Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

המחברים רוצים להודות Muhunthan קאליאני לסיוע תהליכי מעבדה, Opdahl לי על חיטה גנוטיפ קציר, המועצה למחקר עינב מדינת וושינגטון ו המרכז האוניברסיטאי של מדינת וושינגטון לחקלאות הסדירה ו משאבים טבעיים עבור BIOAg להעניק תמיכה עבודה זו. מימון נוסף סופק על ידי משרד החקלאות/NIFA דרך פתח פרוייקט 1014527.

הערה: המיקום של אתר שדה: אוניברסיטת מדינת וושינגטון, צמח פתולוגיה החווה (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). הזרעים נזרעו באמצעות עציץ מכני על אוקטובר 19, 2017. גנוטיפ חיטה כל ניטע ב- headrows, כ 1 מטר אחד מהשני כדי למנוע חפיפה של מערכת השורשים. צמח וקרקע נאספו ב אוגוסט 9, 2018, כאשר הצמחים היו מוכנים לקציר. הדגימות היו ...

<ol>
	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biology+of+siderophores.">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li><li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophores+and+their+potential+applications:+a+review.">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li><li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+(PGPR):+emergence+in+agriculture.">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li><li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics,+Siderophore+Production,+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+&#39;Concord&#39;+Grape+Vineyards.">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from &#39;Concord&#39; Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , (2018).</li><li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway.">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li><li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity,+Abundance,+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi.">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung.">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li><li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li><li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production.">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li><li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus.">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li><li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay.">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li><li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).</li><li>Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).</li><li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria.">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9 (2017).</li><li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes.">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li><li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux.">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li><li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter.">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li><li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+Structure,+Species+Variation,+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+(Triticum+aestivum)+Cultivars.">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li><li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

התוצאה העיקרית של עבודה זו הוא הייצור של מתודולוגיה חדשה זה יכול לשמש כדי להעשיר במהירות siderophore בהפקת חיידקים בעוד באופן כמותי מדידת siderophore ייצור/פעילות במדגם סביבתיים. המתודולוגיה היא מהירה, פשוטה וחסכונית, התוצאות מציגות כיצד זה יכול לשמש כדי לזהות פעילות siderophore של סוגי מדגם מורכבים ולא ...

Siderophores הם בעיקר מעורב ברזל-קלאציה הזמינות הביולוגית, אבל עם מגוון רחב של מטרות נוספות של מערכות אקולוגיות יבשתי ו הימית, החל quorum מיקרוביאלי חישה, איתות צמח חיידקים-המארחים, חשוב מולקולות קידום התפתחות הצמח, שיתוף פעולה ותחרות בתוך קהילות מיקרוביאלי מורכבים1,2. Siderophores יכולים להיות בהרחבה מסווגים לפי אתרים פעילים שלהם תכונות מבניות, יצירת מארבעה סוגים: carboxylate, hydroxamate, catecholate, מעורבבים סוגים3,4. מיקרואורגניזמים רבים מסוגלים מפריש יותר מסוג אחד של siderophore5 , בקהילות מורכבים, הרוב המכריע של אורגניזמים biosynthesize קולטני ממברנה כדי לאפשר את קליטת מגוון רחב אף יותר של siderophores1, 6. עבודה מצביע על כך siderophores הן חשוב במיוחד ברמה הקהילתית, אפילו התקשורת הבין-הממלכה, העברות biogeochemical7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CA) שימש במשך למעלה מ-30 שנה בתור חומר מכלט לקשור על ברזל (Fe) בצורה כזאת, כי תוספת של ליגנדים (קרי: siderophores) יכול לגרום דיסוציאציה במתחם קסטיאל-Fe, יצירת שינוי צבע קלות לזיהוי במדיום 12. כאשר רשויות אישורים מאוגד עם Fe לצבוע מופיע בצבע כחול אדמדם, כפי dissociates המתחם CAS-Fe, המדיום משנה את צבעו בהתאם לסוג של ליגנד להתרגל לנקות את Fe13. המדיום הראשונית, בנוזל נוסדה על ידי Schwyn, Neilands בשנת 1987, שונתה בדרכים רבות כדי להכיל שינוי מטרות מיקרוביאלי14, גדילה הרגלי מגבלות15, וכן מגוון של מתכות חוץ Fe, כולל אלומיניום, מנגן, קובלט, ניקל קדמיום, ליתיום, אבץ16, נחושת17ו אפילו ארסן18.
פתוגנים אנושיים רבים, כמו גם כמו צמח צמיחה קידום מיקרואורגניזמים (PGPM) זוהו אורגניזמים לייצר siderophore3,19,20, ו rhizosphere חשוב PGPM endophytic לעיתים קרובות מבחן חיובית עבור ייצור siderophore4. מבוסס-Fe נוזלי השיטה המסורתית כבר מותאם microtiter בדיקה של מבודד בטיפוח הפקה siderophore21. עם זאת, שיטות אלה אינם מזהים את החשיבות של הקהילה מיקרוביאלי בכללותה (microbiome), בשיתוף ורגולציה פוטנציאל הייצור siderophore קרקעות, צמח מערכות22. לכן, פיתחנו הערכה הקהילה ברמת תפוקה גבוהה של siderophore הפקה של סביבה נתונה, המבוססת על וזמינותו CAS מסורתי, אבל עם שכפול, קלות מדידה, אמינות של הדיר ב- microplate וזמינותו.
במחקר זה, מוצג assay CAS-Fe חסכונית, תפוקה גבוהה לגילוי siderophore הייצור כדי להעריך את העשרת siderophore הייצור מדגימות מורכבים (קרי, אדמת וצמח רקמת homogenates). Rhizosphere בתפזורת, באופן רופף מכורך ו בחוזקה מאוגד-אדמת (מבחינת איך האדמה קשורה השורש) התקבלו יחד עם התבואה, לירות, שורש רקמות ארבעה אחרים ברורים חיטה (חיטת הלחם ל'): Lewjain, מדסן, PI561725, ו PI561727. זה היה שיערו כי יסוד הבדלים אחרים חיטה יכול לגרום הבדלים גיוס ומיון של siderophore בהפקת קהילות. עניין מיוחד הוא ההבדל בין קהילות חיידקים הקשורים עם קו isogenic PI561725, אשר אלומיניום עמיד בפני תקלות כי הוא בעל ALMT1 (מופעל אלומיניום בנויים המשלח 1), בהשוואה עם האלומיניום רגיש PI561727 isogenic קו, אשר ברשותה אלומיניום שאינם מגיבים צורה של הגן, almt123,24,25,26. המטרה הראשית של המחקר הייתה לפתח שיטה פשוטה, מהירה באופן כמותי להעריך הייצור siderophore בתרבויות העשרה siderophore של סוגי מדגם מורכבים תוך שמירה על התרבויות לעבודה עתידית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

Siderophores (משקל נמוך-מולקולרי מתכת chelating תרכובות) חשובים שונים לתופעה אקולוגית החל ברזל (Fe) biogeochemical על אופניים בקרקעות, תחרות הפתוגן, צמח צמיחה קידום של צלב-ממלכת איתות. יתר על כן, siderophores גם הם עניין מסחרי ב- bioleaching ו- bioweathering של מינרלים, עפרות מתכת-מיסב. אמצעי מהיר, חסכוני וחזק באופן כמותי הערכת ייצור siderophore בדגימות מורכבות היא המפתח לזיהוי היבטים חשובים של ההשלכות האקולוגי של פעילות siderophore, כולל, הרומן siderophore בהפקת חיידקים. השיטה המוצגת כאן פותחה כדי להעריך את הפעילות siderophore של קהילות microbiome בטקט, בדגימות סביבתיים, כגון רקמות אדמה או צמח. הדגימות היו הומוגני, מדולל במדיום M9 ששונתה (ללא Fe), העשרה תרבויות היו הדגירה למשך 3 ימים. Siderophore ההפקה נאמד בדגימות ב 24, 48, 72 שעות (h) באמצעות microplate 96-ובכן הרומן של רשויות אישורים (כרום azurol sulphonate)-Fe אגר assay, עיבוד של השיטה באופן מסורתי מייגע ולגזול ערכי צבע מוחלטים של הערכת siderophore פעילות, המבוצעות על הפרט טיפח מבודד מיקרוביאלי. נוכל להחיל את השיטה שלנו 4 שונים אחרים/שורות של חיטה (חיטת הלחם ל'), כולל Lewjain, מדסן, ו PI561725 ו- PI561727 בדרך כלל גדל בצפון-מערב האוקיינוס השקט היבשה. Siderophore הייצור היה בבירור מושפע של גנוטיפ של חיטה, ובעוד סוגים ספציפיים של רקמות הצמח שנצפו. אנחנו משתמשים בהצלחה השיטה שלנו על המסך במהירות עבור השפעת הצמח גנוטיפ על ייצור siderophore, פונקציה מפתח במערכות אקולוגיות יבשתי ו הימית. שהפקנו משכפל טכניים רבים, מניב אמינים מאוד הבדלים סטטיסטיים בקרקעות ובתוך רקמות הצמח. חשוב לציין, התוצאות מציגות שהשיטה המוצעת ניתן לבחון במהירות siderophore ייצור בדגימות מורכבים עם רמה גבוהה של אמינות, באופן המאפשר קהילות להישמר לעבודה מאוחר יותר לזהות את taxa ואת הגנים פונקציונלי.

Biosynthesized תערובת pyoverdine על ידי Pseudomonas fluorescens שימש תקן כדי לפענח ולכמת ספיגת (ב 420 ננומטר) של דגימות מבחינת pyoverdine מקבילות מיקרומטר איור 1 מציג את קשרי הגומלין בין ספיגת (420 ננומטר) מתחילה ריכוז של pyoverdine (molarity10 יומן ב מיקרומטר). EDTA לא סיפקו תקן נאותה כי ד?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

אנו מציגים פרוטוקול להקרנה מהירה של דגימות סביבתי עבור siderophore פוטנציאל לתרום הזמינות הביולוגית micronutrient והמסירה במערכות יבשתי.

תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophores הם משקל מולקולרי נמוך, ביומולקולות מתכת-chelating מעורב רכיבה על אופניים ברזל בסביבה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת תפוקה גבוהה ומהירה של פעילות siderophore בדגימות קרקע וצמחים. שיטות קודמות לגילוי siderophore חיסלו את הסביבה הקריטית של הקהילה המיקרוביאלית.הטכניקה שלנו מאפשרת זיהוי בתוך הקהילה המיקרוביאלית השלמה יחסית ובית הגידול שבו היא מעורבת. מכיוון שזמינות הברזל חיונית לפרודוקטיביות החקלאית, כך בפרוטוקול זה ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את תפקידם של מיקרואורגניזמים בהוסת את הזמינות של ברזל לצמחים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך את ההשפעה של שיטות ניהול החווה על בריאות הקרקע וקהילות המייצרות siderophore, כמו גם את הפיתוח של קהילות כאלה לאורך זמן.כדי להתחיל, חומצה לשטוף את כל כלי הזכוכית ב 100 מילימולרית הידרוכלורית 100 מילימולרית חומצה חנקתית לפחות שעתיים לפני ניצול במבחן CAS. מכינים תבנית אפייה מאלומיניום במילוי חול ברמה מעבדתית ומכסים אותה בנייר אלומיניום. אוטוקלאב ב-121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ומניחים בצד.הכן HDTMA על ידי הוספת 0365 גרם ל 20 מיליליטר של מים כפולים deionized, ולמקם את הפתרון באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לקדם מינון. מוסיפים 0302 גרם של CAS ל-25 מיליליטר של מים כפולים, בעודם תוך ערבוב עדין עם פס ערבוב מגנטי סטרילי. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של הקסהידראט ברזל טוחן אחד ל-25 המיליליטרים של פתרון CAS תוך המשך ערבוב עדין.עכשיו, לאט להוסיף את 20 מיליליטר של פתרון HDTMA לתוך פתרון ברזל CAS מורכב תוך ערבוב עדין. הכן את פתרון החיץ על ידי המסת 15.12 גרם של PIPES לתוך 375 מיליליטר של מים כפולים deionized עם ערבוב עדין. כוונן את ה- pH ל- 6.8 עם חמישה נתרן הידרוקסידי טוחן.לאחר מכן מוסיפים מים כדי להביא את הנפח ל 450 מיליליטר. עכשיו להוסיף חמישה גרם של אגרוז לפתרון. יש לבודד באופן אוטומטי את פתרון המאגר PIPES ואת הפתרון המורכב של ברזל CAS ב-121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.בזהירות להוסיף את כל הפתרון מורכב CAS ברזל לאורך כל מאגר PIPES בארון biosafety לאחר כל אחד מהם כבר autoclaved. מניחים את הפתרון המעורב באמבט מים ב 50 מעלות צלזיוס. עכשיו מניחים סירת ריג'נט סטרילית בחול הסטרילי בתוך הארון הביו-בטיחותי וחום ל-50 מעלות צלזיוס.העבר את אגר קומפלקס CAS ברזל לסירה, ואז במהירות aliquot 100 microliters לכל באר של מיקרופלסטיק סטרילי שטוח 96-well ברור. הכינו תקן פיוברדין 800 מיקרו-מולארי במדיום M9 שהוכן בעבר. לדלל את הפתרון לפתרונות 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 ו- 6.25 מיקרומולרים.הוסף EDTA ל 500 מיליליטר של מדיום M9 שהוכן בעבר כדי להכין את תקן EDTA 3.2 מילימולר. לדלל פתרון זה לתוך 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, ו 6.25 מיקרומולרים פתרונות. כדי ליצור עקומה סטנדרטית, להוסיף 100 microliters של כל ריכוז של פיוברדין ו EDTA להפריד בארות של מיקרופלסטיק 96 היטב המכיל 100 microliters של ברזל CAS מורכב אגר בינוני.בצע שכפולים טכניים כפולים של כל ריכוז. הוסף גם בארות ריקות עם M9 בלבד. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, למדוד ספיגה לאחר אחד, שש, ו 24 שעות דגירה ב 22 מעלות צלזיוס, ולהשתמש מדידות ספיגה כדי ליצור עקומות סטנדרטיות. לשטוף את ציוד הדגימה עם 22 מיקרון מסנן כפול deionized מים ואחריו 70% אתנול ולנגב עם מגבות נייר.בצע את הכביסה לפני הדגימה ובין דגימות כדי לשמור על טכניקה סטרילית ולהפחית זיהום צולב. לאחר כריתת רקמות הצמח וחפירת כדור שורש קטן מצמחים בשטח, מניחים את כדור השורש בשקית ניילון נפרדת המסומנו להפרדת דגימה בסביבת המעבדה. מניחים את כל הדגימות ישירות על קרח ולשמור על ארבע מעלות צלזיוס עד דגימות מעובדים עבור הבדיקה ייצור siderophore.דגימות אדמה משויכות שורש נפרדות לאדמה ריזוספירה בתפזורת, כבולות באופן רופף ואדמה רזופרית קשורה היטב. כדי לעשות זאת, להוציא את כדורי השורש מתוך השקיות בעדינות לנער את האדמה מכדור השורש. מזועזעים מהאדמה, יחד עם האדמה שנותרה בשקית, מהווים את האדמה בתפזורת.זוהי אדמת הריזוספירה הכבולה באופן רופף. צור אדמה rhizopshere קשור היטב על ידי לקיחת שורשים עם מדגם קשור בחוזקה ולשים אותם בצינור צנטריפוגה. מוסיפים 30 מיליליטר של מים כפולים ומערבולת במשך שתיים עד שלוש דקות.הסר את השורשים כדי לקבל את דילול תרחיף הקרקע rhizosphere קשור היטב. הומוגניזציה כל דגימת אדמה בתוך שקית המדגם על ידי ערבוב והפיכת הקרקע ככל האפשר מבלי לפתוח את השקית. לאחר כל מדגם כבר מעורבב ביסודיות, aliquot ולהשעות שני גרם של כל דגימת אדמה ב 20 מיליליטר של מדיום M9 שונה בתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר.מדללים את הדגימה ולאחר מכן לאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי כדי לאפשר aeration. לדגימות ריזוספירה קשורות היטב, הוסיפו שני מיליליטר של תרחיף אדמת הריזוספירה ל-20 מיליליטר של מדיום M9 שונה בתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר. מדללים את הדגימה ולאחר מכן לאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי כדי לאפשר aeration.כדי להכין את דגימת הרקמה, פני השטח מעקרים את השורש, היורה והתבואה עם 70%אתנול. Macerate שני גרם של רקמה טרייה ב 20 מיליליטר של מדיום M9 שונה באמצעות בלנדר על גבוה במשך 30 שניות. לאחר מכן, להעביר את המדגם לצינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר, לדלל, ולאטום את הצינור עם תקע קצף סטרילי.כדי להעשיר את ייצור siderophore באמצעות הגבלת ברזל דגירה צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר לנער ב 160 סל"ד. בגיל 24, 48 ו-72 שעות לאחר ייזום תרבות ההעשרה, יש להסיר תת-דגימה אחת מצינורות ההעשרה בטכניקה סטרילית. צנטריפוגה תת דגימות ב 10, 000 פעמים G במשך דקה אחת בשני צינורות צנטריפוגה מיליליטר כדי גלולה את התאים.באמצעות טכניקה סטרילית, להוסיף 100 microliters של supernatant לפתרון 100 microliter של ברזל CAS מורכב אגר כפול או טריפלג בתוך המיקרופלסטיק. כמו כן להוסיף 100 microliters של בינוני M9 סטרילי כמו ריקים. ואז לה הדגירה את הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס.כל צלחת צריכה להיות אטומה ומכסה בנייר כסף לפני המיקום באינקובטור. להשעות את העל-טבעי הנותר ואת גלולה עבור כל מדגם לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי משלו שני מיליליטר. הוסף 400 microliters של גליצרול סטרילי לתוך כל צינור על טבעי מדגם מחדש להשעות את גלולה כדי ליצור מניות גליצרול.להקפיא את המניה במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר. למדוד את הספיגה בשש, 24, 48, ו 72 שעות באורך גל של 420 ננומטר. תערובת פיוברדין biosynthesized על ידי פלואורסצנטים Pseudomonas שימש כסטנדרט לפרש ולכימת ספיגה של דגימות בדגימות של שקילות פיוברדין במיקרומולר.הקשר בין ספיגה ב 420 ננומטר ואת הריכוז ההתחלתי של פיוברדין מוצג כאן. פעילות Siderophore של העשרה 72 שעות הוערך ב 48 שעות דגירה כדי לקבוע את ההשפעה של גנוטיפ וסוג המדגם על בידוד siderophore. פעילות Siderophore בדגימות קרקע בתפזורת הייתה נמוכה יחסית ולא הציגה הבדלים בין גנוטיפ החיטה שממנו נדגמה הקרקע בתפזורת.עם זאת, העשרות של אדמה קשורה באופן רופף מבודד מן הגנוטיפ 725 הציג ייצור siderophore גדול יותר לעומת האדמה קשורה באופן רופף מדסן ו 727 אבל לא מ Lewjain. לעומת זאת, ייצור סיידרופור בהעשרות מאדמה קשורה היטב לא הושפע במידה רבה על ידי גנוטיפ. תרבות העשרה של רקמת תבואה הניבו ייצור siderophore נמוך יחסית ללא קשר גנוטיפ.העשרה של רקמת לירות Lewjain היה ייצור siderophore נמוך באופן משמעותי מאשר גנוטיפים אחרים, ו 725 לירות תרבות רקמה הביא ייצור siderophore משתנה יותר. ההבדל הגדול ביותר בפעילות siderophore נצפתה בתרבויות העשרה רקמת השורש שבו 725 היה יותר מ 200% פעילות siderophore גדול יותר מאשר כל genotypes אחרים. אחד ההיבטים הממיסויים ביותר של ביצוע הפרוטוקול הוא שמירה על תנאים ספיטיים תוך השלמת השלבים הרבים ליצירת מיקרופלסטיק אגר ברזל CAS ובדיקת דגימות עבור פעילות siderophore.ניתן ליישם מגוון רחב של טכניקות מבוססות תרבות כרומטוגרפית או מבוססות דנ"א על באר המיקרוטיטר בפועל או על התרבות השתמרה גליצרול לבדיקות ביוכימיות נוספות או אפיון גנטי ומידול מטבולי. על ידי שימוש בפעילות siderophore פרוטוקול זה יכול להיות קשור מאוחר יותר עם אורגניזמים ספציפיים האחראים על פעילות זו או לאחר מכן ממוקד כמנגנון להשפעות אקולוגיות גדולות יותר. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות שונה כדי להעריך את ייצור siderophore בתרבויות העשרה שנוצר מדגימות שנאספו תאים סביבתיים אחרים כולל אוויר, מים, ומעים.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

משולב שדה Lysimetry וPorewater דגימה להערכת כימית ניידות בקרקעות וצמחייה הוקמה

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

מדידה של שטף גזי חממה מקרקעות חקלאיות באמצעות לשכות סטטי

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

מבחן כיפוף לקביעת מגבלת פלסטיק Atterberg בקרקעות

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

הפקה וניתוח של פוספוליפידים מיקרוביאלית חומצות שומן בקרקעות

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

שיטות Resampling הקרקע לעקוב אחר שינויים בריכוזיים הכימית של קרקעות יער

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

קרקעות הדגימה במחקר הטרוגנית מגרש

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

Combined Size and Density Fractionation of Soils for Investigations of Organo-Mineral Interactions

גודל משולב של צפיפות Fractionation של קרקעות החקירות של האינטראקציות אורגניות-מינרליים

Combined size and density fractionation (CSDF) is a method used to physically separate soil into fractions differing in particle size and mineralogy. CSDF ...