Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

De auteurs bedank Kalyani Muhunthan voor hulp bij het laboratorium procedures, Lee Opdahl voor het oogsten van tarwe-genotype, de Washington State Concord druif Research Council en de Washington State University Center voor duurzame landbouw en Natuurlijke middelen voor een BIOAg verlenen om dit werk te ondersteunen. Aanvullende financiering werd verstrekt door de USDA/NIFA via Hatch-project 1014527.

Opmerking: Locatie van veld-Site: Washington State University, Plant Pathology boerderij (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4 ' W). Zaden werden ingezaaid met behulp van een mechanische planter op 19 oktober 2017. Het genotype van elke tarwe werd geplant in headrows, ongeveer 1 meter uit elkaar overlappende van wortelsysteem te vermijden. Planten- en grond monsters werden verzameld op 9 augustus 2018, wanneer de planten klaar voor oogst waren. Monsters werden verzameld uit drie replicaat-organismen van vier tarwe genotypen...

<ol>
	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biology+of+siderophores.">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li><li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophores+and+their+potential+applications:+a+review.">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li><li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+(PGPR):+emergence+in+agriculture.">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li><li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics,+Siderophore+Production,+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+&#39;Concord&#39;+Grape+Vineyards.">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from &#39;Concord&#39; Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , (2018).</li><li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway.">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li><li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity,+Abundance,+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi.">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung.">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li><li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li><li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production.">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li><li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus.">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li><li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay.">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li><li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).</li><li>Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).</li><li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria.">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9 (2017).</li><li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes.">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li><li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux.">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li><li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter.">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li><li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+Structure,+Species+Variation,+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+(Triticum+aestivum)+Cultivars.">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li><li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

Het belangrijkste resultaat van dit werk is de productie van een nieuwe methodologie die kan worden gebruikt om snel verrijken siderofoor microben produceren tijdens het kwantitatief meten van siderofoor productie/activiteit in het milieu monster. De methodologie is snel, eenvoudig en kosteneffectief, en de resultaten laten zien hoe het kan worden gebruikt voor het detecteren van siderofoor activiteit van complexe en nieuwe monster typen (b.v.., bodem en plant weefsel). Het protocol ook resulteert in de producti...

Siderophores zijn belangrijke biomoleculen betrokken voornamelijk in ijzer-chelatie voor biologische beschikbaarheid, maar met een breed scala van aanvullende doeleinden in terrestrische en aquatische ecosystemen variërend van microbiële quorum sensing, signalering naar microbiële plant-hosts, plant groeibevorderaars, samenwerking en concurrentie binnen de complexe microbiële gemeenschappen1,2. Siderophores kan worden in grote lijnen ingedeeld volgens hun actieve sites en structurele kenmerken, maken van de vier basistypen: carboxylaat, hydroxamate, catecholate, en gemengde typen3,4. Vele micro-organismen kunnen afscheiden van meer dan één type van siderofoor5 en in complexe Gemeenschappen, een overgrote meerderheid van de organismen biosynthesize de membraan receptoren zodat de opname van een nog breder scala aan siderophores1, 6. Recent werk geeft aan dat siderophores met name van belang op communautair niveau, en zelfs in het Koninkrijk van de onderlinge communicatie en biogeochemische overdrachten7,8,9,10 zijn ,11.
Chroom azurol Boxmark (CAS) is gebruikt voor meer dan 30 jaar als een chelaatvormer te binden ijzer (Fe) op een zodanige wijze dat toevoeging van liganden (bijvoorbeeld siderophores) leiden dissociatie van het CAS-Fe-complex tot kan, het creëren van een herkenbaar kleurverandering in het medium 12. Wanneer de CAS is gebonden met Fe, de kleurstof wordt weergegeven als een Koninklijk blauwe kleur, en als de CAS-Fe-complex distantieert, het medium verandert van kleur afhankelijk van de soort ligand gebruikt voor het opruimen van de Fe-13. Het medium van het oorspronkelijke, op vloeistof gebaseerde opgericht door Schwyn en Neilands in 1987, is gewijzigd in veel opzichten voor wijzigen van microbiële doelstellingen14, groei gewoonten en beperkingen15, evenals een verscheidenheid van metalen naast Fe, met inbegrip van aluminium, mangaan, kobalt, cadmium, nikkel, lithium, zink16, koperen17en zelfs arseen18.
Veel menselijke pathogenen, zo goed als plant groei bevorderen van micro-organismen (PGPM) zijn geïdentificeerd als siderofoor-producerende organismen3,19,20, en belangrijke rhizosfeer en endophytic PGPM vaak testen positief voor siderofoor-productie4. De traditionele Fe-gebaseerde vloeibare methode is aangepast aan de microtiterplaat testen van isolaten in teelt voor siderofoor productie21. Echter deze technieken niet om te erkennen het belang van de microbiële Gemeenschap als geheel (de microbiome), in samenwerking en mogelijke regulering van de productie van siderofoor in bodem en plant systemen22. Om die reden hebben we een high-throughput Gemeenschapsniveau beoordeling van de siderofoor productie van een bepaald milieucompartiment, gebaseerd op de traditionele CAS assay, maar met replicatie, gebruiksgemak meting, betrouwbaarheid en herhaalbaarheid in een microplate assay.
In deze studie is een kosteneffectieve, hoge-doorvoer CAS-Fe-assay voor het opsporen van siderofoor productie bedoeld om te beoordelen van de verrijking van de siderofoor productie van complexe monsters (dat wil zeggen, bodem en plant weefsel homogenates). Bulk, losjes-gebonden en strak gebonden rhizosfeer bodem (in termen van hoe de bodem was gebonden aan de wortel) samen met graan, schieten en wortel weefsels uit vier verschillende tarwe (Triticum aestivum L.) genotypen werden verkregen: Madsen, Lewjain, PI561725, en PI561727. Het was veronderstelde dat fundamentele verschillen in de genotypen van tarwe kunnen leiden tot verschillen in werving en selectie van siderofoor productie van gemeenschappen. Van bijzonder belang is het verschil tussen microbiële gemeenschappen die zijn gekoppeld aan de isogene lijn van PI561725, die is aluminium tolerant omdat het bezit ALMT1 (aluminium-geactiveerde Malate Transporter 1), in vergelijking met de aluminium gevoelige PI561727 isogene lijn, die beschikt over een niet-aluminium responsieve vorm van het gen, almt123,24,25,26. Het hoofddoel van de studie was een eenvoudige, snelle methode van het kwantitatief beoordeling van productie van het siderofoor in siderofoor verrijking culturen van complexe monster typen met behoud van de culturen voor toekomstige werkzaamheden te ontwikkelen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

Siderophores (laag-moleculair gewicht metaal verbindingen chelaat) zijn belangrijk in verschillende ecologische fenomeen variërend van ijzer (Fe) biogeochemische fietsen in de bodem, pathogen competitie, plant groeibevorderaars en cross-Koninkrijk signalering. Bovendien zijn siderophores ook commerciële belangstelling voor bioleaching en bioweathering voor metalen mineralen en ertsen. Een robuuste, snelle en kosteneffectieve middelen van kwantitatief beoordeling siderofoor productie in complexe monsters is de sleutel tot het identificeren van belangrijke aspecten van de ecologische gevolgen van siderofoor activiteit, waaronder, roman siderofoor microben produceren. De methode die hier gepresenteerd is ontwikkeld om de siderofoor activiteiten beoordelen van in-tact microbiome Gemeenschappen, in milieu monsters, zoals grond of plantaardige weefsels. De monsters werden gehomogeniseerd en verdund in een gemodificeerde M9 medium (zonder Fe) en verrijking culturen werden geïncubeerd voor 3 dagen. Siderofoor productie in monsters op 24, 48 en 72 uur (h) met behulp van een roman 96-Wells-microplate CAS (Chrome azurol Boxmark) evalueerden-Fe agar assay, een aanpassing van de traditioneel vervelend en tijdrovend colorimetrische methode voor de beoordeling van siderofoor activiteit, uitgevoerd op afzonderlijke gecultiveerde microbiële isolaten. Wij onze methode aan 4 verschillende genotypen/lijnen van tarwe (Triticum aestivum L.), met inbegrip van Lewjain, Madsen, en PI561725 en PI561727 vaak geteeld in de binnenvaart Pacific Northwest toegepast. Siderofoor productie werd duidelijk beïnvloed door het genotype van tarwe, en met de specifieke soorten plantaardige weefsels waargenomen. We met succes onze methode gebruikt om snel scherm voor de invloed van plant genotype op siderofoor productie, een belangrijke functie in terrestrische en aquatische ecosystemen. Wij geproduceerd vele technische replicaten, opbrengst zeer betrouwbare statistische verschillen in de bodem en in plantaardige weefsels. Nog belangrijker is, blijkt de resultaten dat de voorgestelde methode kan worden gebruikt om snel siderofoor productie in complexe monsters te onderzoeken met een hoge mate van betrouwbaarheid, op een wijze waarmee gemeenschappen te behouden voor latere werk om taxa en functionele genen te identificeren.

Een pyoverdine mengsel levende door Pseudomonas fluorescens werd gebruikt als een standaard voor het interpreteren en kwantificeren van de extinctie (op 420 nm) van monsters in termen van pyoverdine equivalenten in µM. Figuur 1 toont de relatie tussen extinctie (420 nm) en het starten van de concentratie van pyoverdine (Log10 molarity in µM). EDTA verstrekten niet een voldoende mate omdat monsters tentoongesteld meer extinctie metingen d...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Presenteren we een protocol voor snelle screening van milieu monsters voor siderofoor potentieel bijdragen aan micronutriënt biologische beschikbaarheid en omzet in terrestrische systemen.

Siderofoor High-throughput Screening van milieu monsters: plantaardige weefsels, Bulk bodems en rhizosfeer bodems

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophores zijn laag moleculair gewicht, metaal-chelating biomoleculen die betrokken zijn bij ijzer fietsen in het milieu. Dit protocol maakt een snelle hoge doorvoerbeoordeling van siderophoreactiviteit in bodem- en plantenmonsters mogelijk. Eerdere methoden voor siderophore detectie hebben geëlimineerd de cruciale omgeving van de microbiële gemeenschap.Onze techniek maakt detectie binnen de relatief intacte microbiële gemeenschap en de habitat waarin het betrokken. Omdat ijzerbeschikbaarheid cruciaal is voor de productiviteit van de landbouw, kan dit protocol worden gebruikt om de rol van microben te onderzoeken bij het moduleren van de beschikbaarheid van ijzer voor planten. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de impact van landbouwbeheerpraktijken op de bodemgezondheid en zij-op-zijproducerende gemeenschappen en de ontwikkeling van dergelijke gemeenschappen in de loop van de tijd te beoordelen.Om te beginnen wast zuur al het glaswerk in 100 millimolar zoutzuur van 100 millimolar gedurende ten minste twee uur voorafgaand aan het gebruik in de CAS-test. Bereid een aluminium bakplaat gevuld met laboratorium-grade zand en bedek het met aluminiumfolie. Autoclave op 121 graden Celsius gedurende 30 minuten en gereserveerd.Bereid HDTMA door het toevoegen van 0365 gram tot 20 milliliter dubbel gedeïmiseerd water, en plaats de oplossing in een waterbad op 37 graden Celsius om oplosmiddel te bevorderen. Voeg 0302 gram CAS toe aan 25 milliliter dubbel gedeïsized water terwijl u zachtjes roert met een steriele magnetische roerstaaf. Voeg vervolgens vijf milliliter van een molair ijzerchloride hexahydraat toe aan de 25 milliliter CAS-oplossing terwijl u voorzichtig blijft roeren.Voeg nu langzaam de 20 milliliter HDTMA-oplossing toe aan de ijzer-CAS-complexe oplossing terwijl u zachtjes roert. Bereid de bufferoplossing voor door 15,12 gram PIPES op te lossen in 375 milliliter dubbel gedeïsized water met voorzichtig roeren. Pas de pH aan op 6,8 met vijf molaire natriumhydroxide.Voeg vervolgens water toe om het volume op 450 milliliter te brengen. Voeg nu vijf gram agarose toe aan de oplossing. Autoclave de PIPES buffer oplossing en de ijzer CAS complexe oplossing op 121 graden Celsius gedurende 30 minuten.Voeg zorgvuldig het geheel van de ijzer-CAS complexe oplossing toe aan het geheel van de PIPES buffer in de biosafety cabinet nadat elk van hen is geautoclaved. Plaats de gemengde oplossing in een waterbad op 50 graden Celsius. Plaats nu een steriele reagensboot in het steriele zand in de bioveiligheidskast en verwarm tot 50 graden Celsius.Breng het ijzer CAS complex agar naar de boot, dan snel aliquot 100 microliters aan elke put van een duidelijke platte bodem steriele 96-well microplaat. Bereid 800 micromolar pyoverdine standaard in eerder voorbereid gemodificeerd M9 medium. Verdun de oplossing in 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 micromolaroplossingen.Voeg EDTA toe aan 500 milliliter eerder bereid gemodificeerd M9-medium om de 3,2 millimolar EDTA-norm voor te bereiden. Verdun deze oplossing tot 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 en 6,25 micromolar oplossingen. Om een standaardcurve te genereren, voeg 100 microliter van elke concentratie pyoverdine en EDTA toe om putten van een 96-bron microplaat met 100 microliter ijzer-CAS-complex agar-medium te scheiden.Maak dubbele technische replicaties van elke concentratie. Voeg ook lege putten toe met alleen M9. Met behulp van een microplate-lezer meet u absorptie na één, zes en 24 uur incubatie bij 22 graden Celsius en gebruikt u absorptiemetingen om standaardcurven te genereren. Was de bemonsteringsapparatuur met 22 micron filter dubbel gedeïniseerd water gevolgd door 70% ethanol en veeg met papieren handdoeken.Voer de was uit vóór bemonstering en tussen de monsters om steriele techniek te behouden en kruisbesmetting te verminderen. Na het uitsnijden van plantenweefsels en het opgraven van een kleine kluit van planten in het veld, plaats de kluit in een aparte gelabelde plastic zak voor monsterscheiding in de laboratoriumomgeving. Plaats alle monsters direct op ijs en houd op vier graden Celsius totdat monsters worden verwerkt voor de siderophore productie test.Aparte wortel geassocieerde bodemmonsters in bulk, los gebonden rhizosfeer bodem en strak gebonden rhizosfeer bodem. Om dit te doen, neem de wortel ballen uit de zakken en zachtjes af te schudden grond van de kluit. Afgeschud grond, samen met de grond links in de zak, bestaan uit de bulk bodem.Dit is de losgebonden rhizosfeergrond. Genereer hier streng gebonden wortelstokbodem door wortels te nemen met het strak gebonden monster en ze in een centrifugebuis te stoppen. Voeg 30 milliliter dubbel gedeïniseerd water en vortex toe gedurende twee tot drie minuten.Verwijder de wortels om de strak gebonden rhizosfeer bodem drijfmest verdunning te krijgen. Homogeniseer elk bodemmonster in de monsterzak door de grond zoveel mogelijk te mengen en te draaien zonder de zak te openen. Nadat elk monster grondig is gemengd, aliquot en schort twee gram van elk bodemmonster in 20 milliliter gemodificeerde M9 medium binnen een steriele 50 milliliter centrifuge buis.Verdun het monster en sluit de buis af met een steriele schuimplug om beademing mogelijk te maken. Voor strak gebonden rhizosfeermonsters voegt u twee milliliter van de rhizosfeergronddrijfmest toe aan 20 milliliter gemodificeerd M9-medium in een steriele centrifugebuis van 50 milliliter. Verdun het monster en sluit de buis af met een steriele schuimplug om beademing mogelijk te maken.Om het weefselmonster voor te bereiden, steriliseert het oppervlak de wortel, schiet en graan met 70% ethanol. Macerate twee gram vers weefsel in 20 milliliter gemodificeerd m9 medium met behulp van een blender op hoog gedurende 30 seconden. Breng het monster vervolgens over op een steriele centrifugebuis van 50 milliliter, verdun en sluit de buis af met een steriele schuimplug.Om de productie van zijrope rij te verrijken door middel van ijzerbeperking de 50 milliliter centrifugebuizen bij kamertemperatuur en schudden bij 160 RPM. Op 24, 48 en 72 uur na het initiëren van de verrijkingscultuur, verwijder een milliliter submonsters uit de verrijking buizen met behulp van steriele techniek. Centrifugeer de submonsters op 10.000 keer G gedurende een minuut in twee milliliter centrifugebuizen om de cellen te pelletiseren.Voeg met behulp van steriele techniek 100 microliter van de supernatant toe aan een 100 microliteroplossing van ijzer-CAS-complex agar in duplicaat of drievoud in de microplaat. Voeg ook 100 microliter van steriel M9 medium als blanks. Dan incubeer de plaat op 28 graden Celsius.Elke plaat moet worden verzegeld en bedekt met folie voorafgaand aan plaatsing in de couveuse. Hang de resterende supernatant en pellet voor elk monster in zijn eigen steriele twee milliliter centrifugebuis. Voeg 400 microliter steriele glycerol toe aan elke monstersupernatant buis en schort de pellet opnieuw op om glycerolvoorraden te creëren.Vries het aandeel op min 80 graden Celsius voor latere analyse. Meet de absorptie op zes, 24, 48 en 72 uur op een golflengte van 420 nanometer. Een pyoverdine mengsel biosynthetiseerd door Pseudomonas fluorescens werd gebruikt als een standaard te interpreteren en te kwantificeren absorptie van monsters in monsters van pyoverdine equivalentie in micromolar.De relatie tussen absorptie op 420 nanometer en de startconcentratie van pyoverdine wordt hier getoond. Siderophore activiteit van de 72 uur verrijking werd beoordeeld bij 48 uur incubatie om de invloed van genotype en monstertype op siderophore isolatie te bepalen. De nevenactiviteit in bulkgrondmonsters was relatief laag en vertoonde geen verschillen tussen het tarwegenotype waaruit de bulkgrond werd bemonsterd.Verrijkingen van losgebonden grond geïsoleerd van het 725-genotype vertoonden echter een grotere siderophoreproductie in vergelijking met de losgebonden grond van Madsen en 727, maar niet van Lewjain. Omgekeerd werd de productie van siderophore in verrijkingen van strak gebonden grond niet sterk beïnvloed door genotype. Verrijkingsculturen van graanweefsel leverden een relatief lage zijropeproductie op, ongeacht genotype.Verrijkingen van Lewjain shoot weefsel had aanzienlijk lagere siderophore productie dan de andere genotypen, en 725 shoot weefsel culturen resulteerde in meer variabele siderophore productie. Het grootste verschil in siderophore activiteit werd waargenomen in wortelweefsel verrijking culturen waar 725 had meer dan 200% grotere siderophore activiteit dan alle andere genotypes. Een van de meest belastende aspecten van het uitvoeren van het protocol is het handhaven van aseptische omstandigheden, terwijl de voltooiing van de vele stappen om de CAS ijzer agar microplate en het testen van monsters voor siderophore activiteit te genereren.Een breed scala van chromatografische cultuur-gebaseerde of DNA-gebaseerde technieken kunnen worden toegepast, hetzij op de werkelijke microtiter goed of de glycerol bewaarde cultuur voor verdere biochemische tests of genetische karakterisering en metabole modellering. Door het gebruik van dit protocol kan siderophore-activiteit later worden gekoppeld aan specifieke organismen die verantwoordelijk zijn voor die activiteit of vervolgens worden gericht als een mechanisme voor grotere ecologische effecten. Dit protocol kan eenvoudig worden gewijzigd om de productie van zijropehoren te beoordelen in verrijkingsculturen die worden gegenereerd uit monsters die zijn verzameld uit andere milieucompartimenten, waaronder lucht, water en sedimenten.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Geïntegreerde Field Lysimetry en poriënwater bemonstering voor evaluatie van chemische Mobiliteit in de bodem en bestaande vegetatie

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Meting van Greenhouse Gas Flux uit landbouwgrond met statisch Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Fysieke Isolatie van Endospores van milieu monsters door Gerichte Lysis van vegetatieve cellen

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

Een Buigen Test voor het bepalen van de Atterberg Plastic Limiet in bodems

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extractie en analyse van Microbiële Phospholipid vetzuren in de bodem

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Methoden van Soil Resampling op veranderingen in de chemische concentraties van bosbodems Monitor

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Bemonstering bodems in een heterogene onderzoek uitzetten

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

Combined Size and Density Fractionation of Soils for Investigations of Organo-Mineral Interactions

Gezamenlijkegrootte en versplintering van de dichtheid van bodems voor onderzoek van Organo-minerale interacties

Combined size and density fractionation (CSDF) is a method used to physically separate soil into fractions differing in particle size and mineralogy. CSDF ...