Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Kalyani Muhunthan for assistanse i laboratorium prosedyrer, Lee Opdahl for hvete genotype høsting, Washington State Concord drue forskningsråd og Washington State University Center for opprettholde landbruk og Naturressurser for en BIOAg gi for å støtte dette arbeidet. Ekstra midler ble gitt av USDA/NIFA gjennom Luke prosjekt 1014527.

Merk: Plasseringen av feltet område: Washington State University, plante patologi Farm (46 ° 46'38.0 "N 117 ° 04'57.4" W). Frøene ble sådd med en mekanisk planter på 19 oktober 2017. Hver hvete genotype ble plantet i headrows, ca 1 meter fra hverandre for å unngå overlappende med rotsystem. Plante- og jord prøvene ble samlet på 9 August 2018, da planter var klar for innhøsting. Prøvene ble samlet inn fra tre gjenskapninger av fire hvete genotyper: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
<p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biology+of+siderophores.">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li><li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophores+and+their+potential+applications:+a+review.">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li><li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+(PGPR):+emergence+in+agriculture.">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li><li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics,+Siderophore+Production,+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+&#39;Concord&#39;+Grape+Vineyards.">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from &#39;Concord&#39; Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , (2018).</li><li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway.">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li><li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity,+Abundance,+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi.">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung.">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li><li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li><li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production.">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li><li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus.">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li><li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay.">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li><li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).</li><li>Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).</li><li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria.">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9 (2017).</li><li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes.">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li><li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux.">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li><li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter.">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li><li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+Structure,+Species+Variation,+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+(Triticum+aestivum)+Cultivars.">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li><li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

Primære resultatet av dette arbeidet er produksjon av en ny metode som kan brukes til å raskt berike for siderophore produsere mikrober mens kvantitativt måle siderophore produksjon/aktivitet i miljømessige utvalget. Metodene er rask, enkel og kostnadseffektiv, og resultatene viser hvordan den kan brukes til å oppdage siderophore aktivitet fra komplekse og romanen typer (f.eks., jord og plante vev). Protokollen resulterer også i produksjonen av glyserol aksjer av berikelse kulturer, som kan lett bli tatt g...

Siderophores er viktig biomolecules involvert i jern-chelation for biotilgjengelighet, men med en lang rekke flere formål i terrestriske og akvatiske økosystemer fra mikrobiell quorum sensing, signalisering til microbial plante-verter, plante vekst forfremmelse, samarbeid og konkurranse innen komplekse mikrobielle samfunn1,2. Siderophores kan grovt klassifiseres i henhold til deres aktive nettsteder og strukturfunksjonene, opprette fire hovedtyper: carboxylate, hydroxamate, catecholate, og blandet typer3,4. Mange mikroorganismer kan skiller ut mer enn én type siderophore5 og komplekse samfunn, et stort flertall av organismer biosynthesize membran reseptorer slik at opptaket av enda større valgmulighet siderophores1, 6. Nyere arbeid indikerer at siderophores er spesielt viktig i samfunnsnivå, og selv i mellom Storbritannia kommunikasjon og biogeochemical transport7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CAS) har blitt brukt i over 30 år som chelaterande agent binde iron (Fe) slik at tillegg av ligander (dvs. siderophores) kan resultere i av CAS-Fe komplekset, å skape en lett identifiserbare fargeendring i medium 12. Når the CAS er bundet med Fe fargestoff vises som en royal blå farge og som CAS-Fe komplekset dissociates, mediet endrer farge i henhold til ligand brukes åtseleter Fe13. Den første, vannbasert mediet etablert av Schwyn og Neilands i 1987, er endret på mange måter å imøtekomme endre mikrobiell mål14, vekst vaner og begrensninger15, samt en rekke metaller foruten Fe, inkludert aluminium, mangan, kobolt, nikkel kadmium, litium, sink16, kobber17og selv arsen18.
Mange menneskelige patogener, så vel som anlegg veksten fremme mikroorganismer (PGPM) har blitt identifisert som siderophore-produserende organismer3,19,20, og viktige rhizosphere og endophytic PGPM ofte test positiv for siderophore-produksjon4. Den tradisjonelle Fe-baserte flytende metoden er tilpasset å være ferdig innen testing av isolerer i dyrking for siderophore produksjon21. Imidlertid mislykkes disse teknikkene å anerkjenne betydningen av mikrobielle samfunnet som helhet (microbiome), i samarbeid og potensielle regulering av siderophore produksjon i jord og plante systemer22. Derfor har vi utviklet en høy gjennomstrømming fellesskapet nivå vurdering av siderophore produksjon fra et gitt miljø, basert på tradisjonell CAS analysen, men med replikering, måling, pålitelighet og repeatability i en microplate analysen.
I denne studien er en kostnadseffektiv, høy gjennomstrømming CAS-Fe analysen for å oppdage siderophore produksjon presentert for å vurdere anriking av siderophore produksjon fra komplekse eksempler (dvs. jord og plante vev homogenates). Bulk, løst-bundet og tett-bundet rhizosphere jord (i form av hvordan jord var bundet til roten) ble innhentet korn, skyte og rot vev fra fire forskjellige hvete (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, og PI561727. Var hypotesen at grunnleggende forskjeller i hvete genotyper kan resultere i forskjeller i rekruttering og utvelgelse av siderophore produsere samfunn. Av spesiell interesse er forskjellen mellom mikrobielle samfunn forbundet med PI561725 isogenic linjen er aluminium tolerant fordi det har ALMT1 (aluminium-aktivert Malate Transporter 1), sammenlignet med aluminium sensitive PI561727 isogenic linje, som besitter en ikke-aluminium mottakelig form av genet, almt123,24,25,26. Det viktigste målet for studien var å utvikle en enkel, rask metode kvantitativt vurdere siderophore produksjon i siderophore berikelse kulturer av komplekse utvalg samtidig bevare kulturene for fremtiden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

Siderophores (lav-molekylær vekt metall chelaterande forbindelser) er viktige i ulike økologiske fenomenet fra iron (Fe) biogeochemical sykling i jord, patogen konkurranse, plante vekst forfremmelse og kryss-rike signalering. Videre er siderophores også av kommersiell interesse i bioleaching og bioweathering av metall-bærende mineraler og malm. En rask, kostnadseffektiv og robust betyr kvantitativt vurdere siderophore produksjon i komplekse eksempler er nøkkelen til å identifisere viktige aspekter av de økologiske konsekvensene av siderophore aktivitet, inkludert, Roman siderophore produsere mikrober. Metoden som presenteres her er utviklet for å vurdere siderophore aktivitet av inne-takt microbiome samfunn, i miljøprøver, som jord eller plante vev. Prøvene ble homogenisert og fortynnet i en endret M9 medium (uten Fe) og berikelse kulturer ble inkubert for 3 dager. Siderophore produksjon ble vurdert i eksempler på 24, 48 og 72 timer (h) med en roman 96-brønnen microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar analysen, en tilpasning av tradisjonelt kjedelig og tidkrevende kolorimetrisk metoden vurdere siderophore aktivitet, på enkelte dyrket mikrobiell isolater. Vi brukt vår metode til 4 forskjellige genotyper/linjer hvete (Triticum aestivum L.), inkludert Lewjain, Madsen, og PI561725 og PI561727 vanligvis dyrkes i innlands Pacific Northwest. Siderophore produksjon var tydelig påvirket av genotype hvete, og i bestemte typer anlegg vev observert. Vi brukt vår metode å raskt skjermen for påvirkning av anlegget genotype på siderophore produksjon, en viktig funksjon i terrestriske og akvatiske økosystemer. Vi produserte mange tekniske gjentak, gir svært pålitelig statistiske forskjeller i jord og plante vev. Viktigst, viser resultatene den foreslåtte metoden kan brukes til å raskt undersøke siderophore produksjon i komplekse prøver med en høy grad av pålitelighet, på en måte som tillater samfunn skal bevares for senere arbeid for å identifisere taxa og funksjonelle gener.

En pyoverdine blanding biosynthesized av Pseudomonas fluorescens ble brukt som standard til å tolke og kvantifisere absorbansen (på 420 nm) prøver i pyoverdine ekvivalenter i µM. figur 1 viser forholdet mellom absorbansen (420 NM) og konsentrasjonen av pyoverdine (Logg10 molarity i µM). EDTA gi ikke en tilstrekkelig standard fordi prøver utstilt større absorbansen målinger enn var oppnåelige med pyoverdine og R2 var lav...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Vi presenterer en protokoll for rask screening av miljøprøver for siderophore potensielle bidra til micronutrient bioavailability og omsetning i terrestriske systemer.

Høy gjennomstrømming Siderophore Screening fra miljøprøver: plante vev, Bulk jord og Rhizosphere jord

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophores er lav molekylvekt, metall-chelating biomolekyler involvert i jern sykling i miljøet. Denne protokollen muliggjør rask vurdering av siderophore i jord- og planteprøver. Tidligere metoder for siderophore deteksjon har eliminert det avgjørende miljøet i mikrobielle samfunnet.Vår teknikk gjør det mulig å oppdage innenfor det relativt intakte mikrobielle samfunnet og habitatet der det involverte. Fordi jerntilgjengelighet er avgjørende for landbrukets produktivitet, så i denne protokollen kan brukes til å undersøke rollen til mikrober i å modulere tilgjengeligheten av jern til planter. I tillegg kan denne metoden brukes til å vurdere virkningen av gården ledelse praksis på jord helse og siderophore-produserende samfunn samt utvikling av slike samfunn over tid.Til å begynne med vasker syre alt glass i 100 millimolar saltsyre 100 millimolar salpetersyre i minst to timer før utnyttelse i CAS-analysen. Forbered en aluminiumsbakepanne fylt med laboratoriesmig sand og dekk den med aluminiumsfolie. Autoklav ved 121 grader Celsius i 30 minutter og sett til side.Forbered HDTMA ved å legge til 0365 gram til 20 milliliter dobbelt deionisert vann, og plasser løsningen i et vannbad ved 37 grader Celsius for å fremme solubilisering. Tilsett 0302 gram CAS til 25 milliliter dobbelt deionisert vann mens du forsiktig rører med en steril magnetisk rørestang. Tilsett deretter fem milliliter av en molar jernklorid heksahydrat til 25 milliliter CAS-oppløsning mens du fortsetter å røre forsiktig.Nå, sakte legge til 20 milliliter HDTMA løsning i jern CAS kompleks løsning mens forsiktig røre. Forbered bufferløsningen ved å oppløse 15,12 gram RØR i 375 milliliter dobbelt deionisert vann med forsiktig omrøring. Juster pH til 6,8 med fem molar natriumhydroksid.Tilsett deretter vann for å bringe volumet til 450 milliliter. Legg nå til fem gram agarose til løsningen. Autoklav RØRbufferløsningen og jern-CAS-komplekse løsningen ved 121 grader Celsius i 30 minutter.Tilsett nøye hele iron CAS-komplekse løsningen til helheten av PIPES-bufferen i biosikkerhetsskapet etter at hver av dem er autoklavet. Plasser den blandede løsningen i et vannbad ved 50 grader Celsius. Plasser nå en steril reagensbåt i den sterile sanden i biosikkerhetsskapet og varme til 50 grader Celsius.Overfør jern CAS kompleks agar til båten, deretter raskt aliquot 100 mikroliter til hver brønn av en klar flatbunnet steril 96-brønns mikroplate. Forbered 800 mikromolarpyoverdinstandard i tidligere forberedt modifisert M9-medium. Fortynn oppløsningen i 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 mikromosoppløsninger.Tilsett EDTA til 500 milliliter av tidligere forberedt modifisert M9 medium for å forberede 3,2 millimolar EDTA-standarden. Fortynn denne løsningen i 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 mikromose. For å generere en standardkurve, tilsett 100 mikroliter av hver konsentrasjon av pyoverdin og EDTA for å skille brønner av en 96-brønns mikroplate som inneholder 100 mikroliter av jern CAS kompleks agar medium.Lag dupliserte tekniske replikeringer av hver konsentrasjon. Legg også til tomme brønner med bare M9. Bruk en mikroplateleser, mål absorbans etter en, seks og 24 timers inkubasjon ved 22 grader Celsius, og bruk absorbansmålinger for å generere standardkurver. Vask prøvetakingsutstyret med 22 mikronfilter dobbelt deionisert vann etterfulgt av 70% etanol og tørk med papirhåndklær.Utfør vasken før prøvetaking og mellom prøvene for å opprettholde steril teknikk og redusere krysskontaminering. Etter å ha eksisert plantevev og gravd ut en liten rotball fra planter i feltet, legg rotballen i en egen merket plastpose for prøveseparasjon i laboratoriemiljøet. Plasser alle prøvene direkte på is og hold på fire grader Celsius til prøvene er behandlet for siderophore produksjonsanalysen.Separat rot assosiert jordprøver i bulk, løst bundet jordsmonisfære jord og tett bundet jordsmonisfæren jord. For å gjøre det, ta rotballene ut av posene og rist forsiktig av jord fra rotballen. Rystet av jord, sammen med jorda igjen i posen, utgjør bulkjorda.Dette er den løst bundne jordsmoniske jorda. Generer tett bundet jord jord ved å ta røtter med den tett bundne prøven og sette dem i et sentrifugerør. Tilsett 30 milliliter dobbelt deionisert vann og virvel i to til tre minutter.Fjern røttene for å få tett bundet jordslammærslamning. Homogeniser hver jordprøve i prøveposen ved å blande og snu jorda så mye som mulig uten å åpne posen. Etter at hver prøve er grundig blandet, aliquot og suspendere to gram av hver jordprøve i 20 milliliter modifisert M9 medium innenfor en steril 50 milliliter sentrifuge rør.Fortynn prøven og forsegle deretter røret med en steril skumplugg for å tillate vanning. For tett bundne jordsmonosfæreprøver, tilsett to milliliter jordslam til 20 milliliter modifisert M9 medium i et sterilt 50 milliliter sentrifugerør. Fortynn prøven og forsegle deretter røret med en steril skumplugg for å tillate vanning.For å forberede vevsprøven steriliserer overflaten roten, skyter og korn med 70% etanol. Macerate to gram friskt vev i 20 milliliter modifisert M9 medium ved hjelp av en blender på høy i 30 sekunder. Deretter overfører du prøven til et sterilt 50 milliliter sentrifugerør, fortynner og forsegler røret med en steril skumplugg.For å berike siderophore produksjon gjennom jern begrensning inkubere de 50 milliliter sentrifuge rør ved romtemperatur og riste ved 160 RPM. Ved 24, 48 og 72 timer etter initiering av berikelseskulturen, fjern en milliliter subsamples fra berikelsesrørene ved hjelp av steril teknikk. Sentrifuge underamplene på 10,000 ganger G i ett minutt i to milliliter sentrifuge rør for å pelletize cellene.Ved hjelp av steril teknikk, tilsett 100 mikroliter av supernatant til en 100 mikroliter løsning av jern CAS kompleks agar i duplikat eller triplicate i mikroplaten. Legg også til 100 mikroliter sterile M9-medium som blanks. Deretter inkubere platen ved 28 grader Celsius.Hver plate skal forsegles og dekkes med folie før plassering i inkubatoren. Suspender gjenværende supernatant og pellet for hver prøve i sin egen sterile to milliliter sentrifuge rør. Tilsett 400 mikroliter steril glyserol i hvert prøvesupernatant rør og re-suspendere pellet for å skape glyserol aksjer.Frys aksjen på minus 80 grader Celsius for senere analyse. Mål absorbansen ved seks, 24, 48 og 72 timer ved en bølgelengde på 420 nanometer. En pyoverdinblanding biosyntetisert av Pseudomonas fluorescens ble brukt som standard for å tolke og kvantifisere absorbans av prøver i prøver av pyoverdin ekvivalens i mikromos.Forholdet mellom absorbans ved 420 nanometer og startkonsentrasjonen av pyoverdin er vist her. Siderophore aktivitet av 72 timers berikelse ble vurdert ved 48 timers inkubasjon for å bestemme påvirkning av genotype og prøvetype på siderophore isolasjon. Siderophore aktivitet i bulk jordprøver var relativt lav og viste ikke forskjeller mellom hvete genotype som bulk jord ble samplet.Imidlertid viste berikelser av løst bundet jord isolert fra 725 genotype større siderophore produksjon sammenlignet med løst bundet jord fra Madsen og 727, men ikke fra Lewjain. Derimot ble siderophore produksjon i berikelser fra tett bundet jord ikke sterkt påvirket av genotype. Berikelseskulturer av kornvev ga relativt lav siderophore produksjon uavhengig av genotype.Berikelser av Lewjain skyte vev hadde betydelig lavere siderophore produksjon enn de andre genotyper, og 725 skyte vev kulturer resulterte i mer variabel siderophore produksjon. Den største forskjellen i siderophore aktivitet ble observert i rotvev berikelse kulturer der 725 hadde mer enn 200% større siderophore aktivitet enn alle andre genotyper. En av de mest beskatning aspekter ved å utføre protokollen er å opprettholde aseptiske forhold mens du fullfører de mange trinnene for å generere CAS jern agar mikroplate og teste prøver for siderophore aktivitet.Et bredt spekter av kromatografiske kulturbaserte eller DNA-baserte teknikker kan brukes enten på selve mikrotiterbrønnen eller glyserol bevart kultur for ytterligere biokjemiske tester eller genetisk karakterisering og metabolsk modellering. Ved å bruke denne protokollen kan siderophore aktivitet senere knyttes til spesifikke organismer som er ansvarlige for denne aktiviteten eller senere målrettet som en mekanisme for større økologiske konsekvenser. Denne protokollen kan lett endres for å vurdere siderophore produksjon i berikelse kulturer generert fra prøver samlet fra andre miljørom, inkludert luft, vann og sedimenter.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Fastsettelse av Microbial Ekstracellulær enzymaktivitet i Waters, jord og sedimenter ved hjelp av høy gjennomstrømming for mikro Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Integrert Feltet Lysimetry og Porewater Prøvetaking for Evaluation of Chemical mobilitet i jordsmonn og Etablert Vegetasjon

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Måling av klimagass Flux fra jordbruksjord bruke statiske Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Fysisk Isolering av endospores fra miljøprøver ved Målrettet Lysis av vegetative celler

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

En Bending Test for Bestemme Atterberg Plastic Limit i Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Utvinning og analyse av Microbial fosfolipid fettsyrer i jordsmonn

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Metoder for Soil Omsampling å overvåke endringer i den kjemiske Konsentrasjoner av skogsjord

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensjonale (3D)-skrevet mal for høy gjennomstrømning sebrafisk Embryo stiller opp

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Prøvetaking jord i en heterogen forskning Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

Combined Size and Density Fractionation of Soils for Investigations of Organo-Mineral Interactions

Samlede størrelsen og tettheten fraksjoneres av jord for undersøkelser av Organo-Mineral interaksjoner

Combined size and density fractionation (CSDF) is a method used to physically separate soil into fractions differing in particle size and mineralogy. CSDF ...