Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Kalyani Muhunthan por asistencia en procedimientos de laboratorio, Lee Opdahl para la cosecha de genotipo de trigo, el Consejo de investigación de Washington estado uva Concord y la Washington State University Center para mantener la agricultura y Concesión de recursos naturales para un BIOAg para apoyar este trabajo. Financiación adicional fue proporcionada por la USDA/NIFA a través del proyecto 1014527 de la portilla.

Nota: Ubicación del sitio de campo: Universidad Estatal de Washington, planta patología granja (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 57,4 ' 04" W). Las semillas se sembraron con una sembradora mecánica en 19 de octubre de 2017. Cada genotipo de trigo se sembró en headrows, aproximadamente 1 metro de distancia para evitar la superposición del sistema radicular. Se recolectaron muestras de suelo y planta en 09 de agosto de 2018, cuando las plantas estaban listas para la cosecha. Las muestras fueron recogidas de tres repeticiones ...

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	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biology+of+siderophores.">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li><li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophores+and+their+potential+applications:+a+review.">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li><li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+(PGPR):+emergence+in+agriculture.">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li><li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics,+Siderophore+Production,+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+&#39;Concord&#39;+Grape+Vineyards.">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from &#39;Concord&#39; Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , (2018).</li><li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway.">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li><li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity,+Abundance,+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi.">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung.">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li><li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li><li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production.">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li><li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus.">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li><li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay.">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li><li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).</li><li>Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).</li><li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria.">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9 (2017).</li><li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes.">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li><li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux.">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li><li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter.">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li><li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+Structure,+Species+Variation,+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+(Triticum+aestivum)+Cultivars.">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li><li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

El principal resultado de este trabajo es la producción de una nueva metodología que puede utilizarse para enriquecer rápidamente para producir microbios y cuantitativo de medición pseudobactina producción y actividad en la muestra ambiental de pseudobactina. La metodología es rápida, sencilla y rentable, y los resultados muestran cómo puede ser utilizado para detectar actividad de pseudobactina de tipos de muestras complejas y novedosas (por ejemplo., tejido de suelo y planta). El protocolo también da ...

Sideróforos son importantes biomoléculas implicadas principalmente en la quelación del hierro de biodisponibilidad, pero con una amplia gama de propósitos adicionales en ecosistemas terrestres y acuáticos, desde la microbiana quórum sensing, señalización a microbianas-anfitriones de la planta, promoción del crecimiento vegetal, la cooperación y competición dentro de las comunidades microbianas complejas1,2. Sideróforos pueden ampliamente clasificarse según sus sitios activos y características estructurales, creando cuatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate y mezclado tipo3,4. Muchos microorganismos son capaces de excretar más de un tipo de pseudobactina5 y en comunidades complejas, una gran mayoría de organismos sintetizar los receptores de membrana para permitir la absorción de una variedad aún más amplia de sideróforos1, 6. Trabajo reciente indica que los sideróforos son particularmente importantes en el nivel de la comunidad e incluso en el Reino entre comunicaciones y transferencias biogeoquímicas7,8,9,10 ,11.
Cromo azurol sulfonato (CAS) se ha utilizado por más de 30 años como un agente quelante para enlazar el hierro (Fe) de tal manera que la adición de ligandos (es decir, sideróforos) puede resultar en la disociación del complejo CAS-Fe, creando un cambio de color fácilmente identificable en el medio 12. cuando el CAS está ligada con la Fe, el tinte aparece como un color azul real, y como se disocia el complejo de CAS-Fe, el medio cambia de color según el tipo de ligando utilizado para compactar la Fe13. El medio inicial, base líquida establecido por Schwyn y Neilands en 1987, se ha modificado de muchas maneras para cambiar microbiana objetivos14, hábitos de crecimiento y limitaciones15, así como una variedad de metales además de Fe, incluyendo aluminio, manganeso, cobalto, níquel cadmio, litio, zinc16, cobre17e incluso arsénico18.
Muchos patógenos humanos, así como microorganismos de promoción de crecimiento (PGPM) han sido identificados como organismos productores de pseudobactina3,19,20y rizosfera importante y endófitos PGPM a menudo prueba positivo para la producción de pseudobactina4. El método líquido basado en la Fe tradicional se ha adaptado para microtitulación pruebas de aislamientos en cultivo para producción de pseudobactina21. Sin embargo, estas técnicas no reconocer la importancia de la comunidad microbiana en su totalidad (microbioma), en cooperación y regulación potencial de pseudobactina producción en suelos y sistemas de planta22. Por esa razón, hemos desarrollado una evaluación de nivel de la comunidad de alto rendimiento de pseudobactina producción de un entorno dado, basado en el análisis tradicional de CAS, pero con replicación, facilidad de medición, fiabilidad y repetibilidad en una microplaca ensayo.
En este estudio, se presenta un análisis de CAS-Fe rentable, de alto rendimiento para la detección de pseudobactina producción para evaluar el enriquecimiento de la producción de pseudobactina de muestras complejas (es decir, suelo y planta de homogenados de tejido). Suelo de la rizosfera a granel, limite y firmemente enlazado (en términos de cómo la tierra estuvo limitada a la raíz) se obtuvieron junto con grano, disparar y los tejidos de la raíz de cuatro genotipos distintos de trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, y PI561727. Fue presumido que diferencias fundamentales en los genotipos de trigo podrían resultar en diferencias en el reclutamiento y selección de pseudobactina comunidades productoras. De particular interés es la diferencia entre las comunidades microbianas asociadas con la línea isogénicas de PI561725, que es de aluminio tolerante porque posee ALMT1 (aluminio activación malato Transporter 1), en comparación con el aluminio sensible PI561727 isogénicas línea, que posee una forma sensible sin aluminio del gene, almt123,24,25,26. El objetivo principal del estudio fue desarrollar un método sencillo y rápido de evaluar cuantitativamente pseudobactina producción en cultivos de enriquecimiento pseudobactina de tipos de muestras complejas mientras que preserva las culturas para el trabajo futuro.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

Sideróforos (quelantes de compuestos del metal de bajo peso molecular) son importantes en el fenómeno ecológico diversos que van desde ciclo biogeoquímicos hierro (Fe) en los suelos, a la competencia de patógeno, promoción del crecimiento vegetal y Cruz-Reino de señalización. Además, sideróforos son también de interés comercial en biolixiviación y bioweathering de metal-minerales y los minerales. Un medio rápido, eficaz y robusto de evaluar cuantitativamente la producción de pseudobactina en muestras complejas es clave para la identificación de aspectos importantes de las consecuencias ecológicas de pseudobactina actividad, incluyendo, novela pseudobactina producir microbios. El método presentado aquí fue desarrollado para evaluar actividad de pseudobactina de comunidades del microbioma en el tacto, en muestras ambientales, tales como los tejidos de la planta o el suelo. Las muestras fueron homogeneizadas y diluidas en un medio modificado de M9 (sin Fe), y cultivos de enriquecimiento se incubaron por 3 días. Producción de pseudobactina se evaluó en las muestras a las 24, 48 y 72 horas (h) utilizar una microplaca de 96 pozos novela CAS (cromo azurol sulfonato)-ensayo de agar de Fe, una adaptación del método colorimétrico de evaluar pseudobactina tradicionalmente tedioso y lento actividad, el individuo cultiva cepas microbianas. Aplicamos nuestro método a 4 genotipos líneas de trigo (Triticum aestivum L.), incluyendo Lewjain, PI561725, Madsen y PI561727 comúnmente cultivadas en el Pacífico noroeste interior. Producción de pseudobactina fue afectado claramente por el genotipo de trigo y en los tipos específicos de tejidos vegetales observados. Hemos utilizado con éxito nuestro método para detectar rápidamente la influencia del genotipo de la planta en producción de pseudobactina, una función clave en los ecosistemas terrestres y acuáticos. Produjimos muchas repeticiones técnicas, produciendo diferencias estadísticas muy confiables en suelos y en los tejidos vegetales. Lo importante, los resultados muestran que el método propuesto puede utilizarse para examinar rápidamente la producción de pseudobactina en muestras complejas con un alto grado de fiabilidad, de manera que permite a las comunidades a preservarse para que trabajo posterior identificar taxones y genes funcionales.

Un pyoverdine mezcla biosynthesized por Pseudomonas fluorescens fue utilizado como un estándar para interpretar y cuantificar la absorbancia (a 420 nm) de las muestras en términos de equivalentes de pyoverdine en μm. la figura 1 muestra la relación entre la absorbancia (420 nm) y a partir de la concentración del pyoverdine (molaridad de Log10 en μm). EDTA no presentó un nivel adecuado porque muestras expuestas medidas de absorbancia...

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High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Presentamos un protocolo para la detección rápida de muestras ambientales para pseudobactina potencial contribuyendo a micronutrientes biodisponibilidad y volumen de ventas en sistemas terrestres.

Pseudobactina high-throughput Screening de muestras ambientales: los tejidos, a granel suelos y rizosfera de suelos de la planta

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Los sideróforos son biomoléculas quelantes de metal de bajo peso molecular quelantes implicadas en el ciclo de hierro en el medio ambiente. Este protocolo permite una evaluación rápida de alto rendimiento de la actividad de sideróforo en muestras de suelos y plantas. Los métodos anteriores para la detección de sideróforos han eliminado el entorno crucial de la comunidad microbiana.Nuestra técnica permite la detección dentro de la comunidad microbiana relativamente intacta y el hábitat en el que participa. Debido a que la disponibilidad de hierro es crucial para la productividad agrícola, por lo que en este protocolo podría utilizarse para investigar el papel de los microbios en la modulación de la disponibilidad de hierro a las plantas. Además, este método podría utilizarse para evaluar el impacto de las prácticas de gestión de las granjas en la salud del suelo y las comunidades productoras de sideróforos, así como el desarrollo de dichas comunidades a lo largo del tiempo.Para empezar, lave a ácido toda la cristalería en 100 mililitros de ácido nítrico 100 mililitros durante un mínimo de dos horas antes de su uso en el ensayo CAS. Prepare una bandeja para hornear de aluminio llena de arena de laboratorio y cúbrala con papel de aluminio. Autoclave a 121 grados centígrados durante 30 minutos y reserva.Prepare HDTMA añadiendo 0365 gramos a 20 mililitros de agua desionizada doble, y coloque la solución en un baño de agua a 37 grados centígrados para promover la solubilización. Agregue 0302 gramos de CAS a 25 mililitros de agua desionizada doble mientras remueve suavemente con una barra de agitación magnética estéril. A continuación, añada cinco mililitros de un hexahidrato de cloruro de hierro molar a los 25 mililitros de solución de CAS mientras continúa agitando suavemente.Ahora, agregue lentamente los 20 mililitros de solución HDTMA a la solución compleja CAS de hierro mientras remueve suavemente. Prepare la solución tampón disolviendo 15,12 gramos de PIPES en 375 mililitros de agua desionizada doble con agitación suave. Ajuste el pH a 6,8 con un hidróxido de sodio molar.A continuación, agregue agua para llevar el volumen a 450 mililitros. Ahora agregue cinco gramos de agarosa a la solución. Autoclave la solución tampón PIPES y la solución compleja CAS de hierro a 121 grados Celsius durante 30 minutos.Agregue cuidadosamente la totalidad de la solución compleja CAS de hierro a la totalidad del tampón PIPES en el gabinete de bioseguridad después de que cada uno de ellos haya sido autoclavado. Coloque la solución mixta en un baño de agua a 50 grados centígrados. Ahora coloque un bote reactivo estéril en la arena estéril dentro del gabinete de bioseguridad y caliente a 50 grados centígrados.Transfiera el agar complejo CAS de hierro al barco, luego aliquot 100 microlitros rápidamente a cada pozo de una microplaca estéril de fondo plano claro de 96 pocódigo. Preparar 800 micromolar pyoverdine estándar en medio M9 modificado previamente preparado. Diluir la solución en soluciones micromolares 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 y 6.25.Agregue EDTA a 500 mililitros del medio M9 modificado previamente preparado para preparar el estándar EDTA de 3,2 mililitros. Diluir esta solución en soluciones de micromolar 1600, 800, 400, 200, 100, 25, 12,5 y 6,25. Para generar una curva estándar, añada 100 microlitros de cada concentración de pyoverdina y EDTA para separar los pozuelos de una microplaca de 96 pocóculos que contenga 100 microlitros de acero CAS complejo medio de agar.Realice replicaciones técnicas duplicadas de cada concentración. También agregue pozos en blanco con sólo M9. Usando un lector de microplacas, mida la absorbancia después de una, seis y 24 horas de incubación a 22 grados Celsius, y utilice mediciones de absorbancia para generar curvas estándar. Lave el equipo de muestreo con 22 micras de filtro de doble agua desionizada seguida de 70% de etanol y limpie con toallas de papel.Realice el lavado antes del muestreo y entre muestras para mantener la técnica estéril y reducir la contaminación cruzada. Después de excisar los tejidos de las plantas y excavar una pequeña bola de raíz de las plantas en el campo, coloque la bola de raíz en una bolsa de plástico etiquetada separada para la separación de la muestra en el entorno de laboratorio. Coloque todas las muestras directamente sobre hielo y manténgalos a cuatro grados centígrados hasta que se procesen muestras para el ensayo de producción de sideróforos.Separe las muestras de suelo asociadas a la raíz en suelo de rizosfera a granel, libremente unido y suelo rizoesfera estrechamente unido. Para ello, saque las bolas de raíz de las bolsas y sacuda suavemente el suelo de la bola de raíz. Sacudido fuera del suelo, junto con el suelo dejado en la bolsa, comprenden el suelo a granel.Este es el suelo de rizosfera libremente unido. Generar firmemente unido rizopsa suelo tomando raíces con la muestra estrechamente unida y poniéndolas en un tubo centrífugo. Añadir 30 mililitros de agua desionizada doble y vórtice durante dos a tres minutos.Retire las raíces para obtener la dilución de lodos del suelo de rizoesfera estrechamente unida. Homogeneizar cada muestra de suelo dentro de la bolsa de muestra mezclando y girando el suelo tanto como sea posible sin abrir la bolsa. Después de que cada muestra se haya mezclado a fondo, aliquot y suspenda dos gramos de cada muestra de suelo en 20 mililitros de medio M9 modificado dentro de un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros.Diluir la muestra y luego sellar el tubo con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación. Para muestras de rizosfera estrechamente unidas, agregue dos mililitros de lodo del suelo de rizosfera a 20 mililitros de medio M9 modificado dentro de un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros. Diluir la muestra y luego sellar el tubo con un tapón de espuma estéril para permitir la aireación.Para preparar la muestra de tejido, esterilizar la superficie la raíz, disparar y el grano con 70%etanol. Macerar dos gramos de tejido fresco en 20 mililitros de medio M9 modificado utilizando una licuadora en alto durante 30 segundos. A continuación, transfiera la muestra a un tubo centrífugo estéril de 50 mililitros, diluya y selle el tubo con un tapón de espuma estéril.Para enriquecer la producción de sideroforo a través de la limitación del hierro incubar los tubos centrífugos de 50 mililitros a temperatura ambiente y agitar a 160 RPM. A las 24, 48 y 72 horas después de iniciar el cultivo de enriquecimiento, retire las submuestras de un mililitro de los tubos de enriquecimiento mediante una técnica estéril. Centrifugar las submuestras a 10.000 veces G durante un minuto en dos tubos centrífugos de mililitro para peletizar las células.Utilizando una técnica estéril, añada 100 microlitros del sobrenadante a una solución de 100 microlitros de agar complejo CAS de hierro por duplicado o triplicado dentro de la microplaca. Añadir también 100 microlitros de medio estéril M9 como espacios en blanco. Luego incubar la placa a 28 grados centígrados.Cada placa debe sellarse y cubrirse con papel de aluminio antes de su colocación en la incubadora. Suspenda el sobrenadante y el pellet restantes para cada muestra en su propio tubo de centrífuga estéril de dos mililitros. Añadir 400 microlitros de glicerol estéril en cada tubo de sobrenadante de muestra y volver a suspender el pellet para crear existencias de glicerol.Congele el stock a menos 80 grados centígrados para su posterior análisis. Mida la absorbancia a las seis, 24, 48 y 72 horas a una longitud de onda de 420 nanómetros. Una mezcla de pyoverdina biosintetizada por Pseudomonas fluorescens se utilizó como estándar para interpretar y cuantificar la absorbancia de muestras en muestras de equivalencia de pyoverdine en micromolares.La relación entre la absorbancia a 420 nanómetros y la concentración inicial de pyoverdina se muestra aquí. La actividad siderofófora del enriquecimiento de 72 horas se evaluó a las 48 horas de incubación para determinar la influencia del genotipo y el tipo de muestra en el aislamiento de sideróforo. La actividad de sideroforo en muestras de suelo a granel era relativamente baja y no presentaba diferencias entre el genotipo de trigo del que se muestreaba el suelo a granel.Sin embargo, los enriquecimientos de suelos sueltos aislados del genotipo 725 mostraron una mayor producción de sideróforo en comparación con el suelo libremente unido de Madsen y 727 pero no de Lewjain. Por el contrario, la producción de sideroforo en enriquecimientos de suelo estrechamente ligado no fue fuertemente influenciada por el genotipo. Los cultivos de enriquecimiento de tejido de grano arrojaron una producción de sideróforo relativamente baja independientemente del genotipo.Los enriquecimientos del tejido de brote de Lewjain tuvieron una producción de sideróforo significativamente menor que los otros genotipos, y 725 cultivos de tejido de brote resultaron en una producción de sideróforo más variable. La mayor diferencia en la actividad de sideróforo se observó en cultivos de enriquecimiento de tejido radicular donde 725 tenía más de 200%mayor actividad de sideróforo que todos los demás genotipos. Uno de los aspectos más gravosos de la ejecución del protocolo es el mantenimiento de condiciones asépticas mientras se completan los muchos pasos para generar la microplaca de agar de hierro CAS y las muestras de prueba para la actividad del sideroforo.Se puede aplicar una amplia gama de técnicas cromatográficas basadas en cultivos o en ADN, ya sea al pozo de microtíter real o al cultivo preservado por glicerol para más pruebas bioquímicas o caracterización genética y modelado metabólico. Mediante el uso de este protocolo de actividad siderophore puede vincularse más tarde con organismos específicos responsables de esa actividad o posteriormente dirigidos como un mecanismo para impactos ecológicos más grandes. Este protocolo podría modificarse fácilmente para evaluar la producción de sideróforos en cultivos de enriquecimiento generados a partir de muestras recogidas de otros compartimentos ambientales, incluidos el aire, el agua y los sedimentos.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Investigación

Medio ambiente

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Lysimetry Integrado de campo y toma de muestras de agua intersticial para la Evaluación de la Movilidad de Química en Suelos y Vegetación Establecido

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

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Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

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