Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
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著者は、検査手順、リー ・ オプダール小麦品種を収穫するため、ワシントン州コンコード種ブドウ研究評議会は、農業の維持のためワシントン州立大学センターの支援のため Kalyani Muhunthan を感謝したいとこの作業をサポートするを BIOAg のために天然資源を付与します。追加資金は米国農務省/NIFA ハッチ プロジェクト 1014527 によって提供されました。

メモ: 現場の場所: ワシントン州立大学、植物病理学ファーム (46 ° 46'38.0"N 117 ° 04'57.4"W)。蒔かれた種は、2017 年 10 月 19 日に機械式のプランターを使用します。それぞれの小麦の遺伝子型が headrows、およそ 1 メートル離れてルート システムの重複を防ぐために植えられました。植物や土壌採取した 2018 年 8 月 9 日、植物が収穫の準備ができていたときに.サンプルは、4 つの小麦品種の 3 つの?...

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	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung.">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li><li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus.">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li><li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay.">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li><li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).</li><li>Dertz, E. 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K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes.">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li><li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+Structure,+Species+Variation,+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+(Triticum+aestivum)+Cultivars.">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li><li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

この作業の主な結果は、環境試料中の担鉄細胞生産/活動を定量的に測定しながら微生物を作り出す担鉄細胞の急速に豊かに使用できる新しい方法論の生産です。方法論は、簡単、迅速かつコスト効果の高いと結果は、複雑で新しいサンプルの型から担鉄細胞活動を検出するための使用方法を示す (例えば.、土壌および植物組織)。プロトコルも集積培養のグリセロールの生産の結果を?...

シデロフォアは重要な生体鉄キレートのバイオアベイラビリティが幅広い微生物クォーラム センシング、微生物工場-ホストへのシグナリングに至る地球および水生生態系における追加の目的に主に関与します。植物の成長促進、協力、複雑な微生物群集1,2内での競争。シデロフォア大別できます、アクティブ サイトと構造的特徴によると 4 つの基本的な種類を作成する: カルボン酸、hydroxamate、catecholate、タイプ3,4を混合し、。多くの微生物が排泄の担鉄細胞5および複雑な社会、生物ピロールポリアミドの大半で 1 つ以上の型膜受容体も幅広いシデロフォア1の通風管を許可することができます。 6。近作は、コミュニティ レベルでは、間王国通信と物質転送7,8,9,10 でさえ、シデロフォアが特に重要であることを示します ,11。
クロム クロムブルー アルキルベンゼンスルホネート (CAS) は、(すなわち、シデロフォア) 配位子の添加させる媒体で容易に識別できる色の変化を作成する CA Fe 錯体の解離の可能性があるような方法で鉄 (Fe) をバインドするキレート剤として 30 年以上使用されています12. とき、CA が Fe でバインドされている、染料がロイヤル ブルー色として表示され、CA Fe 錯体の解離、培地鉄13を清掃するために使用する配位子の種類によって色が変わります。Schwyn および Neilands によって 1987 年に設立初期、液状の培地は微生物のターゲット14成長の習慣の制限15と鉄以外の金属の様々 な変化に対応するための多くの方法で変更されているを含むアルミニウム、マンガン、コバルト、カドミウム ニッケル、リチウム、亜鉛16、銅17、でもヒ素18
多くの人間の病原体だけでなく植物成長促進菌 (PGPM) として識別されている担鉄細胞生産生物3,19、20と重要な根とよくテスト エンドファイトの PGPMシデロフォア4正。伝統的な液体 Fe ベースのメソッドは、マイクロタイター担鉄細胞生産21栽培菌株のテストに適応されています。ただし、これらのテクニックは、土壌および植物システム22シデロフォアの潜在的な規制と微生物群集 (マイクロバイ) 全体として、協力の重要性を認識に失敗します。そのため、従来の CAS アッセイ、レプリケーション、マイクロ プレートの再現性、信頼性、測定の容易さと、与えられた環境からシデロフォアの高スループット コミュニティ レベル評価を開発しました。試金。
本研究でシデロフォアを検出するためのコスト効果の高い、高スループット CA Fe アッセイは、複雑なサンプル (すなわち、土壌および植物組織ホモジネート) からシデロフォアの充実を評価するために提示されます。(どのように土壌は、ルートにバインドされた) の面で一括、弱く結び付いたと緊密にバインドされた根圏土壌粒、撮影、および 4 つの異なるコムギ (Triticum aestivum l.) の遺伝子型から根組織と共に得られた: Lewjain、マドセン、PI561725 とPI561727。小麦品種における根本的な違いが募集とコミュニティを作り出す担鉄細胞の選択の違いをされる可能性があること仮説。特別な関心のアルミニウム耐性であるALMT1 (リンゴ酸輸送体 1 の活性化アルミニウム) を持っているので、PI561725 の同質遺伝子系統に関連付けられている微生物の違いはアルミと比較します。敏感 PI561727 同質遺伝子系統、遺伝子、 almt123,24,25,26の非アルミ応答フォームを所有しています。研究の主な目的は、複雑なサンプルの型の今後の作業のための文化を保持しながら担鉄細胞集積培養のシデロフォアを定量的に評価する簡単で、急速な方法を開発することでした。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

シデロフォア (低分子量キレート化合物)、鉄 (Fe) を病原体競争、植物成長促進とクロス王国シグナリングの土壌物質循環に至る様々 な生態学的な現象に重要です。さらに、シデロフォアはバクテリアリーチングや金属軸受け鉱物および鉱石の風化における商業的興味あります。複雑なサンプルにシデロフォアを定量的に評価する急速なコスト効果の高い、堅牢な手段など微生物の生産する新規担鉄細胞, 担鉄細胞活動の生態学的な影響の重要な側面を識別するキー。ここで紹介した方法は、土壌や植物の組織などの環境試料中のタクトにマイクロバイ コミュニティの担鉄細胞活性を評価するために開発されました。サンプルが均質化され (Fe) なし改変 M9 培地で希釈し、集積培養 3 日間培養します。シデロフォアは、24、48、および 72 時間 (h) 新規 96 ウェル マイクロ プレート CAS (クロム クロムブルー アルキルベンゼンスルホネート) を用いたサンプルの評価された-Fe 寒天アッセイ, 担鉄細胞を評価する従来手間と時間の比色定量法の適応個々 培われた分離された細菌に対して実行されたアクティビティ。内陸部の太平洋岸北西部で栽培 PI561727 と PI561725、マドセン、Lewjain を含む 4 異なる遺伝子型/コムギ (Triticum aestivum l.) のラインに私たちの手法を適用.シデロフォアだった観察植物組織の特定の種類の小麦の遺伝子型の影響を明確に。正常に急速にシデロフォア、地球および水生生態系で重要な機能に及ぼす植物遺伝子型の画面に本手法を使いました。土壌および植物組織内で非常に信頼性の統計的な差異をもたらす多くの技術的な複製を制作しました。重要なは、結果は急速にコミュニティ イチイと機能的な遺伝子を識別するより遅い仕事のために保持することができる方法で、信頼性の高い、複雑なサンプルのシデロフォアを調べる手法を使用できます。

緑膿菌の fluorescensによる pyoverdine 混合物生合成が解釈し、吸光度を定量化する標準として使用された (で 420 nm) μ M の pyoverdine 同等のサンプルの図 1に示します (420 の吸光度との関係nm) と pyoverdine (μ m ログ10モル) 濃度を開始します。EDTA は、サンプル展示の大きな吸光測定 pyoverdine と R2達成可能だったよりは低い (<strong clas...

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High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

担鉄細胞の潜在的な地上システムで微量栄養素のバイオアベイラビリティと売り上げ高に貢献環境試料の急速なスクリーニングのためのプロトコルを提案します。

環境試料からの担鉄細胞高スループット スクリーニング: 植物細胞、一括土壌および根圏土壌

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

シデロフォアは、環境中の鉄の循環に関与する低分子量、金属キレート化生体分子です。このプロトコルは土および植物のサンプルのsiderophore活動の急速なハイ・スループットの評価を可能にする。サイドロフォア検出のための以前の方法は、微生物群集の重要な環境を排除しました。私たちの技術は、比較的無傷の微生物群集内およびそれが関与する生息地内での検出を可能にします。鉄の入手可能性は農業の生産性にとって非常に重要であるため、このプロトコルでは、植物への鉄の入手可能性を調節する微生物の役割を調査するために使用することができます。さらに、この方法は、土壌の健康とサイドロフォア生産コミュニティに対する農場管理慣行の影響と、時間の経過とともにそのようなコミュニティの発展を評価するために使用することができます。まず、CASアッセイで使用する前に最低2時間、100ミリモル塩酸100ミリモル硝酸ですべてのガラス製品を洗浄する。実験室グレードの砂で満たされたアルミニウムベーキングパンを準備し、アルミ箔でそれをカバーしています。摂氏121度で30分間オートクレーブを取り、脇に置きます。20ミリリットルの二重脱イオン水に0365グラムを加えてHDTMAを準備し、水浴中に37°Cで溶液を入れ、可溶化を促進します。25ミリリットルの二重脱イオン水に0302グラムのCASを加え、滅菌磁気攪拌棒で穏やかにかき混ぜます。その後、穏やかにかき混ぜ続けながら、CAS溶液の25ミリリットルに1モル塩化鉄六水和物の5ミリリットルを加えます。今度は、20ミリリットルのHDTMA溶液を鉄CAS錯体溶液にゆっくりと加え、穏やかにかき混ぜます。15.12グラムのPIPESを375ミリリットルの二重脱イオン水に溶解して緩衝液を調製し、穏やかに攪拌します。5モル水酸化ナトリウムでpHを6.8に調整します。その後、450ミリリットルにボリュームをもたらすために水を追加します。今、溶液にアガロースの5グラムを追加します。PIPESバッファー溶液と鉄CASの複雑な溶液を摂氏121度で30分間オートクレーブします。鉄CAS複雑な溶液の全体を、それぞれオートクレーブされた後、バイオセーフティキャビネットのPIPESバッファ全体に慎重に追加します。混合溶液を摂氏50度の水浴に入れます。今、生物安全キャビネット内の滅菌砂に滅菌試薬ボートを置き、摂氏50度に熱します。鉄CAS複合体寒天をボートに移し、その後すぐに透明な平底の無菌96ウェルマイクロプレートの各井戸に100マイクロリットルをアリコートします。前に調製した修正されたM9培地で800マイクロモルピオーバージン標準を調製する。溶液を400、200、100、50、25、12.5、および6.25マイクロモル溶液に希釈します。3.2ミリモルEDTA標準を調製するために、以前に調製された修正M9培地の500ミリリットルにEDTAを加えます。この溶液を1600、800、400、200、100、50、25、12.5、および6.25マイクロモル溶液に希釈します。標準的な曲線を生成するには、100マイクロリットルの鉄CAS錯体寒天培地を含む96ウェルマイクロプレートのウェルに、ピオーバージンとEDTAの各濃度の100マイクロリットルを加えます。各濃度の技術複製を複製します。また、M9のみで空の井戸を追加します。マイクロプレートリーダーを使用して、摂氏22度で1、6、24時間のインキュベーション後に吸光度を測定し、吸光度測定を使用して標準曲線を生成します。サンプリング装置を22ミクロンフィルター二重脱イオン水で洗浄し、その後70%エタノールを加え、ペーパータオルで拭きます。滅菌技術を維持し、クロス汚染を低減するために、サンプリング前およびサンプル間で洗浄を行います。植物組織を切除し、畑の植物から小さな根のボールを発掘した後、実験室環境でサンプル分離のために別のラベル付きビニール袋に根球を置きます。すべてのサンプルを氷の上に直接置き、サンプルがシドロフォア生産アッセイのために処理されるまで摂氏4度に保ちます。根に関連する土壌サンプルをバルク、緩く結合した根層圏土壌、および密接に結合した根球土壌に分離する。そのためには、根のボールを袋から取り出し、根のボールから土をそっと振り払います。土を振り払い、袋に残された土壌と共に、バルク土壌を構成する。これは緩く結合した根球の土壌です。しっかりと結合したサンプルで根を取り、遠心分離チューブに入れることによって、しっかりと結合した根茎の土壌を生成します。2~3分間、30ミリリットルの二重脱イオン水と渦を加えます。根を取り除き、しっかりと結合した根茎の土壌スラリー希釈を取得します。袋を開けずに可能な限り土を混合し、回すことによって、サンプルバッグ内の各土壌サンプルを均質化します。各サンプルを十分に混合した後、アリコートおよび滅菌50ミリリットル遠心管内の修飾M9培地の20ミリリットルの各土壌サンプルの2グラムを懸濁した。サンプルを希釈し、チューブを無菌フォームプラグで密封して、エアレーションを可能にします。しっかりと結合した根球サンプルの場合、無菌50ミリリットル遠心分離管内の改変M9培地の20ミリリットルに根層圏土壌スラリーの2ミリリットルを追加します。サンプルを希釈し、チューブを無菌フォームプラグで密封して、エアレーションを可能にします。組織試料を調製するために、表面は、70%エタノールで根、シュート、および穀物を殺菌する。30秒間高いブレンダーを使用して、20ミリリットルの修飾M9培地で2グラムの新鮮な組織をマセレートする。次いで、サンプルを無菌50ミリリットル遠心分離管に移し、希釈し、滅菌フォームプラグでチューブを密封する。鉄の制限を通じてシドロフォアの生産を豊かにするために、室温で50ミリリットルの遠心管をインキュベートし、160 RPMで振る。濃縮培養を起算してから24、48、および72時間で、滅菌技術を用いて濃縮管から1ミリリットルのサブサンプルを除去する。2ミリリットル遠心管で1分間Gの10,000倍のサブサンプルを遠心分離し、細胞をペレット化する。滅菌技術を使用して、重ね板内または三重に鉄CAS錯体寒天の100マイクロリットル溶液に上清の100マイクロリットルを追加します。また、無菌M9培地の100マイクロリットルをブランクとして追加します。その後、28°Cでプレートをインキュベートします。各プレートは、インキュベーターに配置する前に、封入し、ホイルで覆う必要があります。各サンプルの残りの上清とペレットを、独自の無菌2ミリリットル遠心管に吊り下げ。各サンプル上清チューブに400マイクロリットルの無菌グリセロールを加え、ペレットを再中断してグリセロールストックを作成します。後で分析するためにマイナス80°Cで在庫を凍結します。波長420ナノメートルで6時間、24時間、48時間、72時間で吸光度を測定します。シュードモナスフルオレセンスによって生合成されたピオーバージン混合物は、ピウオーバージン等価性のサンプル中のサンプル中のサンプルの吸光度をマイクロモルにおける解釈および定量化するための標準として使用された。420ナノメートルの吸光度とピオバージンの開始濃度との関係をここに示す。72時間の濃縮の副腎活性を48時間インキュベーションで評価し、セドロフォア分離に対する遺伝子型およびサンプルタイプの影響を決定した。バルク土壌サンプル中の副腎動量は比較的低く、バルク土壌がサンプリングされた小麦遺伝子型間の差を示さなかった。しかし、725遺伝子型から分離された緩やかに結合した土壌の濃縮は、マドセンと727の緩やかに結合した土壌と比較して、より大きなシデロフォア産生を示したが、レジャインからは見なかった。逆に、密結合土壌からの濃縮物におけるシドロフォア生産は、遺伝子型の影響を強く受けていない。粒組織の濃縮培養は、遺伝子型に関係なく比較的低い副腎泳動産生をもたらした。Lewjainの芽組織の濃縮は、他の遺伝子型よりも有意に低い副腎泳動産生を持ち、725のシュート組織培養はより可変的なシドロフォア産生をもたらした。シドロフォア活性の最大の違いは、725が他のすべての遺伝子型よりも200%以上のシドロフォア活性を有する根組織濃縮培養で観察された。プロトコルを実行する上で最も課税される側面の1つは、CAS鉄の寒天マイクロプレートを生成するための多くのステップを完了しながら無菌状態を維持し、シドロフォア活性のサンプルをテストすることです。クロマトグラフィー培養またはDNAベースの技術の広い配列は、さらなる生化学的検査または遺伝的特徴付けおよび代謝モデリングのために、実際のマイクロチターウェルまたはグリセロール保存培養のいずれかに適用することができる。このプロトコルシドロフォア活性を使用することにより、後でその活性を担う特定の生物とリンクさせることができ、その後、より大きな生態学的影響のメカニズムとして標的にすることができる。このプロトコルは、空気、水、堆積物を含む他の環境コンパートメントから収集されたサンプルから生成された濃縮培養物におけるシドロフォア生産を評価するために容易に変更することができる。

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

統合フィールドLysimetryと間隙水土壌中の化学物質の移動性の評価のためのサンプリングと設立植生

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

静的チャンバを用いて農用地の土壌からの温室効果ガスフラックスの測定

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栄養細胞の標的溶解によって環境サンプルからの内生胞子の物理的な分離

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A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

土壌にAtterberg塑性限界を決定するための曲げ試験

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

土壌中の微生物のリン脂質脂肪酸の抽出と分析

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

森林土壌の化学濃度の変化を監視するための土壌リサンプリングの方法

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

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3 次元 (3 D)-高スループット ゼブラフィッシュ胚配列複写のためテンプレートを印刷

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

異機種混在の研究土壌サンプリングをプロットします。

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合計サイズおよび有機・無機相互作用の調査のための土壌密度分別

Combined size and density fractionation (CSDF) is a method used to physically separate soil into fractions differing in particle size and mineralogy. CSDF ...

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