Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
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Die Autoren möchten Kalyani Muhunthan danken für Unterstützung in Laborverfahren, Lee Opdahl für Weizen Ernte Genotyp, die Washington State Concord Grape Research Council und der Washington State University Center für die Erhaltung der Landwirtschaft und Natürlichen Ressourcen für eine BIOAg gewähren, um diese Arbeit zu unterstützen. Zusätzliche Mittel lieferte die USDA/NIFA durch Schraffur-Projekt 1014527.

Hinweis: Speicherort der Wiese: Washington State University, Pflanze Pathologie Bauernhof (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). Die Aussaat der Samen wurden mit einem mechanischen Pflanzer auf 19. Oktober 2017. Jedes Weizen Genotyp wurde in Headrows, ca. 1 Meter auseinander, vermeiden überlappende Wurzelsystem gepflanzt. Pflanzen-und Bodenproben wurden am 9. August 2018, gesammelt als Pflanzen zur Ernte bereit waren. Proben wurden von drei Wiederholungen von vier Weizen Genotypen gesammelt: PI561727, PI561725, Madsen,...

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	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. 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L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

Das primäre Ergebnis dieser Arbeit ist die Herstellung einer neuen Methodik, die schnell zu bereichern für Siderophore produzieren Mikroben während der Messung quantitativ Siderophore/Produktionstätigkeit in der Umwelt Probe verwendet werden können. Die Methode ist schnell, einfach und kostengünstig, und die Ergebnisse zeigen, wie sie verwendet werden, um Siderophore Aktivität von komplexen und neuartige Probentypen erkennen (z. B.., Boden und Pflanze Gewebe). Das Protokoll führt auch bei der Herstellung...

Siderophores sind wichtige Biomoleküle in erster Linie im Eisen-Chelat für Bioverfügbarkeit, aber mit einer Vielzahl von zusätzlichen Zwecke in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen von mikrobiellen Quorum sensing, Signalisierung, mikrobielle Pflanze-Hosts, Pflanzen Sie, Wachstumsförderung, Kooperation und Wettbewerb innerhalb komplexer mikrobieller Gemeinschaften1,2. Siderophores können grob unterteilt werden entsprechend ihrer aktiven Zentren und Strukturmerkmale, Erstellen von vier Grundtypen: Carboxylat, Hydroxamate, Catecholate, und gemischte Typen3,4. Viele Mikroorganismen sind in der Lage, die Ausscheidung über mehrere Typen von Siderophore5 und in komplexen Gemeinschaften, eine große Mehrheit der Organismen Biosynthese Membranrezeptoren um die Aufnahme eine noch breitere Palette von Siderophores1zu ermöglichen, 6. Aktuelle Arbeit zeigt, dass Siderophores besonders wichtig auf Gemeinschaftsebene und sogar in Inter Königreich Kommunikations- und biogeochemischen Transfer7,8,9,10 ,11.
Chrom Azurol Sulphonate (CAS) hat seit über 30 Jahren als ein Chelatbildner verwendet worden, um Eisen (Fe) zu binden dergestalt, dass Zusatz von Liganden (z. B. Siderophores) Dissoziation des CAS-Fe-komplexes, erstellen eine leicht erkennbare Farbe Veränderung in das Medium führen kann 12. wenn die CAS mit Fe gebunden ist, der Farbstoff erscheint als eine Farbe Königsblau und wie der CAS-Fe-Komplex dissoziiert, das Medium verfärbt sich nach der Art der Liganden verwendet, um die Fe-13aufräumen. Das anfängliche, Liquid-basierter Medium von Schwyn und Neilands gegründet 1987, modifiziert, in vielerlei Hinsicht zu beherbergen, wechselnde mikrobielle Ziele14, Wachstum Gewohnheiten und Einschränkungen15sowie einer Vielzahl von Metallen neben Fe, einschließlich Aluminium, Mangan, Kobalt, Nickel Cadmium, Lithium, Zink16, Kupfer17und sogar Arsen18.
Viele menschliche Krankheitserreger, sowie als Wachstum fördert Mikroorganismen (PGPM) Pflanzen wurden identifiziert als Siderophore produzierenden Organismen3,19,20, und wichtige Rhizosphäre und endophytische PGPM oft testen positiv für die Siderophore-Produktion4. Die traditionelle Fe-basierte Flüssigkeit Methode wurde angepasst Mikrotiter-Isolate in der Bearbeitung für Siderophore Produktion21testen. Aber nicht diese Techniken, die Bedeutung der mikrobiellen Gemeinschaft als Ganzes (das Mikrobiom), in Zusammenarbeit und mögliche Regulierung der Siderophore Produktion in Böden und Pflanzen Systeme22zu erkennen. Aus diesem Grund haben wir eine Hochdurchsatz-Gemeinschaftsebene Bewertung der Siderophore Produktion von einer bestimmten Umgebung, basierend auf der traditionellen CAS-Assay, aber mit Replikation, Benutzerfreundlichkeit, Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit in einer Mikrotestplatte entwickelt. Assay.
In dieser Studie wird ein kostengünstiger, Hochdurchsatz-CAS-Fe-Assay zur Erkennung von Siderophore Produktion präsentiert, um die Bereicherung der Siderophore Produktion von komplexen Proben (z.B. Boden und Pflanze Gewebe Homogenates) zu bewerten. Bulk, locker gebunden und fest gebundene Rhizosphäre Boden (in Bezug auf wie der Boden um den Stamm gebunden war) wurden zusammen mit Korn, schießen und Wurzel Gewebe aus vier unterschiedlichen Weizen (Triticum Aestivum L.) Genotypen erhalten: Lewjain, Madsen, PI561725, und PI561727. Es wurde vermutet, dass grundlegende Unterschiede in der Weizen-Genotypen zu Unterschieden bei der Rekrutierung und Auswahl von Siderophore produzieren Gemeinschaften führen könnte. Von besonderem Interesse ist der Unterschied zwischen mikrobieller Gemeinschaften verbunden mit der PI561725 isogene Linie Aluminium tolerant, ist da sie ALMT1 (Aluminium-aktivierte Malat Transporter 1) besitzt, mit dem Aluminium im Vergleich empfindliche PI561727 isogenen Linie, die eine nicht-Aluminium ansprechende Form des Gens, almt123,24,25,26besitzt. Das Hauptziel der Studie war es, eine einfache und schnelle Methode quantitativ bewerten Siderophore Produktion in Siderophore Anreicherungskulturen von komplexen Probentypen unter Beibehaltung der Kulturen für die künftige Arbeit zu entwickeln.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

Siderophores (niedermolekulare Gewicht Metall chelatisierenden Verbindungen) sind in verschiedenen ökologischen Phänomen von Eisen (Fe) in Böden, für den Erreger Wettbewerb, Pflanze Wachstumsförderung und Kreuz-Königreich Signalisierung biogeochemische Radfahren wichtig. Darüber hinaus sind Siderophores auch kommerzielles Interesse an Feldversuchen und Bioweathering von Metall-Lager Mineralien und Erze. Eine schnelle, kostengünstige und robuste Mittel Siderophore Produktion in komplexen Proben quantitativ zu bewerten ist der Schlüssel zur Identifizierung von wichtigen Aspekte der ökologischen Auswirkungen von Siderophore Aktivitäten, einschließlich, neuartige Siderophore Mikroben produziert. Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um Siderophore Aktivität in Takt Microbiome Gemeinschaften in Umweltproben wie Boden- oder Gewebe zu beurteilen. Die Proben wurden homogenisiert verdünnt in einem modifizierten M9 Medium (ohne Fe) und Anreicherungskulturen waren für 3 Tage inkubiert. Siderophore Produktion wurde in Proben in 24, 48 und 72 Stunden (h) mit einem neuartigen 96-Well Mikrotestplatte CAS (Chrom Azurol Sulphonate) bewertet-Fe-Agar-Assay, eine Anpassung der die traditionell mühsam und zeitaufwändig farbmetrischen Methode zur Beurteilung der Siderophore Aktivitäten in einzelnen kultivierten mikrobielle Isolate. Unsere Methode, um 4 verschiedene Genotypen/Linien von Weizen (Triticum Aestivum L.), einschließlich Lewjain, Madsen, und PI561725 und PI561727, die häufig in der Binnenschifffahrt Pacific Northwest angebaut haben wir angewendet. Siderophore Produktion wurde das Erbgut des Weizens und in bestimmten Arten von Pflanzengewebe beobachtet deutlich beeinflusst. Wir verwendet erfolgreich unsere Methode schnell auf den Bildschirm für die Beeinflussung der Pflanze Genotyp Siderophore Produktion, eine Schlüsselfunktion in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen. Wir produziert viele technische Wiederholungen, sehr zuverlässigen statistischen Unterschiede in Böden und im Pflanzengewebe nachgeben. Wichtig ist, zeigen die Ergebnisse, dass die vorgeschlagene Methode lässt sich schnell Siderophore Produktion in komplexen Proben mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit, in einer Art und Weise zu untersuchen, die Gemeinden für die spätere Arbeit Taxa und funktionelle Gene identifizieren bewahrt werden können.

Eine Pyoverdine Mischung Biosynthesized durch Pseudomonas Fluorescens diente als Standard zu interpretieren und zu quantifizieren, Extinktion (bei 420 nm) der Proben in Form von Pyoverdine äquivalenten in µM. Abbildung 1 zeigt den Zusammenhang zwischen Extinktion (420 nm) und Konzentration der Pyoverdine (Log10 Molarity in µM) ab. EDTA hat keinen angemessenen Standard bereitgestellt, da Proben ausgestellten größere Absorption Messunge...

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High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die schnelle Screening von Umweltproben für Siderophore Potenzial zur Mikronährstoff-Bioverfügbarkeit und Umsatz in den terrestrischen Systemen.

Siderophore Hochdurchsatz-Screening von Umweltproben: Pflanzen, Gewebe, lose Böden und Rhizosphäre Böden

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophore sind niedermolekulare, metallchelatierende Biomoleküle, die am Eisenkreislauf in der Umwelt beteiligt sind. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Bewertung der Siderophoraktivität in Boden- und Pflanzenproben mit hohem Durchsatz. Frühere Methoden zur Siderophor-Detektion haben die entscheidende Umgebung der mikrobiellen Gemeinschaft beseitigt.Unsere Technik ermöglicht den Nachweis innerhalb der relativ intakten mikrobiellen Gemeinschaft und des Lebensraums, in dem sie beteiligt war. Da die Verfügbarkeit von Eisen für die Produktivität der Landwirtschaft von entscheidender Bedeutung ist, könnte in diesem Protokoll die Rolle von Mikroben bei der Modulation der Verfügbarkeit von Eisen für Pflanzen untersucht werden. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die Auswirkungen von Landbewirtschaftungspraktiken auf die Bodengesundheit und Siderophor produzierende Gemeinschaften sowie die Entwicklung solcher Gemeinschaften im Laufe der Zeit zu bewerten.Zunächst waschen Sie alle Glaswaren in 100 Millimolar Salzchlorsäure 100 Millimolar Salpetersäure für mindestens zwei Stunden vor der Verwendung in der CAS-Assay. Bereiten Sie eine Aluminiumbackform mit Laborsand gefüllt und bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie. Autoklav bei 121 Grad Celsius für 30 Minuten und beiseite stellen.Bereiten Sie HDTMA vor, indem Sie 0365 Gramm zu 20 Milliliter doppelt entionisiertem Wasser hinzufügen, und legen Sie die Lösung in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die Löslichkeit zu fördern. Fügen Sie 0302 Gramm CAS zu 25 Milliliter doppelt entionisiertem Wasser hinzu, während Sie sanft mit einem sterilen magnetischen Rührstab rühren. Dann fügen Sie fünf Milliliter eines Molaren-Eisenchlorid-Hexahydrat summieren, um die 25 Milliliter der CAS-Lösung zu bewegen, während sie weiterhin sanft rühren.Fügen Sie nun langsam die 20 Milliliter HDTMA-Lösung in die eisenige CAS-Komplexlösung unter sanftem Rühren ein. Bereiten Sie die Pufferlösung vor, indem Sie 15,12 Gramm PIPES unter sanftem Rühren in 375 Milliliter doppelt entionisiertes Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit fünf Mol-Natriumhydroxid auf 6,8 ein.Dann Wasser hinzufügen, um das Volumen auf 450 Milliliter zu bringen. Nun fügen Sie fünf Gramm Agarose in die Lösung. Autoklaven Sie die PIPES-Pufferlösung und die Eisen-CAS-Komplexlösung bei 121 Grad Celsius für 30 Minuten.Fügen Sie die gesamte Lösung der eisenigen CAS-Komplexlösung sorgfältig in den gesamten PIPES-Puffer im Biosicherheitsschrank ein, nachdem jeder von ihnen autoklaviert wurde. Die Mischlösung bei 50 Grad Celsius in ein Wasserbad geben. Legen Sie nun ein steriles Reagenzboot in den sterilen Sand im Biosicherheitsschrank und erhitzen Sie sich auf 50 Grad Celsius.Übertragen Sie den eisernen CAS-Komplex-Agar auf das Boot, dann schnell aliquot 100 Mikroliter zu jedem Brunnen einer klaren flachen sterilen 96-Well-Mikroplatte. Bereiten Sie 800 Mikromolar Pyoverdin Standard in zuvor vorbereitet modifizierten M9 Medium. Verdünnen Sie die Lösung in 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 mikromolare Lösungen.Fügen Sie EDTA zu 500 Millilitern zuvor vorbereitetem modifiziertem M9-Medium hinzu, um den 3,2 Millimolaren-EDTA-Standard vorzubereiten. Verdünnen Sie diese Lösung in 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 Mikromolar-Lösungen. Um eine Standardkurve zu erzeugen, fügen Sie 100 Mikroliter jeder Konzentration von Pyoverdin und EDTA zu getrennten Brunnen einer 96-Well-Mikroplatte hinzu, die 100 Mikroliter Eisen CAS-Komplex-Agarmedium enthält.Erstellen Sie doppelte technische Replikationen jeder Konzentration. Fügen Sie auch leere Brunnen mit nur M9 hinzu. Messen Sie mit einem Mikroplattenleser die Absorption nach einer, sechs und 24 Stunden Inkubation bei 22 Grad Celsius und verwenden Sie Absorptionsmessungen, um Standardkurven zu erzeugen. Waschen Sie die Probenahmegeräte mit 22 Mikron Filter doppelt entionisiertem Wasser gefolgt von 70% Ethanol und wischen Sie mit Papiertüchern.Führen Sie die Wäsche vor der Probenahme und zwischen den Proben durch, um die sterile Technik aufrechtzuerhalten und die Kreuzkontamination zu reduzieren. Nachdem Sie Pflanzengewebe ausgehoben und eine kleine Wurzelkugel von Pflanzen im Feld ausgegraben haben, legen Sie die Wurzelkugel in eine separate beschriftete Plastiktüte zur Probentrennung im Labor. Legen Sie alle Proben direkt auf Eis und halten Sie bei vier Grad Celsius, bis Proben für den Siderophor-Produktionstest verarbeitet werden.Trennen Sie wurzelassoziierte Bodenproben in Massen, lose gebundene Rhizosphärenböden und eng gebundene Rhizosphärenböden. Nehmen Sie dazu die Wurzelkugeln aus den Säcken und schütteln Sie den Boden sanft von der Wurzelkugel ab. Abgeschüttelter Boden, zusammen mit dem Boden im Beutel, umfassen die Masse Boden.Dies ist der lose gebundene Rhizosphärenboden. Generieren Sie eng gebundene Rhizopshere-Boden, indem Sie Wurzeln mit der eng gebundenen Probe nehmen und in ein Zentrifugenrohr geben. Fügen Sie 30 Milliliter doppelt entionisiertes Wasser und Wirbel für zwei bis drei Minuten hinzu.Entfernen Sie die Wurzeln, um die eng gebundene Rhizosphäre Boden Verdünnung zu erhalten. Homogenisieren Sie jede Bodenprobe innerhalb des Probenbeutels, indem Sie den Boden so weit wie möglich mischen und drehen, ohne den Beutel zu öffnen. Nachdem jede Probe gründlich gemischt wurde, aliquot und hängen zwei Gramm jeder Bodenprobe in 20 Milliliter modifiziertem M9-Medium in einem sterilen 50 Milliliter Zentrifugenrohr.Verdünnen Sie die Probe und versiegeln Sie das Rohr dann mit einem sterilen Schaumstoffstecker, um die Belüftung zu ermöglichen. Für eng gebundene Rhizosphärenproben zwei Milliliter der Rhizosphäre-Bodenschlämme zu 20 Milliliter modifiziertem M9-Medium in einem sterilen 50 Milliliter Zentrifugenrohr hinzufügen. Verdünnen Sie die Probe und versiegeln Sie das Rohr dann mit einem sterilen Schaumstoffstecker, um die Belüftung zu ermöglichen.Um die Gewebeprobe vorzubereiten, sterilisieren Sie die Wurzel, schießen und körnen Sie mit 70% Ethanol. Mazeration zwei Gramm frisches Gewebe in 20 Milliliter modifiziertem M9-Medium mit einem Mixer auf hoch für 30 Sekunden. Dann die Probe in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenrohr geben, verdünnen und versiegeln Sie das Rohr mit einem sterilen Schaumstoffstopfen.Um die Siderophorproduktion durch Eisenbegrenzung anzureichern, brüten die 50 Milliliter Zentrifugenrohre bei Raumtemperatur und schütteln bei 160 U/min. Bei 24, 48 und 72 Stunden nach Beginn der Anreicherungskultur, entfernen Sie eine Milliliter-Subsamples aus den Anreicherungsrinnen mit steriler Technik. Zentrifugieren Sie die Subsamples bei 10.000 mal G für eine Minute in zwei Milliliter-Zentrifugenröhren, um die Zellen zu pelletisieren.Mit steriler Technik, fügen Sie 100 Mikroliter des Überstandes zu einer 100-Mikroliter-Lösung aus Eisen CAS-Komplex Agar in doppelter oder dreifacher Injektion innerhalb der Mikroplatte. Fügen Sie auch 100 Mikroliter steriles M9 Medium als Rohlinge hinzu. Dann bebrüten die Platte bei 28 Grad Celsius.Jede Platte sollte vor der Platzierung im Inkubator versiegelt und mit Folie bedeckt werden. Den restlichen Überstand und das Pellet für jede Probe in sein eigenes steriles Zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr aussetzen. Fügen Sie 400 Mikroliter steriles Glycerin in jede Probe Überstandrohr und wieder aufhängen das Pellet, um Glyzerinbestände zu schaffen.Einfrieren Sie den Bestand bei minus 80 Grad Celsius für eine spätere Analyse. Messen Sie die Absorption bei sechs, 24, 48 und 72 Stunden bei einer Wellenlänge von 420 Nanometern. Ein von Pseudomonas fluorescens biosynthetisiertes Pyoverdingemisch wurde als Standard zur Interpretation und Quantifizierung der Absorption von Proben in Proben der Pyoverdinäquivalenz in Mikromolaren verwendet.Hier wird der Zusammenhang zwischen der Absorption bei 420 Nanometern und der Anfangskonzentration von Pyoverdin gezeigt. Die Siderophoraktivität der 72-Stunden-Anreicherung wurde bei einer Inkubation von 48 Stunden bewertet, um den Einfluss des Genotyps und des Probentyps auf die Siderophor-Isolierung zu bestimmen. Die Siderophoraktivität in Massenbodenproben war relativ gering und zeigte keine Unterschiede zwischen dem Weizengenotyp, aus dem der Massenboden entnommen wurde.Die Anreicherungen von lose gebundenem Boden, der vom Genotyp 725 isoliert wurde, wiesen jedoch eine größere Siderophorproduktion auf als die lose gebundenen Böden aus Madsen und 727, aber nicht aus Lewjain. Umgekehrt wurde die Siderophorproduktion in Anreicherungen aus eng gebundenem Boden nicht stark vom Genotyp beeinflusst. Anreicherungskulturen des Getreidegewebes ergaben unabhängig vom Genotyp eine relativ geringe Siderophorproduktion.Anreicherungen von Lewjain-Triebgewebe hatten eine signifikant niedrigere Siderophorproduktion als die anderen Genotypen, und 725 Triebgewebekulturen führten zu einer variableren Siderophorproduktion. Der größte Unterschied in der Siderophoraktivität wurde in Wurzelgewebeanreicherungskulturen beobachtet, wo 725 mehr als 200% größere Siderophoraktivität aufwiesen als alle anderen Genotypen. Einer der belastendsten Aspekte bei der Ausführung des Protokolls ist die Aufrechterhaltung aseptischer Bedingungen, während die vielen Schritte zur Erzeugung der CAS-Eisen-Agar-Mikroplatte und die Prüfung von Proben für Siderophor-Aktivität abgeschlossen werden.Eine breite Palette chromatographischer oder DNA-basierter Techniken kann entweder auf den eigentlichen Mikrotiterbrunnen oder die Glycerinkonservenkultur für weitere biochemische Tests oder genetische Charakterisierung und metabolische Modellierung angewendet werden. Durch die Verwendung dieses Protokolls kann die Siderophoraktivität später mit bestimmten Organismen in Verbindung gebracht werden, die für diese Aktivität verantwortlich sind, oder anschließend als Mechanismus für größere ökologische Auswirkungen ins Visier genommen werden. Dieses Protokoll könnte leicht geändert werden, um die Siderophorproduktion in Anreicherungskulturen zu bewerten, die aus Proben aus anderen Umweltkompartimenten wie Luft, Wasser und Sedimenten gewonnen werden.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Forschung

Umwelt

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Integrierte Feld Lysimetrie und Porenwasserprobennahme für die Bewertung von Chemical Mobilität in Böden und Vegetation Gegründet

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Messung der Treibhausgas-Flux aus landwirtschaftlichen Böden mit statischer Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

Ein Biegetest zur Bestimmung der Atterberg Ausrollgrenze in Böden

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

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Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

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Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

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Eine 3-dimensionale (3D)-gedruckte Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos anordnen

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Plot-Probenahme Böden in einer heterogenen Forschung

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Combined Size and Density Fractionation of Soils for Investigations of Organo-Mineral Interactions

Kombinierte Größe und Dichte Fraktionierung von Böden für Untersuchungen von Organo-mineralische Interaktionen

Combined size and density fractionation (CSDF) is a method used to physically separate soil into fractions differing in particle size and mineralogy. CSDF ...