Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
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Os autores desejam agradecer a Kalyani Muhunthan para assistência em procedimentos laboratoriais, Lee Opdahl para a colheita do trigo genótipo, Conselho de pesquisa de Washington estado Uva Concord e centro de Universidade do estado de Washington para sustentar a agricultura e Recursos naturais para um BIOAg conceder para apoiar este trabalho. Adicionais de financiamento foi fornecido pelo USDA/NIFA através de projeto da Hatch 1014527.

Nota: Localização do campo local: Universidade do estado de Washington, a fazenda de patologia de plantas (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). As sementes foram semeadas usando um plantador de mecânico em 19 de outubro de 2017. Cada genótipo de trigo foi plantado em headrows, aproximadamente 1 medidor distante para evitar a sobreposição do sistema radicular. Amostras de solo e planta foram coletadas em 9 de agosto de 2018, quando as plantas estavam prontas para a colheita. Amostras foram coletadas de três repet...

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	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus.">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li><li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay.">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li><li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).</li><li>Dertz, E. 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K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes.">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li><li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux.">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li><li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter.">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li><li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+Structure,+Species+Variation,+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+(Triticum+aestivum)+Cultivars.">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li><li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

O resultado principal deste trabalho é a produção de uma nova metodologia que pode ser usada para enriquecer rapidamente para Sideróforo produzindo micróbios ao medir quantitativamente Sideróforo/actividade de produção da amostra ambiental. A metodologia é rápida, simples e econômica, e os resultados mostram como ele pode ser usado para detectar atividade Sideróforo de tipos de amostras complexas e romance (ex.., solo e planta de tecido). O protocolo também resulta na produção de estoques de glice...

Sideróforos são biomoléculas importantes envolvidos principalmente na quelação de ferro para a biodisponibilidade, mas com uma grande variedade de efeitos adicionais nos ecossistemas terrestres e aquáticos, variando de quórum microbiana sensoriamento, sinalizando a planta microbianas-hosts, promoção de crescimento de planta, cooperação e competição dentro de comunidades microbianas complexas1,2. Sideróforos podem ser classificados de acordo com seus sites ativos e características estruturais, criando quatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate e misturado tipos3,4. Muitos microorganismos são capazes de excretar mais de um tipo de Sideróforo5 e nas comunidades do complexas, uma grande maioria dos organismos biossintetize os receptores de membrana para permitir a absorção de uma variedade ainda maior de sideróforos1, 6. Trabalho recente indica que sideróforos são particularmente importantes a nível comunitário e mesmo no Reino inter comunicação e transferências biogeoquímicos7,8,9,10 ,11.
Cromo azurol sulfonato (CAS) tem sido utilizado por mais de 30 anos como um agente quelante para ligar o ferro (Fe) de tal forma que a adição de ligantes (i.e., sideróforos) pode resultar em dissociação do complexo Fe-CAS, criando uma mudança de cor facilmente identificáveis no meio 12. quando o CAS está vinculado com o Fe, o corante aparece como uma cor azul royal, e como o complexo de CAS-Fe dissocia-se, o médio muda de cor de acordo com o tipo de ligante usado para eliminar a Fe13. O inicial, baseada em líquido médio estabelecido por Romualdo Silva e Neilands em 1987, foi modificado de várias maneiras para acomodar a alteração microbiana alvos14, hábitos de crescimento e limitações15, bem como uma variedade de metais além do Fe, incluindo alumínio, manganês, cobalto, níquel cádmio, lítio, zinco16, cobre17e nem arsênico18.
Muitos patógenos humanos, também como planta microorganismos promotores de crescimento (PGPM) foram identificados como organismos produtores de Sideróforo3,19,20e importante rizosfera e endofíticos PGPM frequentemente testar positivo para Sideróforo-produção4. O tradicional método de líquido baseado em Fe foi adaptado para microtitulação testes de isolados no cultivo para produção de Sideróforo21. No entanto, essas técnicas não reconhecem a importância da comunidade microbiana como um todo (o microbiome), em cooperação e Regulamento potencial de produção de Sideróforo no solo e planta sistemas22. Por esse motivo, nós desenvolvemos uma avaliação de nível comunitário alto rendimento de produção Sideróforo de um determinado ambiente, com base no ensaio CAS tradicional, mas com replicação, facilidade de medição, confiabilidade e repetibilidade em uma microplaca do ensaio.
Neste estudo, um ensaio CAS-Fe custo-benefício, alta produtividade para a detecção de produção Sideróforo é apresentado para avaliar o enriquecimento da produção Sideróforo de amostras complexas (ou seja, solo e planta homogenates de tecido). Solo da rizosfera granel, frouxamente ligados e firmemente ligados (em termos de como o solo era vinculado à raiz) foram obtidos juntamente com o grão, atirar e tecidos de raiz de quatro genótipos distintos trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, e PI561727. Foi hipotetisado que diferenças fundamentais em genótipos de trigo podem resultar em diferenças no recrutamento e selecção de Sideróforo produzindo comunidades. De particular interesse é a diferença entre as comunidades microbianas associadas com a linha isogénicas de PI561725, que é de alumínio tolerante porque possui ALMT1 (alumínio-ativado 1 transportador malato), comparada com o alumínio sensível PI561727 isogénicas linha, que possui uma forma de alumínio não responsiva do gene, almt123,24,25,26. O principal objetivo do estudo foi desenvolver um método simples, rápido de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em culturas de enriquecimento Sideróforo de tipos de amostras complexas, preservando as culturas para trabalhos futuros.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

Sideróforos (metal de peso molecular baixo quelantes compostos) são importantes em vários fenômeno ecológico variando de ferro (Fe) biogeoquímicos Ciclismo nos solos, a concorrência do patógeno, promoção de crescimento de planta e Cruz-Reino de sinalização. Além disso, sideróforos são também de interesse comercial em bioleaching e bioweathering de metais, minerais e minérios. Um meio rápido, custo-eficaz e robusto de avaliar quantitativamente a produção Sideróforo em amostras complexas é a chave para identificar aspectos importantes das ramificações ecológicas de atividade Sideróforo, incluindo, romance Sideróforo produzindo micróbios. O método aqui apresentado foi desenvolvido para avaliar a atividade Sideróforo no tato microbiome comunidades, em amostras ambientais, tais como tecidos de solo ou planta. As amostras foram homogeneizadas e diluídas em meio M9 modificado (sem fé), e culturas de enriquecimento foram incubadas por 3 dias. Produção de Sideróforo foi avaliada em amostras em 24, 48 e 72 horas (h) usando uma romance microplacas de 96 poços CAS (cromo azurol sulfonato)-ensaio de ágar de Fe, uma adaptação do método colorimétrico tradicionalmente tedioso e demorado de avaliação Sideróforo atividade, realizada em individuais isolados microbianos cultivados. Aplicamos o nosso método de 4 diferentes genótipos/linhas de trigo (Triticum aestivum L.), incluindo Lewjain, Madsen e PI561725 e PI561727 comumente cultivada no interior do noroeste do Pacífico. Produção Sideróforo claramente foi impactada pelo genótipo de trigo e em tipos específicos de tecidos vegetais observados. Temos utilizado com sucesso nosso método para a tela rapidamente para a influência do genótipo da planta na produção de Sideróforo, uma função fundamental nos ecossistemas terrestres e aquáticos. Nós produzimos muitas repetições de técnicas, gerando diferenças estatísticas muito confiáveis em solos e em tecidos vegetais. Importante, os resultados mostram que o método proposto pode ser usado para examinar rapidamente a produção Sideróforo em amostras complexas com um alto grau de confiabilidade, de uma forma que permite que as comunidades a ser preservado para posterior trabalho de identificar genes funcionais e táxons.

Um pyoverdine mistura biossintetizados por Pseudomonas fluorescens foi usado como um padrão para interpretar e quantificar a absorvância (a 420 nm) de amostras em termos de equivalentes de pyoverdine em µM. a Figura 1 mostra a relação entre absorbância (420 nm) e começando a concentração do pyoverdine (molaridade do Log10 em µM). EDTA não forneceram um padrão adequado porque amostras expostas as medidas de absorbância maiores ...

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High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Apresentamos um protocolo para a seleção rápida de amostras ambientais para Sideróforo potencial, contribuindo para a biodisponibilidade de micronutrientes e volume de negócios em sistemas terrestres.

Sideróforo elevado-throughput Screening de amostras ambientais: tecidos, Bulk solos e solos de rizosfera de plantas

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophores são de baixo peso molecular, biomoléculas metal-quequeantes envolvidas no ciclismo de ferro no ambiente. Este protocolo permite uma rápida avaliação de alta produtividade da atividade siderophore em amostras de solo e plantas. Métodos anteriores para detecção de siderophore eliminaram o ambiente crucial da comunidade microbiana.Nossa técnica permite a detecção dentro da comunidade microbiana relativamente intacta e no habitat em que se envolveu. Como a disponibilidade de ferro é crucial para a produtividade agrícola, esse protocolo poderia ser usado para investigar o papel dos micróbios na modulação da disponibilidade de ferro para as plantas. Além disso, esse método poderia ser utilizado para avaliar o impacto das práticas de manejo agrícola na saúde do solo e nas comunidades produtoras de siderophore, bem como no desenvolvimento dessas comunidades ao longo do tempo.Para começar, lave ácida todos os vidros em 100 mililitros de ácido nítrico 100 mililitros por um mínimo de duas horas antes da utilização no ensaio CAS. Prepare uma assadeira de alumínio cheia de areia de nível de laboratório e cubra-a com papel alumínio. Autoclave a 121 graus Celsius por 30 minutos e reserve.Prepare o HDTMA adicionando 0365 gramas a 20 mililitros de água deionizada dupla, e coloque a solução em um banho de água a 37 graus Celsius para promover a solubilização. Adicione 0302 gramas de CAS a 25 mililitros de água deionizada dupla enquanto mexe suavemente com uma barra de agitação magnética estéril. Em seguida, adicione cinco mililitros de um hexahidrato de cloreto de ferro molar aos 25 mililitros da solução CAS enquanto continua a mexer suavemente.Agora, adicione lentamente os 20 mililitros da solução HDTMA na solução complexa CAS de ferro enquanto mexe suavemente. Prepare a solução tampão dissolvendo 15,12 gramas de PIPES em 375 mililitros de água deionizada dupla com agitação suave. Ajuste o pH para 6,8 com cinco hidróxido de sódio molar.Em seguida, adicione água para levar o volume a 450 mililitros. Agora adicione cinco gramas de agarose à solução. Autoclave a solução tampão PIPES e a solução complexa CAS de ferro a 121 graus Celsius por 30 minutos.Adicione cuidadosamente a totalidade da solução complexa CAS de ferro à totalidade do buffer PIPES no armário de biossegurança depois que cada um deles foi autoclavado. Coloque a solução mista em um banho de água a 50 graus Celsius. Agora coloque um barco reagente estéril na areia estéril dentro do armário de biossegurança e aqueça a 50 graus Celsius.Transfira o ágar complexo CAS de ferro para o barco, depois alíquota rapidamente de 100 microliters para cada poço de uma microplata estéril de fundo plano claro de 96 poços. Prepare o padrão de 800 pioverdina micromolar em m9 médio modificado previamente preparado. Diluir a solução em 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções de micromolar.Adicione EDTA a 500 mililitros de meio M9 modificado previamente preparado para preparar o padrão EDTA 3,2 milimiliar. Diluir essa solução em soluções 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 micromolares. Para gerar uma curva padrão, adicione 100 microliters de cada concentração de pyoverdine e EDTA para separar poços de uma microplacão de 96 poços contendo 100 microliters de ferro cas complexo ágar médio.Faça duplicações técnicas duplicadas de cada concentração. Adicione também poços em branco com apenas M9. Usando um leitor de microplacão, meça a absorvância após uma, seis e 24 horas de incubação a 22 graus Celsius, e use medidas de absorvência para gerar curvas padrão. Lave o equipamento de amostragem com 22 mícrons filtro de água dupla deionizada seguido de 70% de etanol e limpe com toalhas de papel.Realize a lavagem antes da amostragem e entre as amostras para manter a técnica estéril e reduzir a contaminação cruzada. Depois de extirpar tecidos vegetais e escavar uma pequena bola raiz das plantas no campo, coloque a bola raiz em um saco plástico rotulado separado para separação de amostras no ambiente de laboratório. Coloque todas as amostras diretamente no gelo e mantenha-se a quatro graus Celsius até que as amostras sejam processadas para o ensaio de produção siderophore.Separar amostras de solo associadas à raiz em massa, solo de rizosfera livremente ligado e solo de rizosfera firmemente ligado. Para isso, tire as bolas de raiz dos sacos e retire suavemente o solo da bola raiz. O solo abalado, juntamente com o solo deixado no saco, compõem o solo a granel.Este é o solo da rizofera frouxamente ligado. Gere um solo de rizopshere bem amarrado, tomando raízes com a amostra bem ligada e colocando-as em um tubo de centrífuga. Adicione 30 mililitros de água deionizada dupla e vórtice por dois a três minutos.Remova as raízes para obter a diluição do solo da rizofera firmemente ligada. Homogeneize cada amostra de solo dentro do saco de amostras misturando e girando o solo o máximo possível sem abrir o saco. Após cada amostra ter sido completamente misturada, aliquot e suspender dois gramas de cada amostra de solo em 20 mililitros de meio M9 modificado dentro de um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis.Diluir a amostra e, em seguida, selar o tubo com um plugue de espuma estéril para permitir a aeração. Para amostras de rizosfera bem ligadas, adicione dois mililitros do chorume do solo da rizosfera a 20 mililitros de meio M9 modificado dentro de um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis. Diluir a amostra e, em seguida, selar o tubo com um plugue de espuma estéril para permitir a aeração.Para preparar a amostra de tecido, a superfície esteriliza a raiz, o tiro e o grão com 70% de etanol. Macerar dois gramas de tecido fresco em 20 mililitros de m9 médio modificado usando um liquidificador no alto por 30 segundos. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis, diluir e selar o tubo com um plugue de espuma estéril.Para enriquecer a produção de siderophore através da limitação do ferro, incubar os tubos de centrífugas de 50 mililitros à temperatura ambiente e agitar a 160 RPM. Aos 24, 48 e 72 horas após iniciar a cultura do enriquecimento, remova uma subsame de mililitro dos tubos de enriquecimento usando técnica estéril. Centrifugar as subsamtras a 10.000 vezes G por um minuto em dois tubos de centrífuga mililitro para pelotizar as células.Utilizando técnica estéril, adicione 100 microlitadores do supernatante a uma solução de 100 microlitres de ágar complexo CAS de ferro em duplicado ou triplicado dentro da microplape. Adicione também 100 microliters de meio M9 estéril como espaços em branco. Em seguida, incubar a placa a 28 graus Celsius.Cada placa deve ser selada e coberta com papel alumínio antes da colocação na incubadora. Suspenda o restante do supernatante e pelota para cada amostra em seu próprio tubo de centrífuga de dois mililitros estéreis. Adicione 400 microliters de glicerol estéril em cada tubo supernacante amostrado e suspenda a pelota para criar estoques de glicerol.Congele o estoque a menos 80 graus Celsius para análise posterior. Meça a absorvância em seis, 24, 48 e 72 horas em um comprimento de onda de 420 nanômetros. Uma mistura de pyoverdine biossintistritada por Pseudomonas fluorescens foi usada como padrão para interpretar e quantificar a absorção de amostras em amostras de equivalência de pyoverdine em micromolar.A relação entre a absorvância em 420 nanômetros e a concentração inicial de pyoverdine é mostrada aqui. A atividade siderophore do enriquecimento de 72 horas foi avaliada em incubação de 48 horas para determinar a influência do genótipo e do tipo amostral no isolamento siderophore. A atividade siderophore em amostras de solo a granel foi relativamente baixa e não apresentou diferenças entre o genótipo do trigo do qual o solo a granel foi amostrado.No entanto, enriquecimentos de solo livremente amarrado isolado do genótipo 725 apresentaram maior produção lateral em comparação com o solo livremente ligado de Madsen e 727, mas não de Lewjain. Por outro lado, a produção de siderophore em enriquecimentos de solo bem amarrado não foi fortemente influenciada pelo genótipo. Culturas de enriquecimento de tecido de grãos produziram produção relativamente baixa de siderophore, independentemente do genótipo.Os enriquecimentos do tecido de tiro lewjain tiveram uma produção lateral significativamente menor do que os outros genótipos, e 725 culturas de tecido de tiro resultaram em uma produção mais variável siderophore. A maior diferença na atividade siderophore foi observada nas culturas de enriquecimento de tecidos radiculares, onde 725 tinham mais de 200% mais atividade siderophore do que todos os outros genótipos. Um dos aspectos mais tributantes da execução do protocolo é manter as condições assépticas, enquanto completa as muitas etapas para gerar a microplacão cas de ferro ágar e testar amostras para atividade siderophore.Uma ampla gama de técnicas baseadas em cultura cromatográfica ou baseadas em DNA podem ser aplicadas tanto ao poço real do microtúrtero quanto à cultura preservada do glicerol para novos testes bioquímicos ou caracterização genética e modelagem metabólica. Usando este protocolo, a atividade siderophore pode mais tarde ser ligada a organismos específicos responsáveis por essa atividade ou, posteriormente, visados como um mecanismo para impactos ecológicos maiores. Este protocolo poderia ser facilmente modificado para avaliar a produção de siderophore em culturas de enriquecimento geradas a partir de amostras coletadas de outros compartimentos ambientais, incluindo ar, água e sedimentos.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Ambiente

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Integrado Campo Lysimetry e Porewater Amostragem para Avaliação de Química Mobilidade em Solos e Vegetação Fundada

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Medição do fluxo de gases com efeito de Solos Agrícolas Usando Chambers estáticos

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

Um teste de flexão para a determinação do limite de plástico Atterberg em solos

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Métodos de Reamostragem do solo para monitorar as mudanças nas concentrações químicas de Solos Florestais

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

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Um 3-dimensional (3D)-impresso modelo alto Throughput Zebrafish embrião põr

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Amostragem de solos em uma parcela de pesquisa heterogênea

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

Combined Size and Density Fractionation of Soils for Investigations of Organo-Mineral Interactions

Tamanho combinado e fracionamento de densidade de solos para as investigações de interações de Organo-Mineral

Combined size and density fractionation (CSDF) is a method used to physically separate soil into fractions differing in particle size and mineralogy. CSDF ...