Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Kalyani Muhunthan for assistance i laboratorieprocedurer, Lee Opdahl for hvede genotype høst, Washington State Concord Grape Research Council og Washington State University Center for opretholdelse af landbrug og Naturlige ressourcer for en BIOAg tilskud til støtte for dette arbejde. Yderligere støtte blev leveret af USDA/NIFA gennem lugen projekt 1014527.

Bemærk: Placeringen af feltet Site: Washington State University, plante patologi Farm (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). Frø blev sået ved hjælp af en mekanisk plantageejer på 19 oktober 2017. Hver hvede genotype blev plantet i headrows, ca 1 meter fra hinanden til at undgå overlapning af rodsystemet. Plante og jord prøver blev indsamlet på August 9, 2018, når planterne er klar til høst. Prøverne blev indsamlet fra tre replikater af fire hvede genotyper: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
<p class="...

<ol>
	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biology+of+siderophores.">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li><li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophores+and+their+potential+applications:+a+review.">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li><li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+(PGPR):+emergence+in+agriculture.">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li><li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics,+Siderophore+Production,+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+&#39;Concord&#39;+Grape+Vineyards.">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from &#39;Concord&#39; Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , (2018).</li><li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway.">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li><li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity,+Abundance,+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi.">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung.">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li><li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li><li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production.">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li><li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus.">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li><li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay.">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li><li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).</li><li>Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).</li><li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria.">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9 (2017).</li><li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes.">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li><li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux.">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li><li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter.">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li><li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+Structure,+Species+Variation,+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+(Triticum+aestivum)+Cultivars.">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li><li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

Det primære resultat af dette arbejde er produktion af en ny metode, der kan bruges til hurtigt berige for siderophore producerer mikrober mens kvantitativt måling siderophore produktion/aktivitet i den miljømæssige prøve. Metoden er hurtig, enkel og omkostningseffektiv, og resultaterne viser, hvordan det kan bruges til at registrere siderophore aktivitet fra komplekse og roman prøve typer (e.g., jord og plante væv). Protokollen også resulterer i produktionen af glycerol lagre af berigelse kulturer, som ...

Siderophores er vigtige biomolekyler involveret primært i jern-kelation for biotilgængelighed, men med en lang række yderligere formål i terrestriske og akvatiske økosystemer spænder fra mikrobielle quorum sensing, signalering til mikrobiel plante-værter, plante vækstfremmende, samarbejde og konkurrence inden for komplekse mikrobielle samfund1,2. Siderophores kan groft inddeles efter deres aktive steder og strukturelle træk, oprettelse af fire grundlæggende typer: carboxylat, hydroxamate, catecholate, og blandede typer3,4. Mange mikroorganismer er i stand til at udskille mere end én type af siderophore5 og i komplekse samfund, et stort flertal af organismer biosynthesize membranreceptorer at tillade optagelsen af en endnu bredere vifte af siderophores1, 6. Seneste arbejde viser, at siderophores er særligt vigtigt på fællesskabsplan, og selv i Inter Kongerige kommunikation og biogeokemiske overførsler7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol f.eks (CAS) er blevet brugt i over 30 år som en chelatdanner til at binde jern (Fe) på en sådan måde, at tilsætning af ligander (dvs. siderophores) kan resultere i dissociation af CAS-Fe komplekset, skaber en let identificerbare farveskift på mellemlang 12. når the CAS er bundet med Fe, farvestoffet vises som en royal blå farve, og som CAS-Fe kompleks dissocieres, medium skifter farve afhængigt af ligand bruges til at skyllepumpetab Fe13. Den indledende, væskebaseret medium etableret af Schwyn og Neilands i 1987, er blevet ændret på mange måder at imødekomme skiftende mikrobielle mål14, vækst vaner og begrænsninger15, samt en lang række metaller udover Fe, herunder aluminium, mangan, kobolt, cadmium nikkel, lithium, zink16, kobber17, og endda arsen18.
Mange menneskelige patogener, så godt som plant vækst fremme mikroorganismer (PGPM) er blevet identificeret som siderophore-producerende organismer3,19,20, og vigtige rhizosfære og endophytic PGPM ofte teste positivt for siderophore-produktion4. Den traditionelle Fe-baseret flydende metode er blevet tilpasset til mikrotiter afprøvning af isolater i dyrkning for siderophore produktion21. Men disse teknikker undlader at erkende betydningen af den mikrobielle samfund som helhed (microbiome), i samarbejde og potentielle regulering af siderophore produktion i jord og plante systemer22. Derfor har vi udviklet en høj overførselshastighed fællesskabsplan vurdering af siderophore produktion fra et bestemt miljø, baseret på traditionelle CAS analysen, men med replikering, nem måling, pålidelighed og repeterbarhed ved en mikrotiterplade assay.
I denne undersøgelse præsenteres en omkostningseffektiv, høj overførselshastighed CAS-Fe assay til påvisning af siderophore produktion for at vurdere berigelsen af siderophore produktion fra komplekse prøver (dvs. jord og plante væv homogeniseret). Bulk, løst bundet og stramt bundet rhizosfære jord (med hensyn til hvordan jorden var bundet til roden) blev opnået sammen med korn, skyde og root væv fra fire forskellige hvede (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, og PI561727. Det var den hypotese, at grundlæggende forskelle i hvede genotyper kan resultere i forskelle i rekruttering og udvælgelse af siderophore producerer Fællesskaber. Af særlig interesse er forskellen mellem mikrobielle samfund tilknyttet PI561725 isogene linje, som er aluminium tolerante, fordi det besidder ALMT1 (aluminium-aktiveret malat Transporter 1), sammenlignet med aluminium følsomme PI561727 isogene linje, som besidder en ikke-aluminium lydhør form af genet, almt123,24,25,26. Chief formålet med undersøgelsen var at udvikle en enkel, hurtig metode til kvantitativ vurdering af siderophore produktion i siderophore berigelse kulturer af komplekse prøve typer samtidig bevare kulturer for det fremtidige arbejde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

Siderophores (lav-Molekylær vægt metal chelaterende forbindelser) er vigtige i forskellige økologiske fænomen spænder fra jern (Fe) biogeokemiske cykling i jorder, at patogenet konkurrence, plante vækstfremmende og cross-Kongerige signalering. Siderophores er desuden også af kommercielle interesser i bioleaching og bioweathering af metalholdigt mineraler og malme. En hurtig, omkostningseffektiv og robust middel til kvantitativt at vurdere siderophore produktion i komplekse prøver er nøglen til at identificere vigtige aspekter af de økologiske konsekvenser af siderophore aktivitet, herunder, Roman siderophore producerer mikrober. Metoden præsenteres her blev udviklet for at vurdere siderophore aktivitet i takt microbiome Fællesskabers miljøprøver, som jord eller plante væv. Prøverne blev homogeniseret og fortyndes i en modificeret M9 medium (uden Fe), og berigelse kulturer blev udruget i 3 dage. Siderophore produktion blev vurderet i prøver på 24, 48 og 72 timer (h) ved hjælp af en roman 96-brønd mikrotiterplade CAS (Chrome azurol f.eks)-Fe agar assay, en tilpasning af den traditionelt kedelige og tidskrævende kolorimetriske metode til vurdering af siderophore aktivitet, udført på enkelte dyrkede mikrobielle isolater. Vi anvendte vores metode til 4 forskellige genotyper/linjer af hvede (Triticum aestivum L.), herunder Lewjain, Madsen, og PI561725 og PI561727 almindeligt dyrket i indre Pacific Northwest. Siderophore produktion var tydeligt påvirket af genotype hvede og i bestemte typer af plantevæv observeret. Vi har med held brugt vores metode til hurtigt skærmen for anlægget genotype indflydelse på siderophore produktion, en nøglefunktion i terrestriske og akvatiske økosystemer. Vi producerede mange tekniske replikater, giver meget pålidelige statistiske forskelle i jord og i plantevæv. Vigtigere, viser resultaterne den foreslåede metode kan bruges til hurtigt at undersøge siderophore produktion i komplekse prøver med en høj grad af pålidelighed, på en måde, der giver mulighed for lokalsamfund til at blive bevaret for det senere arbejde at identificere taxa og funktionelle gener.

En pyoverdine blanding biosynthesized af Pseudomonas fluorescens blev brugt som standard til at fortolke og kvantificere absorbans (på 420 nm) af prøver i form af pyoverdine ækvivalenter i µM. figur 1 viser forholdet mellem absorbans (420 nm) og starter koncentration af pyoverdine (Log10 molariteten i µM). EDTA ikke give en tilstrækkelig standard, fordi prøver udstillet større absorbans målinger end var opnåeligt med pyoverdine o...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Vi præsenterer en protokol til hurtig screening af miljøprøver for siderophore potentielle bidrag til mikronæringsstoffer biotilgængelighed og omsætning i jordbaserede systemer.

Høj overførselshastighed Siderophore Screening fra miljøprøver: plante væv, Bulk jord og rhizosfære jord

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophores er lav molekylvægt, metal-chelaterende biomolekyler involveret i jern cykling i miljøet. Denne protokol giver mulighed for hurtig høj vurdering af siderophore aktivitet i jord og planteprøver. Tidligere metoder til siderophore detektion har elimineret det afgørende miljø i det mikrobielle samfund.Vores teknik gør det muligt at detektion i det relativt intakte mikrobielle samfund og det levested, som det involverede. Fordi jern tilgængelighed er afgørende for landbrugets produktivitet, så i denne protokol kunne bruges til at undersøge den rolle, mikrober i modulering tilgængeligheden af jern til planter. Desuden kan denne metode anvendes til at vurdere virkningen af landbrugsforvaltningspraksis på jordbundens sundhed og siderophore-producerende samfund samt udviklingen af sådanne samfund over tid.Til at begynde, syre vaske alt glas i 100 millimolar saltsyre 100 millimolar salpetersyre i mindst to timer før udnyttelse i CAS-analysen. Forbered en aluminium bradepande fyldt med laboratorie-grade sand og dække det med aluminiumsfolie. Autoklave ved 121 grader Celsius i 30 minutter og der er afsat.Forbered HDTMA ved at tilføje 0365 gram til 20 milliliter dobbelt deioniseret vand, og placer opløsningen i et vandbad ved 37 grader Celsius for at fremme opløselighed. Der tilsættes 0302 gram CAS til 25 milliliter dobbelt deioniseret vand, mens der forsigtigt omrøres med en steril magnetisk rørestang. Derefter tilsættes fem milliliter en molære jernchlorid hexahydrat til de 25 milliliter CAS opløsning, mens du fortsætter med at forsigtigt røre.Tilsæt nu langsomt de 20 milliliter HDTMA-opløsning i jern-CAS-kompleksopløsningen under forsigtigt omrøring. Pufferopløsningen klargøres ved at opløse 15,12 gram rør i 375 milliliter dobbeltdeioniseret vand ved forsigtigt omrøring. PH-chlor. 200 kr. justeres til 6,8 med fem molarnatriumhydroxid.Derefter tilsættes vand for at bringe volumen til 450 milliliter. Nu tilsættes fem gram agarose til løsningen. Autoklave PIPES bufferløsningen og jern-CAS-kompleksløsningen ved 121 grader Celsius i 30 minutter.Tilsæt forsigtigt hele cas-jernløsningen til hele PIPES-bufferen i biosikkerhedsskabet, efter at hver af dem er blevet autoklaveret. Ansvar den blandede opløsning i et vandbad ved 50 grader Celsius. Læg nu en steril reagensbåd i det sterile sand i biosikkerhedsskabet og varmer til 50 grader Celsius.Overfør jern CAS kompleks agar til båden, derefter hurtigt aliquot 100 mikroliter til hver brønd af en klar fladbundet steril 96-godt mikroplade. Forbered 800 micromolar pyoverdine standard i tidligere forberedt modificeret M9 medium. Opløsningen fortyndes i 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 mikromolære opløsninger.Der tilsættes EDTA til 500 milliliter tidligere forberedt modificeret M9-medium for at forberede 3,2 millimolar EDTA-standarden. Denne opløsning fortyndes til 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 mikromolære opløsninger. For at generere en standardkurve tilsættes 100 mikroliter af hver koncentration af pyoverdin og EDTA for at adskille brønde af en 96-brønd mikroplade indeholdende 100 mikroliter jern CAS-kompleks agarmedium.Lav dublerede tekniske replikater af hver koncentration. Også tilføje tomme brønde med kun M9. Ved hjælp af en mikropladelæser måles absorbans efter en, seks og 24 timers inkubation ved 22 grader Celsius, og brug absorbansmålinger til at generere standardkurver. Prøvetagningsudstyret vaskes med 22 mikronfilter dobbelt deioniseret vand efterfulgt af 70 % ethanol, og tør det med papirservietter.Vaskfør vask før prøveudtagning og ind mellem prøverne for at opretholde steril teknik og reducere krydskontaminering. Efter udadspærring af plantevæv og udgrave en lille rodkugle fra planter i marken, skal rodkuglen anbringes i en separat mærket plastpose til prøveadskillelse i laboratoriemiljøet. Alle prøverne skal være placeret direkte på isen og opbevares ved fire grader Celsius, indtil prøverne forarbejdes til produktionsanalysen i siderophore.Separat rod forbundet jordprøver i bulk, løst bundet rhizosfære jord og tæt bundet rhizosfære jord. For at gøre dette, tage roden bolde ud af poserne og forsigtigt ryste jord fra roden bolden. Rystet jord, sammen med jorden tilbage i posen, omfatter bulk jord.Dette er den løst bundet rhizosfærejord. Generer tæt bundet rhizopshere jord ved at tage rødder med den tæt bundne prøve og sætte dem i en centrifuge rør. Tilsæt 30 milliliter dobbelt deioniseret vand og vortex i to til tre minutter.Fjern rødderne for at få den tæt bundne rhizosphere jord gylle fortynding. Homogeniser hver jordprøve i prøveemnerne ved at blande og dreje jorden så meget som muligt uden at åbne posen. Efter at hver prøve er blevet grundigt blandet, skal der udtages en prøve, der er udtaget til prøven, og to gram af hver jordprøve suspenderes i 20 milliliter modificeret M9-medium i et sterilt 50 millilitercentrifugerør.Prøven fortyndes, og forsegles derefter røret med et sterilt skumstik for at tillade befrugtning. Ved tæt bundne rhizosfæreprøver tilsættes to milliliter af jordslamlen af rhizosphere til 20 milliliter modificeret M9-medium i et sterilt 50 millilitercentrifugerør. Prøven fortyndes, og forsegles derefter røret med et sterilt skumstik for at tillade befrugtning.For at forberede vævsprøven, overflade sterilisere roden, skyde, og korn med 70% ethanol. Macerate to gram frisk væv i 20 milliliter modificeret M9 medium ved hjælp af en blender på høj i 30 sekunder. Derefter overføres prøven til et sterilt 50 milliliter centrifugerør, fortyndes, og forsegle røret med et sterilt skumstik.At berige produktionen af siderophore gennem jernbegrænsning inkubere de 50 millilitercentrifugerør ved stuetemperatur og ryste ved 160 omdr./min. Ved 24, 48 og 72 timer efter påbegyndelse af berigningskulturen fjernes en milliliterdelprøver fra berigelsesrørene ved hjælp af steril teknik. Centrifuge subsamplerne ved 10,000 gange G i et minut i to milliliter centrifuge rør til pelletize cellerne.Ved hjælp af steril teknik tilsættes 100 mikroliter af supernatanten til en 100 mikroliteropløsning af jern CAS-kompleks agar i to eksemplarer eller tre eksemplarer i mikropladen. Der tilsættes også 100 mikroliter sterilt M9-medium som emner. Derefter inkubere pladen ved 28 grader Celsius.Hver plade skal forsegles og dækkes med folie før placering i rugemaskinen. Den resterende supernatant og pellet for hver prøve anbringes i sit eget sterile centrifugerør med to milliliter. Tilsæt 400 mikroliter steril glycerol i hver prøve supernatant rør og re-suspendere pellet at skabe glycerol bestande.Frys bestanden ved minus 80 grader Celsius til senere analyse. Absorbansen måles ved seks, 24, 48 og 72 timer ved en bølgelængde på 420 nanometer. En pyoverdinblanding biosyntetiseret af Pseudomonas fluorescens blev anvendt som standard til at fortolke og kvantificere absorbans af prøver i prøver af pyoverdinækvivalens i mikromolar.Forholdet mellem absorbans ved 420 nanometer og startkoncentrationen af pyoverdin er vist her. Siderophore aktivitet af 72 timers berigelse blev vurderet til 48 timers inkubation for at bestemme indflydelsen af genotype og prøvetype på sideophore isolation. Sidesoof aktiviteten i bulkjordprøver var forholdsvis lav og udviste ikke forskelle mellem den hvedegenotype, hvorfra der blev udtaget prøver af bulkjord.Men berigelser af løst bundet jord isoleret fra 725 genotype udstillet større siderophore produktion i forhold til løst bundet jord fra Madsen og 727, men ikke fra Lewjain. Omvendt var siderophore-produktionen i berigelser fra tæt bundet jord ikke stærkt påvirket af genotype. Berigelseskulturer af kornvæv gav relativt lav siderophoreproduktion uanset genotype.Berigelse af Lewjain skyde væv havde betydeligt lavere siderophore produktion end de andre genotyper, og 725 skyde væv kulturer resulterede i mere variabel siderophore produktion. Den største forskel i siderophore aktivitet blev observeret i rodvæv berigelse kulturer, hvor 725 havde mere end 200% større siderophore aktivitet end alle andre genotyper. Et af de mest beskattende aspekter af udførelsen af protokollen er at opretholde aseptiske betingelser, mens du udfylder de mange trin til at generere CAS jern agar mikroplade og test prøver til sideophore aktivitet.En bred vifte af kromatografiske kultur-baserede eller DNA-baserede teknikker kan anvendes enten til den faktiske microtiter godt eller glycerol bevaret kultur for yderligere biokemiske tests eller genetisk karakterisering og metabolisk modellering. Ved at bruge denne protokol siderophore aktivitet kan senere være forbundet med specifikke organismer er ansvarlige for denne aktivitet eller efterfølgende målrettet som en mekanisme til større økologiske virkninger. Denne protokol kan let ændres for at vurdere produktionen af siderophore i tilsætningskulturer fra prøver, der er indsamlet fra andre miljørum, herunder luft, vand og sedimenter.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestemmelse af Mikrobiel Extracellular enzymaktivitet i Vand, Jord og sediment ved hjælp af High Throughput Mikropladekrav Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Integreret Field Lysimetry og porevandet Sampling for vurdering af kemiske Mobilitet i jord og Etableret Vegetation

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Måling af Greenhouse Gas Flux fra landbrugsjorde Brug Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Fysisk Isolering af endosporer fra miljøprøver ved målrettet Lysis af vegetative celler

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

En Bending Test for Bestemmelse af Atterberg Plastic Grænse i Jordbunden

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Ekstraktion og analyse af Mikrobiel Phospholipid fedtsyrer i Jordbunden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Metoder til Soil Resampling at overvåge ændringer i de kemiske Koncentrationer af skovbundens

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensionel (3D)-trykt skabelon for High Throughput zebrafisk Embryo opstilling

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Prøveudtagning jord i en heterogen forskning Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

Combined Size and Density Fractionation of Soils for Investigations of Organo-Mineral Interactions

Samlet størrelse og tæthed fraktionering af jord for undersøgelser af Organo-Mineral interaktioner

Combined size and density fractionation (CSDF) is a method used to physically separate soil into fractions differing in particle size and mineralogy. CSDF ...