General Medical Sciences, bidrag 1R15GM119105-01-K.Z. Vi tackar alla recensioner för insiktsfulla kommentarer. Vi tackar också James Tucker, Alicia Anderson, Elizabeth svart och Glen Marrs för diskussion och kommentarer till detta manuskript.

1. Sila konstruktion och beredning
<ol><li>Generera en mutation eller en borttagning av genen (yfm, din favorit mutation) använder standard webbplats riktad mutagenes (SDM) som tidigare beskrivits26.</li>
	<li>Innan du börjar skärmen, (optimalt) backcross de muterade stammarna med en vildtyp stam att rengöra den genetiska bakgrunden och generera fresh-född mutanta celler som föräldrarnas stammar. Strimma föräldrarnas stammen till enskilda kolonier på standard rika medier tallrikar. Slumpmässigt välja åtta till sexton oberoende kolonier (biologiska replikat) med de önska mutationerna för plattan läsaren analysen (se 3.1). Obs: Detta protokoll är effektiv bara när föräldrarnas stammar har en tillväxt som defekt i flytande media (minimal eller rik, med eller utan läkemedel eller temperatur SKIFT som orsakar tillväxt felet). Alla föräldrars stammar bör haploida och därmed kunna vara genetiskt korsade med andra haploida stammar med en kompletterande parning typ.</li>
</ol>2. skylt läsaren assay
<ol><li>Med en steril applikator, ta en liten mängd av varje av de kolonier som bereddes i steg 1,1 (inga exakta belopp som är nödvändigt att Inokulera start kultur) och placera i en 96 brunnar polystyren mikroplattan. Upphäva alla kolonierna i 200 µL av lämpliga flytande media (rik eller minimal, med eller utan drog). Inkludera en tom brunn för varje rad på plattan som innehåller 200 µL av samma media (inga celler).</li>
	<li>Kör följande protokoll på en tallrik läsare upptäckt programvara ansluten till en automatiserad mikroplattan-läsare: Ange ett kinetic program för 24 h och temperatur på 30 ° C, med ständig snabbt orbital skakning (425 cpm, 3 mm amplitud). Ange den optiska läser att mäta ljusspridningen vid en våglängd på 600nm för optisk densitet och ange ljuset att läsa underifrån plattan en läsning frekvens på 2 min (721 totalt läser under en 24-h per brunn).</li>
	<li>Efter 24 h, spela in de slutliga utelämnade Absorbansavläsningar (utelämnat OD600) och Använd följande formel för att bestämma den volymen som behövs för att späda ut varje prov ner till OD = 0,1: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59133/59133eq1v2.jpg"> Obs: Exportera data från programvaran plate reader och använda ett kalkylprogram för att infoga formeln ovan som en funktion till batch process utspädning volymen att användas från varje experimentella brunn.</li>
	<li>Varje 24 h, späd varje prov med samma media som dag 0 till OD = 0,1 (ca 1,5 x 106 celler/mL) med hjälp av formeln anges i steg 2,3. Spara alla tillväxt kurvor genererade dagligen och observera eventuella enskilda koloni som visar en ökad tillväxttakt, bedömas genom en slutlig O.D. som är betydligt högre än resten av kohorten med samma genetiska bakgrund eller en tillväxtkurva som är liknande till det av vildtyp kolonier. Obs: Denna analys tar oftast ca 7-14 dagar. Utföra alla steg under sterila förhållanden.</li>
</ol>3. Val av suppressor kolonier och bekräftelse av fenotyp.
<ol><li>Från den sista dagen i plattan läsaren analysen (steg 2,4), spara de flytande kulturer som har en märkbart återvunna tillväxttakt, förmodligen genom att få en suppressor-mutation som kan lindra fenotypen av föräldrarnas mutationen. Överför och blanda 250 µL flytande kultur till en cryotube som innehåller 250 µL 50% glycerol. Blixt frysa cellerna i flytande kväve och spara stammarna i - 80oC på obestämd tid.</li>
	<li>För att bekräfta att suppressor mutationen är ett genetiskt ärftligt inslag, använda standard genetiska korsning metoder för att korsa yfm P (för föräldraledighet, stammen används i början av plattan läsaren analysen) med yfm S (för suppressor, stammen sparad i slutet plate reader analysens). Om suppressor mutationen är verkligen ett genetiskt ärftligt inslag, bör yfm P × yfm S ge tetrads där två kolonier har sjukdom fenotypen av föräldrarnas stammen och två kolonier har återvunna ökningstakt i suppressor stam.</li>
	<li>Från korset av steg 3,2, plocka tre kolonier med suppressor fenotypen (S-stam) och tre kolonier med föräldrarnas fenotypen (P stam) från samma genetiska cross (3 biologiska replikat för varje) och fortsätt med den genomiska DNA-extraktionen och sekvensering stegen nedan. Obs: Steg 3.2 och 3.3 rekommenderas, men krävs inte. Alternativt kan en sprida återvunna flytande kultur som samlats från 3.1 på rik till enstaka kolonier, sedan slumpmässigt välja tre kolonier som biologiska exemplar för helgenom-sekvensering utan ytterligare genetiska bekräftelse. I det här fallet användas tre biologiska exemplar av föräldrarnas stam för genomisk sekvensering jämförelse.</li>
</ol>4. genomisk DNA extraktion, bibliotek produktion och sekvensering.
<ol><li>För DNA extraktion, bibliotek förberedelse och sekvensering, slumpmässigt välja tre biologiska replikat per yfm P stam, och tre biologiska replikerar av varje individuellt uppkomna yfm S stammar från de genetiska kors (steg 3,2) eller från den plattor som har spritts för att få enstaka kolonier S stam (steg 3.3 not).</li>
	<li>Växa stammar i 10 mL kulturer i rika medier till mitten av log fas (OD = 0,5 – 0,8, om 0,75 – 1,2 x 107 celler/mL), och använda en skakande incubator för att växa flytande kulturer vid 30 ° C med kontinuerligt skakar vid 250 rpm. Samla celler genom centrifugering vid 4 ° C för 5 min vid 1000 x g.</li>
	<li>Avbryta pelleterat celler i 400 µL av DNA extraktion buffert (2% Triton x-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM Na2-EDTA), tillsätt sedan 400 µL av glaspärlor och 400 µL av 25:24:1 fenol: kloroform: isopentanol. Vortex kraftigt i 2 minuter vid 4 ° C.</li>
	<li>Lägga till en ytterligare 200 µL av DNA extraktion buffert och blanda genom att vända flera gånger. Centrifugera i 5 minuter vid 4 ° C vid 20 000 x g.</li>
	<li>Överföra vattenfasen till en ren slang, Lägg till 20 µg RNase A/T1 mix och inkubera vid 37 ° C i 15 min.</li>
	<li>Tillsätt en motsvarande volym av 25:24:1 fenol: kloroform: isopentanol, snurra för 5 minuter vid 4 ° C vid 20 000 x g, sedan överföra vattenfasen till en ren röret.</li>
	<li>Tillsätt en motsvarande volym av kloroform, blanda genom att vända flera gånger, snurra för 5 min vid 4 ° C vid 20 000 x goch sedan överföra den vattenhaltiga fasen till en ren röret.</li>
	<li>Förhastade DNA med två volymer av 100% etanol plus 10% volym 3 M NaOAC (pH 4.3) vid-20 ° C i minst 2 h, sedan snurra för 5 min vid 4 ° C på 20 000 x g och samla pelleten.</li>
	<li>Tvätta pelleten (utfällda DNA) två gånger med kylda 70% etanol (Centrifugera vid 20 000 x g, 5 min, 4 ° C) och centrifugerade i 50 µL 10 mM Tris buffert (pH 7,4).</li>
	<li>Använd biblioteket prep kit (se Tabell för material) per tillverkarens rekommendationer att förbereda helgenom-sekvensering biblioteket. Obs: vi rekommenderar i kit som listas i Tabell för material eftersom det tillåter byggandet av genombibliotek utan PCR-amplifiering, vilket minimerar fel mutationer genereras under PCR-amplifiering. Dessutom under genombibliotek preparatet, Tillåt inte pärlor för att helt torr genom att förkorta den pärlan torktid till 1 – 2 min.</li>
	<li>För klippning parametrar under bibliotek förberedelsen, använda en fokuserad någon sonikator (se Tabell av material) och ange den plikt faktorn till 20%, toppeffekt till 175 W, med 200 cykler per sprack, och frekvens svepande läge vid 5.5oC till 6 ° C i 45 s. Alternativt, Använd en DNA och chomatin klippning system (se Tabell för material) med följande inställningar: 50% amplitud på 4 ° C med pulsläge, 15 s på och 15 s off för 10 min, med en total handläggningstid på 20 min.</li>
	<li>Det är viktigt att hantera farliga material som används i detta steg med omsorg. Rådfråga lämpliga varuinformationsbladen och institutionens miljö och hälsa och säkerhet Office för att hantera NaOAC, etanol, 25:24:1 fenol: kloroform: isopentanol och kloroform.</li>
	<li>Sekvensera de resulterande genomiska bibliotek. Den hela sekvensering läser bör omfatta minst tre gånger av hela genomet med upplösning på en enda nukleotid sortiment. Parat-slutade sekvensering (eller senaste tekniken) rekommenderas.</li>
</ol>5. bioinformatik analys för identifiering av de suppressor mutationerna
<ol><li>Utföra bioinformatik analysen att fokusera på de genomiska förändringar som identifieras konsekvent mellan föräldraledighet och undertryckta yfm stammar i alla biologiska replikerar. Obs: Fullständig pipeline processen beskrivs nedan, men, två oformaterad text BASH-script filer, fastq_to_vcf.sh och vcfprocess.sh, ingår dessutom som kompletterande material att visa exempel på arbetsflödet från bearbetning av läser till VCF variant filer och bearbetning och skärningspunkten mellan VCF filer, respektive.</li>
	<li>Trim kort-läser använder SKJUVNING (https://github.com/jbpease/shear) följande kommandorader (alla andra alternativ standard): Shear.py--fq1 $FASTQ1--fq2 $FASTQ2--out1 $OUTFQ1--out2 $OUTFQ2 \ --barcodes1 $BARCODE--plattform TruSeq--trimqual 20:20 \ --trimpolyat 0--trimambig--filterlength 50--filterunpaired</li>
	<li>Karta läser till S. pombe referens genomet v2.30 erhålls från PomBase (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/) använder BWA v0.7.1527. Använd följande kommandorad (alla andra alternativ standard): BWA mem -t 8 $GENOME $OUTFQ1 $OUTFQ2 > $SAM1</li>
	<li>Bästa praxis sätta justering SAM filer genom GATK och pipeline28 för variant ringer med GATK v3.629, PicardTools v2.5.0 (http://broadinstitute.github.io/picard) och SAMtools v1.3.130. Använd följande kommandorader och parametrar (alla andra alternativ standard): Java-Xmx30g-jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups INPUT = $SAM1 \ OUTPUT = $BAMMARKED RGID = 1 RGLB = lib01 RGPL = illumina \ RGPU = $BARCODE RGSM = $SAMPLENUMBER samtools fixmate - O bam $BAMMARKED $BAMFIXED samtools sortera - O bam -o $BAMSORTED -T /home/peasejb/tmp $BAMFIXED samtools index $BAMSORTED Java-Xmx30g-jar GenomeAnalysisTK.jar -T HaplotypeCaller \ -R $GENOME-jag $BAMSORTED--genotyping_mode DISCOVERY \ -stand_emit_conf 10 - stand_call_conf 30 -o $VCFRAW</li>
	<li>Komprimera och index VCF-filer med hjälp av tabix: bgzip $VCFRAW.vcf tabix $VCFRAW.vcf.gz</li>
	<li>Jämföra VCF filer mellan föräldraledighet och suppressor stammar sekvensering replikat med BCFtools v1.3.127. Använd följande kommandorader och parametrar (alla andra alternativ vänster standard): bcftools isec - n + 1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \ $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list Anmärkning: Detta kommando gav en fil som kodats med binära mönster där sekvens varianter som förekommer i den första muterat endast skulle vara binärkodade som ”000100”, den andra muterat endast som ”000010”, alla tre mutanter som ”000111”, etc. Dessa filer har genererats för varje uppsättning föräldraledighet och mutant replikera VCF-filer.</li>
	<li>Kompilera variant korsningen lista filer tillsammans med filen namnet bifogas varje rad med kommandot UNIX grep: grep ””. *.list > all.list</li>
	<li>Korsreferens variant lista med den aktuella GFF3 annotation filen (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosacchar omyces_pombe.chr.gff3) med hjälp av anpassade Python skript (variant_characterize.py) att identifiera konsekvent SNP platser i protein-kodande regioner (synonymt och icke-synonymt), 5′ och 3′ utr och ncRNA. python3 variant_characterize.py--lista common_variants.list \ --gff schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3 \ --fasta Schizosaccharomyces_pombe. ASM294v2.30.DNA.Genome.FA \ --mönster 000100--ut all.list.filter.000100 Upprepa detta script ändra--mönstret och suffixet för utdatafilen (--ut) med hjälp av binärfilen mönster: 000010, 000001, 000110, 000011, 000101 och 000111</li>
	<li>Kombinera utdata från alla dessa skript körs i en tabbavgränsad fil, att ses som ett kalkylblad. Tabellen kommenterad av varianter inkluderar de som visas i antingen en eller båda mutant nomenklaturkod i förhållande till bakgrunden. Binärt flaggfältet betecknar antingen utseende i en enda mutant stam (000100, 000010, 000001), två muterade stammar (000011, 000101, 000110), eller alla tre mutant stammar (000111).</li>
	<li>Analysera utdata kommenterade förteckningar över varianter inte finns i föräldrarnas proverna, men hittade i en, två eller alla tre mutant prover. Anteckningen betecknar både genomisk läge och klass av variant (synonymt/icke-synonym i en kodning region, 3' / 5' UTR, icke-kodande, etc.). Från denna lista med kandidat mutationer, kan ett exempel av en starkt relevanta kandidater vara en icke-synonymt kodning variant visas konsekvent i alla tre stammar. En annan typ av stark kandidat skulle vara en ansamling av olika icke-synonymt eller förmodad regulatoriska mutationer i de muterade stammar förekommer nära varandra eller inom samma gen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McKay, J. K., Latta, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+population+divergence:+Markers,+QTL+and+traits.">Adaptive population divergence: Markers, QTL and traits.</a> Trends in Ecology and Evolution. 17 (6), 285-291 (2002).</li><li>Wood, V., Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PomBase:+A+comprehensive+online+resource+for+fission+yeast.">PomBase: A comprehensive online resource for fission yeast.</a> Nucleic Acids Research. 40 (D1), (2012).</li><li>de Visser, J. A. G. M., Cooper, T. F., Elena, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+causes+of+epistasis.">The causes of epistasis.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1725), 3617-3624 (2011).</li><li>Sailer, Z. R., Harms, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+high-order+epistasis+in+nonlinear+genotype-phenotype+maps.">Detecting high-order epistasis in nonlinear genotype-phenotype maps.</a> Genetics. 205 (3), 107911088 (2017).</li><li>Kuzmin, E., Costanzo, M., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+arrays:+Automation+of+yeast+genetics.">Synthetic genetic arrays: Automation of yeast genetics.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 326-332 (2016).</li><li>Tong, A. H. Y., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 313 (1), 171-192 (2006).</li><li>Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Mapping+of+Genetic+Interaction+Networks.">Systematic Mapping of Genetic Interaction Networks.</a> Annual Review of Genetics. 43 (1), 601-625 (2009).</li><li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast.">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).</li><li>Bai, X., Yang, Z., Jiang, H., Lin, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+suppressor+screens+in+haploids.">Genetic suppressor screens in haploids.</a> Methods in Cell Biology. , 129-136 (2011).</li><li>Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+suppression+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions+in+bacteria.">Allele-specific suppression as a tool to study protein-protein interactions in bacteria.</a> Methods. 20 (1), 18-34 (2000).</li><li>Motter, A. E., Gulbahce, N., Almaas, E., Barab&#225;si, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+synthetic+rescues+in+metabolic+networks.">Predicting synthetic rescues in metabolic networks.</a> Molecular Systems Biology. 4, 168 (2008).</li><li>Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+suppression+of+a+genetic+mutation+in+a+zebrafish+model+of+aortic+coarctation.">Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 595-599 (2004).</li><li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, S. C., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease.">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nature Genetics. 37 (5), 526-531 (2005).</li><li>Forsburg, S. L., Patton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens.">The art and design of genetic screens.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).</li><li>Johnston, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens.">The art and design of genetic screens.</a> Genetics. 3 (March), 176-188 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+Caenorhabditis+elegans.">The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).</li><li>Gocke, E., M&#252;ller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+studies+in+the+mouse+to+define+a+threshold+for+the+genotoxicity+of+EMS+and+ENU.">In vivo studies in the mouse to define a threshold for the genotoxicity of EMS and ENU.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 678 (2), 101-107 (2009).</li><li>Suzuki, T., Hayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+genotoxicity+of+ethylnitrosourea+and+ethyl+methanesulfonate+in+lacZ+transgenic+mice+(Muta(TM)Mouse).">A comparison of the genotoxicity of ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta(TM)Mouse).</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 395 (1), 75-82 (1997).</li><li>Uttam, J., Alberico, C., De Stasio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU+Mutagenesis.">ENU Mutagenesis.</a> International C. elegans Meeting. , (1995).</li><li>Putrament, A., Baranowska, H., Ejchart, A., Prazmo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+Mutagenesis+in+Yeast.">Manganese Mutagenesis in Yeast.</a> Methods in Cell Biology. 20, 25-34 (1978).</li><li>Bose, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+UV+mutagenesis.">Chemical and UV mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 111-115 (2016).</li><li>Ikehata, H., Ono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanisms+of+UV+Mutagenesis.">The Mechanisms of UV Mutagenesis.</a> Journal of Radiation Research. 52 (2), 115-125 (2011).</li><li>Shrivastav, N., Li, D., Essigmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+of+mutagenesis+and+DNA+repair:+cellular+responses+to+DNA+alkylation.">Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation.</a> Carcinogenesis. 31 (1), 59-70 (2010).</li><li>De Stasio, E. A., Dorman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+ENU+mutagenesis+of+Caenorhabditis+elegans.">Optimization of ENU mutagenesis of Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 495 (1-2), 81-88 (2001).</li><li>Probst, F. J., Justice, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+mutagenesis+with+the+chemical+supermutagen+ENU.">Mouse mutagenesis with the chemical supermutagen ENU.</a> Methods in Enzymology. 477 (C), 297-312 (2010).</li><li>B&#228;hler, J., Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows+&#8211;+Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows &#8211; Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li><li>Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fastQ+data+to+high-confidence+variant+calls:+The+genome+analysis+toolkit+best+practices+pipeline.">From fastQ data to high-confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 43, (2013).</li><li>Mckenna, A., Hanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+A+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Research. 20, 1297-1303 (2010).</li><li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Marayati, B. F., Drayton, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Elongation-Like+Factor+1+Spontaneously+Induces+Diverse,+RNase+H-Related+Suppressor+Mutations+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Loss of Elongation-Like Factor 1 Spontaneously Induces Diverse, RNase H-Related Suppressor Mutations in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genetics. 209 (4), 967-981 (2018).</li><li>Harris, M. A., Lock, A., B&#228;hler, J., Oliver, S. G., Wood, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FYPO:+The+fission+yeast+phenotype+ontology.">FYPO: The fission yeast phenotype ontology.</a> Bioinformatics. 29 (13), 1671-1678 (2013).</li><li>Xu, X., Wang, L., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Genome+Sequencing+of+Suppressor+DNA+Mixtures+Identifies+Pathways+That+Compensate+for+Chromosome+Segregation+Defects+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Whole-Genome Sequencing of Suppressor DNA Mixtures Identifies Pathways That Compensate for Chromosome Segregation Defects in Schizosaccharomyces pombe.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (3), 1031-1038 (2018).</li><li>Marayati, B. F., Hoskins, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fission+yeast+MTREC+and+EJC+orthologs+ensure+the+maturation+of+meiotic+transcripts+during+meiosis.">The fission yeast MTREC and EJC orthologs ensure the maturation of meiotic transcripts during meiosis.</a> RNA. 22 (9), 1349-1359 (2016).</li></ol>

Författarna förklarar ingen rekommendation av tillverkarna av de instrument som används i denna metod, och inga konkurrerande finansiella intressen.

Protokollet beskrivs här representerar en ny och enkel skärm för spontana suppressor mutationer kan upptäckas genom fenotypiska återhämtning av mutationer ger långsam tillväxt i fission jäst, en fenotyp som kännetecken av över 400 gener i S. pombe, den funktionen hos många som förblir okänd2,32. Tidigare metoder tagit andra ansatser till skärmen för suppressor mutationer i mikroorganismer, inklusive användning av mutagena ämnen21eller tillämpningen av en temperatur SKIFT i temperaturkänsliga mutant bakgrunder33. Däremot visar detta protokoll att fenotypiska återhämtning sker utan ytterligare miljömässiga och kemiska störningar och belyser fitness fördelen av löneförhöjningen av undertryckande mutationer så småningom tar över resurserna som finns i vätskan kultur. Denna skärm kan isolering av både bypass dämpning eller interaktion dämpning eftersom den är effektiv för både förlust-av-funktion mutationer som elf1∆ eller fal1∆ och punktmutationer som clr6-1, så länge som mutanter Visa fitness defekter i flytande kultur.
Hittills har har alla återvunna S stammar som vi har undersökt visat varierande grad av fenotypiska återhämtning. Som upptäcks genom genetiska korsning, återvunna fenotypen är hänförlig till ett enda genetiska element och är ärftlig (exempel visas i figur 2). Detta är en av de viktigaste fördelarna med denna metod jämfört med kemikalie- eller UV-baserade suppressor skärmar, som ofta riktar flera genomisk loci. Det är vanligt att iaktta en eller två kolonier som återvinns ur 16 kolonier/stam (runt 10%) inom en vecka. Vi märkte dock att vissa mutanter, t ex förlust-av-funktionen av Rrp6, av kärn-specifika exosome delenheten aldrig återhämtade sig nästan vildtyp tillväxttakten observerats i elf1Δ celler31. Det är troligt att fungera av Rrp6 kan bara kompenseras genom dämpning, till skillnad från andra mutanter testade, inklusive fal1∆, som visades att orsaka en svår meiotiska defekt genom sin viktiga funktion i reglerande funktion splitsning34. Vi tror att alternativa suppressor screeningmetoder skulle omfattas av samma problem när yfg har unika, icke-utbytbara roller i celltillväxt.
Innan du utför genomisk sekvensering, är det optimalt att back-cross fenotypiskt återvunna kolonierna, identifierade från plattan-läsaren, med föräldrarnas stammar att rensa den genetiska bakgrunden och få biologiska replikat. Dessutom identifierar djupt helgenom-sekvensering hundratals enda nukleotid förändringar, av vilka de flesta inte är identiska mellan biologiska replikat som är av föga intresse för screening. Till exempel, vi har hittat totalt 660 genomiska förändringar över alla tre kromosomer mellan de två elf1Δ P och de fem olika S stammarna (figur 3). Vi inte vanligen iakttar identiska mutationer mellan sekvenserade biologiska replikerar av varje stam, vilket tyder på att antingen nya mutationer kan uppstå under odling av elf1Δ celler innan genombibliotek konstruktion eller slumpmässiga fel får vara introducerade under bibliotek konstruktion och sekvensering. Därför är isolera mutationer som är konsekvent över biologiska replikat en viktig aspekt i framgångsrik identifiering av dämpning med helgenom-sekvensering.
Vi identifierat och bekräftade två dämpning i CDS regioner i fem sekvenserade S stammar. Även om mutationer i SPBPJ4664.02 upptäcktes i både S-A1 och S-A2 stammar, är det osannolikt att SPBPJ4664.02 är en giltig suppressor eftersom S-A1 och S-A2 inte innehåller en ljuddämpare på samma gen som de inte är kompletterande med varandra ( data som inte visas). Vi också inte bekräfta rli1 i S-A3, som inte samtidig segregera med S fenotypen när backcrossed med elf1Δ. Alternativt, Vi hittade specifika mutationer i icke-kodande regioner i S-A1, S-A2 och S-A3. Det är möjligt att dessa förändrade icke-kodande genetiska regioner lindra den elf1Δ fenotyp, som kommer att behandlas i vår framtida studier. Jämfört med traditionella metoder såsom ett länkage-test, som kan ta år att mappa en genetisk mutation, identifierade vi två dämpning inom två månader efter att ha bekräftat att ett monogena element orsakade S fenotypen. Med den snabba utvecklingen av helgenom-sekvenseringsteknologi är vi optimistiska att denna metod kommer att vara effektivare att identifiera konsekvent genetiska mutationer inom överskådlig framtid.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll stegvisa anvisningar för att framgångsrikt identifiera suppressor mutationer för någon gen av intresse med en långsamt växande defekt i flytande kultur. Enkelheten i denna analys möjliggör storskalig screening av flera genetiska bakgrunder sevärdheter med lite praktisk utbildning. Det finns utrymme att ytterligare automatisera processen genom att använda en vätskehantering-robot för att utföra de dagliga utspädningarna. Sedan laboratoriet manipulation av mikroorganismer kräver oundvikligen tillväxt i flytande kultur, en process som är inneboende selektiva för fitness, föreslår vi att detta protokoll kan användas i stort sett till andra stora-befolkning modellorganismer såsom bakterier och andra jäst arter.

Grunden för förståelse funktionella kopplingar mellan gener är beroende av förmågan att identifiera de molekylära mekanismerna som komplexa genetiska egenskaper skiljer sig åt för att producera olika fenotyper1. I fission jästen, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), är majoriteten av protein-kodande gener överflödiga för livskraft2. Detta resultat talar inte till åskådning av dessa gener, utan snarare att de intrikata kompensatoriska mekanismerna bakom den biokemiska vägar till vilka hör sådana gener. Dissekera dessa kompensationsmekanismer har genererat epistasis kartor, som har avslöjats omfattande genetiska interaktioner och breddat vår förståelse för funktionella biokemiska vägar3,4.
Hög genomströmning metoder (t.ex. syntetiska genetiska Array analys eller SGA) har utvecklats för att identifiera genome-wide genetiska interaktioner i spirande jäst och har utökats för användning i fission jäst5,6. Sådana tillvägagångssätt förlitar sig ofta på ett bibliotek av stammar som innehåller alla livskraftiga enda protein-kodning gen borttagningar (cirka 3300 haploida radering mutanter som täcker över 92% av fission jäst genomet), och kräver en robotarm att utföra genetiska korsen mellan den stam av intresse och alla möjliga stammar i library6. Ytterligare, SGA tekniker är beroende av förmågan hos biblioteket stammar att ha korrekt och effektiv parning, en fenotyp som för närvarande är onormal till 444 kännetecknas gener i S. pombe2.
Trots komplexiteten i genetiska interaktioner, jämföra fenotypen av en stam som transporterar mutationer i två gener att fenotypen av två stammar bär enskilda mutationer av varje gen kan ha en av två anmärkningsvärda resultat: 1) dubbla mutanta fenotypen är värre än de förväntade multiplikativ föräldrarnas fenotyperna i form av sjukdom eller, i det mest extrema fallet, dödlighet. Detta kallas en negativ genetisk interaktion och är i allmänhet ett tecken på att de två generna agera i parallella biologiska spridningsvägar. (2) dubbla mutanta fenotypen är bättre än förväntade kombinationen av föräldrarnas fenotyper, även känd som en positiv genetisk interaktion. En positiv genetisk interaktion är särskilt intressant eftersom det indikerar att dessa gener fungerar i samma process. Två positivt samverkande gener har tre potentiella relationer: en muterade genen kan uppreglera uttrycket av andra genen i en parallell väg, de två generna kan arbeta i samförstånd inom den samma vägen nedströms av varandra eller de två generna kodar proteiner som samverkar direkt med varandra. Därför kan positiva genetiska interaktioner användas för att kartlägga gen reglerande noder och klassificera uncharacterized gener i biokemiska vägar7,8.
En ljuddämpare är en mutation som kan lindra sjukdom fenotypen av mutationen av en annan gen, som vanligtvis representerar en positiv genetisk interaktion mellan de två gener9,10. Suppressor mutationer på en olika locus för mutationen de undertrycka kallas extragenic dämpning. De är särskilt värdefulla i att studera icke-viabla genetiska mutationer av syntetiskt undsättning dödliga fenotyp (kallas även Lazarusen verkställer)11. De har också potentiella terapeutiska tillämpningar vid behandling av ärftliga sjukdomar12,13.
Av alla dessa skäl, har identifiering av suppressor mutationer i olika modellorganismer allmänt använts för att underlätta vår förståelse för olika biokemiska vägar14,15,16. Screening för dämpning är vanligtvis baserad på fenotypen av mutationen i fråga och kräver genomför slumpmässig mutagenes för att isolera de mutationer som skulle lindra fenotypen. Nästan alla modellorganismer har etablerat slumpmässig mutagenes metoder. Till exempel N-etyl-N-nitrosourea (ENU) och ethylmethanesulfonate (EMS), två mutagena ämnen som kan framkalla punktmutationer i DNA, används allmänt i olika modeller från bakterier till möss17,18,19 . Dessutom har mangan natriumklorid länge använts i jäst för mangan cationen förmåga att hämma DNA reparation vägar20. En annan vanlig metod är UV-inducerad mutagenes, vilket genererar genome-wide mutagena pyrimidin dimerer21,22.
Även om användningen av kemiska mutagenes att identifiera suppressor mutationer har varit populära, har metoden många nackdelar, inklusive användning av farliga kemikalier, mycket varierande framgång priser och införandet av extra störande variabler presenteras av negativa biverkningar av mutagent på flera cellulära processer23,24. Dessutom framkallar kemiska mutagenes ofta flera mutationer i arvsmassan som bidrar till komplexiteten av att använda genetiska och sekvensering tekniker för att identifiera den exakta mutation som tilldelats suppressor fenotypen i organismen25.
För att åtgärda bristerna i nuvarande mutagenes metoder, presenterar vi en metod för att skärmen för spontana suppressor mutationer i fission jäst som inte bygger på någon mutagena eller radering bibliotek. Metoden isolerar dämpning genom ett positivt urval assay. Principen för denna metod är baserad på tillväxt fördelen av muterade suppressor subpopulationen i flytande kultur, som kan övervakas genom en automatiserad Plattläsare. Para ihop och meios används endast om man skulle vilja rensa upp den genetiska bakgrunden eller förekomsten av monogena alleler av dämpning innan helgenom-sekvensering. Om den undertryckande fenotypen orsakas av en enda mutation, kommer den suppressor fenotypen segregera 2:2 efter återkorsning med föräldrarnas stammar. Suppressor mutationerna kan då identifieras med helgenom-sekvensering. Vi föreslår att denna metod är tillämplig för screening dämpning i alla mikroorganismer som kan växa till en stor population i flytande kultur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine, Powder</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147441000</td>
			<td>Use at 75 mg/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriology Petri Dish</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>C351029</td>
			<td>100&#215;15mm, use to grow strains to single colonies on solid rich media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Anhydrous, Powder</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-1</td>
			<td>Use at 30 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar, Granuated</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>214530</td>
			<td>Use at 20 g/L to make solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na2-EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris Inc.</td>
			<td>S220</td>
			<td>Alternatively, use QSonica Q800R sonicator/DNA and chromatin shearing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Data Collection and Analysis Software</td>
			<td>Biotek, Inc.</td>
			<td>GEN5SECURE</td>
			<td>Or equivalent, must be compatible with the micro-plate reader, use to export data readings from the micro-plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid 1N, Liquid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SA48-4</td>
			<td>Use to adjust pH to 5.5 in liquid and solid rich media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Rich Media (liquid YEA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Biotek, Inc.</td>
			<td>BTH1MG</td>
			<td>Or equivalent, must read visible light at 600nm wavelength range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rich Media agar plates (YEA plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30 g/L D-Glucose, 5 g/L Yeast Extract, 75 mg/L Adenine, 20 g/L Agar, pH adjusted to 5.5 with 1 M HCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A/T1 mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EN0551</td>
			<td>Use according to manufacturer recommendation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Polystyrene Inoculating Loop</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>OS101</td>
			<td>Or equivalent, use to transfer colonies from agar plates to 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile workspace and burners</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate, 96-well Optical Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Corning, Falcon</td>
			<td>C353072</td>
			<td>Or equivalent, must have optical flat bottom for micro-plate ready</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq DNA PCR-Free LT/HT Library Prep Kit</td>
			<td>Illumina, Inc.</td>
			<td>20015962</td>
			<td>Use to prepare the whole-genome sequencing library</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract, Powder</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Use at 5 g/L to make liquid and solid rich media (YEA)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a deep-sequencing-assisted, spontaneous suppressor screen in the fission yeast schizosaccharomyces pombe

En genetisk skärm för muterade alleler som hämmar fenotypiska defekter som orsakas av en mutation är en kraftfull metod att identifiera gener som tillhör närbesläktade biokemiska vägar. Tidigare metoder såsom syntetiska genetiska Array (SGA) analys och slumpmässig mutagenes tekniker med hjälp av ultraviolett (UV) eller kemikalier som etyl methanesulfonate (EMS) eller N-etyl-N-nitrosourea (ENU), har använts men är ofta kostsamma och mödosam. Även är dessa mutagen-baserad screeningmetoder ofta förknippade med allvarliga biverkningar på organismen, förmå flera mutationer som lägga till komplexiteten i isolera dämpning. Här presenterar vi ett enkelt och effektivt protokoll för att identifiera suppressor mutationer i mutanter som ger en tillväxt defekt i Schizosaccharomyces pombe. Av celler med en tillväxt brist i standard rika flytande media eller syntetiska flytande media lämplighet kan övervakas för återställning med en automatiserad plattan med 96 brunnar läsare under en längre period. När en cell förvärvar en suppressor mutation i kulturen, dess ättlingar konkurrera ut de av föräldrarnas cellerna. De återvunna celler som har en konkurrenskraftig tillväxt fördel över föräldrarnas cellerna kan sedan isoleras och backcrossed med föräldrarnas celler. De suppressor mutationerna identifieras sedan använda helgenom-sekvensering. Använder denna metod, har vi framgångsrikt isolerat flera dämpning att lindra de allvarliga tillväxt defekter som orsakas av förlust av Elf1, en AAA + familj ATPas som är viktigt i nukleära mRNA transport och underhåll av genomisk stabilitet. Det finns för närvarande över 400 gener i S. pombe med mutanter som ger en tillväxt defekt. Eftersom många av dessa gener är uncharacterized, föreslår vi att vår metod kommer att påskynda identifieringen av nya funktionella interaktioner med denna användarvänliga och hög genomströmning inställning.

Långsamt växande mutanter Visa fenotypiska återhämtning i flytande kultur Vi valde tre mutanter inblandade i en mängd biologiska spridningsvägar med en sjuk, långsamt växande, fenotyp: AAA familj ATPas Elf1, Histon Histondeacetylas Clr6 och Exon Junction komplexa komponenten Fal1. En vildtyp stam och stammar som transporterar mutationer av dessa tre gener som hade varit backcrossed med vildtyp stammar var strimmiga till enskilda kolonier och 16 enstaka kolonier var slumpmässigt utvalda att vara odlade i rika flytande media med plattan med 96 brunnar som beskrivs ovan. Tillväxtkurvor för enskilda kolonier registrerades vid den första tidpunkten (dag 0) och 6 dagar med kontinuerlig övervakning med hjälp av plattan läsaren. Som väntat visar vildtyp kolonier inga märkbara förändringar i deras tillväxtkurvor hela experimentet31 (figur 1). Noterbart i fyra kolonier med elf1∆ bakgrund och en fal1∆ koloni visar en dramatisk förändring i tillväxt från långsamt växande till några olika nivåer av tillväxt, liknande eller nära vildtyp kolonier. Dramatiskt, Visa alla clr6-1 mutanter en konsekvent fenotypiska återhämtning, växer snabbare i slutet av den assay31 (figur 1). För att karakterisera de olika fenotyperna, hänvisar vi till de ursprungliga stammar som växer långsamt ”P stammar” (eller föräldrarnas stammar) och till de stammar som visar fenotypiska återhämtning som ”S stammar” (eller undertryckta stammar). Observera att figur 1 är ett exempel på en runda av screening experiment, och representerar inte de totala icke-kompletterande dämpning identifieras och sekvenserade i följande representativa resultat.
Fenotypiska återhämtning kan tillskrivas ärftliga egenskaper S. pombe kan växa som en haploid i rika medier, men två haploida stammar med kompletterande parning typer mate under kväve svält. Meios i fission jäst innebär en omgång dubbelarbete följt av två rundor av celldelning. Den sexuella cykeln resulterar i bildandet av fyra haploida sporer bär det genetiska materialet i föräldrarnas stammen med 2:2 avskiljning av genetiska egenskaper följer reglerna i klassisk Mendels genetik (figur 2A). När odlas på samma platta för samma belopp av tid, bekräftat vi 2:2 segregation när back-korsning alla undertryckta stammar (S stammar) med sina föräldrars stammar (P stammar), vilket resulterade i 2 små (tillväxt defekt) och 2 stora (suppressor fenotyp) kolonier. Enskilda exempel för undertryckta elf1∆, clr6-1 och fal1∆ celler visas i figur 2B. Vi har bekräftat att alla isolerade S stammar bär en monogena genetiska element som undertrycker den långsam växande fenotypen av deras P-stammar (inga data anges).
Helgenom-sekvensering identifierar framgångsrikt suppressor mutationer Som exempel använde vi Parade-end hela Genomsekvensering för att identifiera de genetiska element som är ansvarig för fenotypisk återhämtningen i elf1∆ S stammar. En mer fullständig beskrivning av dataanalys är tillgängliga online31. Kort, vi anställt biologiska exemplar av två självständigt genererade elf1∆ P stammar och biologiska dubbletter av fem icke-kompletterande grupper av elf1∆ S stammar, som alla innehåller olika dämpning. Efter att vi fått en lista över kommenterad varianter från bioinformatik analys (6,1-10), prioriterat vi vissa klasser av varianter som var relevanta för vår analys. Vi fokuserar på identifiering av konsekvent genomiska förändringar som var identiska i alla de biologiska replikat av enskilda elf1∆ S stammar jämfört med deras föräldrars elf1∆ P -stammar (figur 3 och kompletterande tabeller 1-4 ). Vi har identifierat fem nonsynonymous ändringar på CD-skivor regioner i alla fem olika elf1∆ S stammar, och rli1 +, SPBPJ4664.02, cue2 + rpl2702 +. Både S-A1 och S-A2 innehåller muterade SPBPJ4664.02, även om mutationerna inträffar på olika aminosyror. Eftersom SPBPJ4664.02 är en lång gen (11,916 nukleotider) med hundratals repetitioner, har mutationer kunnat bekräftas av utför PCR följt av sekvensering. S-A3 innehåller en radering mutant i rli1 som är konsekventa i både biologiska dubbletter. Muterat dock inte samtidig segregera med S fenotypen i elf1∆ bakgrund. Vi har identifierat en cue2 mutant (cue2-1) i S-B1, med aminosyror 396-400 saknas. S-B2 innehåller en rpl2702 mutant (rpl2702-1), som ändrar aminosyra vid position 45 från Glycine till aspartat31. Både cue2-1 och rpl2702-1 bekräftades som elf1∆ dämpning som visas nedan.
Genetiska bekräftelse av identifierade suppressor mutationer kontrollerar heritabilityen av återhämtning fenotypen Två av de identifiera nonsynonymous förändringarna, cue2-1 och rpl2702-1, rekonstruerades i labbet använder standardprotokoll för webbplats riktad mutagenes. Dubbelrum mutant stammar cue2-1 elf1∆ Persson och rpl2702-1 elf1∆ P korsades med gratis elf1∆ P stam31 (figur 4). Om de nonsynonymous mutationer, identifieras genom denna skärm, var tillräckliga för att undertrycka elf1∆ P, skulle sedan de resulterande tetrads Visa ett 2:2 små till stora förhållande i kolonierna följd 4 sporer i varje triaden. Faktiskt, genetiska korsning visade att de identifiera suppressor-mutationerna är framgångsrika i undertrycka den långsam växande fenotypen av elf1∆ P och är ärftlig.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig1v2.jpg"> Figur 1: fenotypisk återhämtning kan övervakas genom inspelning tillväxtkurvor i en Plattläsare. Sexton enstaka kolonier av vildtyp (WT), elf1∆, clr6-1och fal1∆ placerades i en plattan med 96 brunnar. Tillväxtkurvor spelades in under en 24-h kolonier var åter utspädda dagligen i rika medier. Tillväxt felet är uppenbart av låg absorbans (O.D.) i slutet av perioden 24 h på dag 0. Fenotypiskt återvunna stammar är de som visar en tillväxtkurva liknande, eller nära, som av vildtyp under perioden 24-h på dag 6. Fyra kolonier av elf1∆, en koloni av fal1∆och alla kolonier av clr6-1 visade olika nivåer av fenotypiska återhämtning efter 6 dagar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig2v2.jpg"> Figur 2: genetiska korsning kan bekräfta att den fenotypiska återhämtningen är tillskrivs en enda ärftliga allel. (A) när fission jäst celler utsätts för kväve svält, två haploida celler med en kompletterande parning typ kan generera en zygot som sporulates för att generera en tetrad av 4 sporer. Föräldrarnas genetiska material kommer att segregera under meios följa reglerna för Mendels genetik. (B) fenotypiskt återhämtade sig kolonier (märkt S, för undertryckt) med anges föräldrarnas genotyper var tillbaka-korsade med sin gratis Föräldrakontroll koloni (som visar inga fenotypiska återhämtning, märkt P, för föräldraledighet). Genetiska korsar visar 2:2 små (dålig kondition) till stort (återvunna fitness) kolonier visar att fenotypiska återhämtningen är ärftligt och kan hänföras till ett enda genetiska element. Röda boxar är kolonier bärare den suppressor-allelen, och blå rutor är kolonier som bärare av den föräldra-allelen. Denna siffra har ändrats från Marayati et al., 201831. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig3v2.jpg"> Figur 3: analys av genome-wide sekvensering data att identifiera genetiska element ansvarar för fenotypisk återhämtning. Tre biologiska replikerar två föräldrars ”P” stammar (P-A och P-B), och två biologiska replikat fem fenotypiskt återvinns bytte ”S” stammar (S-A1, S-A2 och S - A3 återhämtat sig från P-A; S-B1 och S-B2 från P-B), var sekvenserade och mutationerna organiserades som en lista över varje mutation i återvunna stam jämfört med föräldrarnas stam genomet det härleddes från (t.ex. p vs S-A1, etc.). Det totala antalet identifierade mutationer över hela genomet av alla sådana parvisa jämförelser var 660. Sammanlagt 44 mutationer identifierades när bara mutationer som förekommer i båda biologiska replikat av samma ”S” stam valdes. Av 44 mutationer var 12 mutationer infogning/borttagning (DITSATTA) eller icke - synonymt mutationer. Av 12 DITSATTA eller icke-synonymt mutationer, fem inträffade i proteinet kodande sekvens. De fem mutationerna potentiellt korrelerar med det enda genetiska elementet ansvarar för de fenotypiskt återvunna stammarna: en icke-synonymt mutation i SPBPJ4664.02 Funna i S-A1 och S-A2, DITSATTA i rli1 Funna i S-A3, DITSATTA i cue2 i S-B1 och icke-synonymt mutationer i rpl2702 Funna i S-B2. Detaljerad sekvensinformation om mutationer och filtrerade bakgrunden ingår i kompletterande tabeller 1-4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59133/59133fig4v2.jpg"> Figur 4: bekräftelse av de dämpning som identifieras genom helgenom-sekvensering. Resultat från helgenom-sekvensering bekräftades genom att självständigt skapa mutationer och utföra genetiska korsar för att bekräfta den fenotypiska återhämtningen genom att korsa en elf1∆ cue2-1 stam med elf1∆ P stam och elf1∆ rpl2702-1 med elf1∆ P stam. Tre representativa vertikala tetrads visas. Röda boxar är dubbel-mutanta kolonier (elf1 cue2-1, eller elf1 rpl2702-1); blå rutor är elf1∆ kolonier. Denna siffra har ändrats från Marayati et al., 201831. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/59133fig4v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande tabell 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta tabellen.</a> 
Kompletterande tabell 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta tabellen.</a> 
Kompletterande tabell 3 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta tabellen.</a> 
Kompletterande tabell 4 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Table_4.xlsx" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta tabellen.</a> 
Kompletterande kodning filer . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59133/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner filerna.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe at JoVE.com

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Vi presenterar en enkel suppressor skärmen protokoll i fission jäst. Denna metod är effektiv, mutagen-fri och selektiv för mutationer som ofta uppstår på en enda genomisk locus.  Protokollet är lämplig för att isolera dämpning som lindrar tillväxt defekter i flytande kultur som orsakas av en mutation eller en drog.

En djup-sekvensering-assisted, spontana Suppressor skärm i den Fission jäst Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv suppressor skärmen för att identifiera suppressor mutationer i mutanter som har en tillväxt defekt i fission jäst. Traditionella mutagenesis metoder använder giftiga kemikalier eller UV som kan generera flera mutationer i en cell. Omvänt kan detta protokoll berika en enda suppressor mutant i enskilda celler utan att använda mutation inducerande metoder.Inled denna procedur med stamkonstruktion och preparering enligt beskrivningen i textprotokollet. Tillsätt 200 mikroliter av flytande media till varje brunn av en 96-väl polystyren mikroplatta. Med en steril applikator, ta en liten mängd av var och en av de beredda kolonierna och suspendera varje koloni i enskilda brunnar som innehåller de flytande medierna.Inkludera en tom brunn för varje rad på plattan som innehåller 200 mikroliter av samma media. Nu ställa in protokollet på plattan läsaren upptäckt programvara ansluten till en automatiserad mikroplattläsare. Ställ in temperaturen på 30 grader Celsius och ställ in ett kinetiskt program i 24 timmar med avläsningsfrekvens på två minuter.Detta resulterar i 721 totalt läser över en 24-timmarsperiod per brunn. Ställ in skakningen på kontinuerlig snabb omloppsbanor. Ställ in de optiska avläsningarna för att mäta ljusspridning vid en våglängd på 600 nanometer för att mäta optisk densitet och ställ in ljuset för att läsa underifrån plattan.Efter 24 timmar, spela in den slutliga tomma optiska densiteten avläsningar och använda formeln i textprotokollet för att bestämma den volym som behövs för att späda ut var och en av proverna ner till en optisk densitet av 0,1. För att batch process utspädningsvolymen som ska användas från varje experimentell brunn, exportera data från plattan läsaren programvara och använda ett kalkylblad programvara för att infoga samma formel som en funktion. Varje dygn, använd samma media som dag noll för att späda ut vart och ett av proverna till en optisk densitet på 0,1 med hjälp av formeln.Se till att använda formeln för att späda alla brunnar ner till en optisk densitet på 0,1. Detta inkluderar de brunnar som kan ha börjat visa en viss återhämtning i sin tillväxt defekt. Spara alla tillväxtkurvor som genereras dagligen.Notera varje enskild koloni som visar en ökad tillväxttakt som bedöms av en slutlig optisk densitet som är betydligt högre än resten av kohorten med samma genetiska bakgrund eller av en tillväxtkurva som liknar den för vilda typkolonier. Denna analys tar vanligtvis cirka sju till 14 dagar. Utför alla steg under sterila förhållanden.Från den sista dagen av plattan läsaren analysen, vissa flytande kulturer har en märkbart återhämtat tillväxthastighet förmodligen genom att få en suppressor mutation som kan lindra fenotyp av föräldrarnas mutation. För att lagra de fenotypiskt återvunna kulturerna, överför och blandar 250 mikroliter av flytande kultur till en kryorör som innehåller 250 mikroliter av 50%glycerol. Flash frysa cellerna i flytande kväve och spara stammarna i minus 80 grader Celsius på obestämd tid.För att bekräfta att suppressormutationen är ett genetiskt ärftligt element, använd vanliga genetiska korsningsmetoder för att korsa dina favoritmuterade P-celler med dina favoritmuterade S-celler. När två haploida celler med en gratis parningstyp blandas och utsätts för kvävesvält, kan de generera en zygot som sporulates för att bilda en tetrad av fyra sporer. Föräldrarnas genetiska material kommer att segregera under meios efter reglerna för Mendelian genetik.Efter sporulation kan enskilda sporer från samma tetrader dissekeras och bilda fyra enskilda kolonier som observerats vertikalt på en platta. Jämnt placera sporerna en efter en på plattan med hjälp av en mikrodocka. Efter dissektion, lämna cellerna att växa i en 30 grader Celsius inkubator i några dagar tills kolonier visas.Om suppressormutationen är ett genetiskt ärftligt element, bör detta kors ge tetrader där två kolonier har den sjuka fenotypen av föräldrastammen och två kolonier har suppressorstammens återhämtningstillväxt. Plocka tre kolonier med suppressor fenotyp och tre kolonier med föräldrarnas fenotyp från samma genetiska kors och fortsätt med den genomiska DNA extraktion och sekvensering steg som beskrivs i textprotokollet. Utför sedan bioinformatikanalys för identifiering av suppressormutationerna som detaljerade i texten.Tillväxtkurvor av enskilda kolonier registrerades vid den inledande tidpunkten och under sex dagar med kontinuerlig övervakning med hjälp av plattläsaren. Som väntat visar vilda typkolonier inga märkbara förändringar i sina tillväxtkurvor under hela experimentet. Noterbart är att fyra kolonier med alv1-raderingsbakgrund och en fal1-deletionskoloni visar en dramatisk förändring i tillväxten från långsamt växande till några varierande tillväxtnivåer liknande den hos vilda typkolonier.Dramatiskt, alla clr6 mutanter visar en konsekvent fenotypisk återhämtning växer i en snabbare takt i slutet av analysen. Två av de identifierade icke-synonyma förändringar, cue2 mutationen och rpl2702 mutationen rekonstruerades i labbet med hjälp av standardprotokoll för plats riktad mutagenesis. Cue2 elf1 dubbla mutanter och rpl2702 elf1 dubbla mutanter korsades med den kostnadsfria elf1 borttagning mutant stam.Genetisk korsning visade att de identifierade suppressor mutationer är framgångsrika i undertrycka den långsamt växande fenotyp av elf1 borttagning mutant och är ärftliga. Under den dagliga utspädningen av 96-brunnsplattan är det viktigt att späda ut alla brunnar till samma koncentration för att undvika artificiell tillväxtåterhämtning. Denna metod gör det möjligt att isolering av suppressor mutationer i en hög genomströmning sätt påskynda upptäckten av hundratals gener som inte har väl karakteriseras i fission jäst och andra mikroorganismer.Denna metod kan användas för att isolera suppressorer för alla mikroorganismer som har mutation som orsakar tillväxtdefekt och som kan odlas till en stor population i flytande kultur. Identifiera suppressor mutationer i fission jäst kan ha potentiella konsekvenser för att hitta sjukdomsframkallande gener i överlappande vägar, särskilt när det gäller mycket bevarade vägar från jäst till människor.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målinriktad<em&gt; In situ</em&gt; mutagenes av Histon Gener i knoppande jäst

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Mäta mRNA nivåer över tid under den jäst S. cerevisiae hypoxisk svar

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Poolade shRNA skärm för reaktivering av MeCP2 på inaktiva X-kromosomen

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen-riktade slumpmässig mutagenes att välja Heterokromatin-destabiliserande proteasom mutanter i Fission jäst

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Datoriserad analys av sekvensdata från Batch jäst 2-Hybrid skärmar

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parning-baserade överuttryck bibliotek Screening i jäst

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Använda i Vitro och i cell form att undersöka småmolekylära inducerad Pre-mRNA strukturella förändringar

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Karaktärisera Histon posttranslationella modifieringen förändringar i jäst neurodegenerativa Proteinopathy modeller

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Att fastställa ägg befruktning Bemisia tabaci med en Cytogenetisk teknik

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...