Name: high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils
Uploaded: 2019-02-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

Författarna vill tacka Kalyani Muhunthan för bistånd i laboratorierutiner, Lee Opdahl för skörd av vete-genotyp, Washington State Concord Grape forskningsrådet och Washington State University Center for upprätthålla jordbruket och Naturresurser för ett BIOAg bidrag för att stödja detta arbete. Ytterligare finansiering tillhandahölls av den USDA/NIFA genom lucka projektet 1014527.

Obs: Plats i fältet plats: Washington State University, växt patologi Farm (46 ° 46' 38,0 ”N 117 ° 04' 57,4” W). Frön såddes med en mekanisk plantageägare på 19 oktober 2017. Varje vete genotyp planterades i headrows, cirka 1 meter isär för att undvika överlappning av rotsystemet. Växt och jord prover samlades på 9 augusti 2018, när plantorna var redo för skörd. Prover samlades från tre replikat av fyra vete genotyper: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.
1. beredning av mod...

<ol>
	<li>Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+cheating+and+cheating+resistance+shape+competition+for+iron+in+soil+and+freshwater+Pseudomonas+communities.">Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li><li>Ghirardi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Traits+Shared+by+Rhizosphere-Competent+Strains+of+Fluorescent+Pseudomonads.">Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads.</a> Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).</li><li>Hider, R. C., Kong, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biology+of+siderophores.">Chemistry and biology of siderophores.</a> Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).</li><li>Saha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+siderophores+and+their+potential+applications:+a+review.">Microbial siderophores and their potential applications: a review.</a> Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).</li><li>Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth-promoting+rhizobacteria+(PGPR):+emergence+in+agriculture.">Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture.</a> World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).</li><li>Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetics,+Siderophore+Production,+and+Iron+Scavenging+Potential+of+Root+Zone+Soil+Bacteria+Isolated+from+&#39;Concord&#39;+Grape+Vineyards.">Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from &#39;Concord&#39; Grape Vineyards.</a> Microbial Ecology. , (2018).</li><li>Li, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+human+fungal+pathogen+Candida+albicans+promotes+the+growth+and+proliferation+of+commensal+Escherichia+coli+through+an+iron-responsive+pathway.">The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway.</a> Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).</li><li>Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity,+Abundance,+and+Localization+of+Quorum+Sensing+Receptors+in+Vibrio+harveyi.">Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>O'Brien, S., Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+multispecies+social+interactions+in+shaping+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenicity+in+the+cystic+fibrosis+lung.">The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung.</a> Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).</li><li>Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cheating+on+Cheaters+Stabilizes+Cooperation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Current Biology. 28 (13), (2018).</li><li>Popat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+modification+via+a+quorum+sensing+molecule+influences+the+social+landscape+of+siderophore+production.">Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).</li><li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore+production+of+African+dust+microorganisms+over+Trinidad+and+Tobago.">Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago.</a> Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).</li><li>Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+siderophore+aerobactin+by+a+halophilic+Pseudomonad.">Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad.</a> Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).</li><li>Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-CAS,+a+fast+and+universal+method+for+siderophore+detection.">O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).</li><li>Nakouti, I., Hobbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+studying+ion+uptake+by+actinomycetes.">A new approach to studying ion uptake by actinomycetes.</a> Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).</li><li>Wang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diisonitrile+Natural+Product+SF2768+Functions+As+a+Chalkophore+That+Mediates+Copper+Acquisition+in+Streptomyces+thioluteus.">Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus.</a> Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).</li><li>Retamal-Morales, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+arsenic-binding+siderophores+in+arsenic-tolerating+Actinobacteria+by+a+modified+CAS+assay.">Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).</li><li>Desai, A., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).</li><li>Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).</li><li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria.">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7, 9 (2017).</li><li>Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plant+and+rhizospheric+microbiota+as+stable+interactomes.">Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes.</a> Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).</li><li>Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+transcriptome+analysis+of+Arabidopsis+thaliana+exposed+to+beneficial+Bacillus+subtilis+FB17+rhizobacteria+revealed+genes+for+bacterial+recruitment+and+plant+defense+independent+of+malate+efflux.">Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux.</a> Planta. 238 (4), 657-668 (2013).</li><li>Sasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wheat+gene+encoding+an+aluminum-activated+malate+transporter.">A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter.</a> The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).</li><li>Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+Structure,+Species+Variation,+and+Potential+Functions+of+Rhizosphere-Associated+Bacteria+of+Different+Winter+Wheat+(Triticum+aestivum)+Cultivars.">Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).</li><li>Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+analysis+of+sticky+chromosomes+in+aluminum+tolerant+and+susceptible+wheat+lines+grown+in+soils+of+differing+aluminum+saturation.">Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation.</a> Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).</li><li>McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microbial+Communities+in+Soil,+Rhizosphere,+and+Roots+in+Perennial+Grass+Experiments.">Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).</li><li>Mirleau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+in+soil+and+rhizosphere+of+Pseudomonas+fluorescens+C7R12+compared+with+a+C7R12+mutant+affected+in+pyoverdine+synthesis+and+uptake.">Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake.</a> FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+from+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Blue+Agar+CAS+Assay+for+Siderophore+Detection.">Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection.</a> Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li></ol>

Det primära resultatet av detta arbete är produktionen av en ny metod som kan användas för att snabbt berika för siderophore producerar mikrober medan kvantitativt mäta siderophore/produktionsverksamhet i miljömässiga provet. Metoden är snabb, enkel och kostnadseffektiv, och resultaten visar hur det kan användas för att upptäcka siderophore aktivitet från komplexa och romanen provtyper (e.g., jord och växt vävnad). Protokollet också resulterar i produktion av glycerol lager av anrikning kulturer,...

Sideroforer är viktiga biomolekyler deltar främst i järn-kelering för biotillgänglighet, men med ett brett utbud av ytterligare syften i terrestra och akvatiska ekosystem alltifrån mikrobiell quorum sensing, signalering till mikrobiell växt-värdar, växternas tillväxtfrämjande, samarbete och konkurrens inom komplexa mikrobiella samhällen1,2. Sideroforer kan grovt delas enligt deras aktiva webbplatser och strukturella funktioner, att skapa fyra grundläggande typer: bildas, hydroxamate, catecholate, och blandade typer3,4. Många mikroorganismer klarar av att utsöndra mer än en typ av siderophore5 och i komplexa samhällen, en stor majoritet av organismer biosynthesize membran receptorerna så att upptaget av ett ännu bredare utbud av sideroforer1, 6. Senaste arbete visar att sideroforer är särskilt viktiga på gemenskapsnivå, och även i Inter kungariket kommunikation och biogeokemiska överföringar7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CAS) har använts i över 30 år som en kelatbildare binda järn (Fe) på ett sådant sätt att tillägget av ligander (dvs. sideroforer) kan resultera i dissociation av CAS-Fe komplexet, skapa en lätt identifierbar färg förändringar på medellång 12. När the CAS är bundna med Fe, färgen visas som en royal blå färg och som CAS-Fe komplexet dissocierar, medellång ändrar färg beroende på typ av liganden som används för att rensa de Fe13. Den inledande, vätskebaserade medium som grundades 1987, av Schwyn och Neilands har ändrats på många sätt att rymma ändra mikrobiell mål14, tillväxt vanor och begränsningar15, samt en mängd olika metaller förutom Fe, inklusive aluminium, mangan, kobolt, kadmium nickel, litium, zink16, koppar17och även arsenik18.
Många mänskliga patogener, samt som växt tillväxt att främja mikroorganismer (PGPM) har identifierats som siderophore-producerande organismer3,19,20, och viktiga odlingsbädden och Endofytisk PGPM ofta testa positivt för siderophore-produktion4. Den traditionella Fe-baserade flytande metoden har anpassats till mikrotiter testning av isolat i odling för siderophore produktion21. Dock dessa tekniker inte inser vikten av mikrobiell gemenskapen som helhet (mikrobiomet), i samarbete och potentiella reglering av siderophore produktion i jordar och växt system22. Därför har vi utvecklat en hög genomströmning gemenskapsnivå bedömning av siderophore produktion från en viss miljö, baserad på den traditionella CAS-analysen, men med replikering, enkel mätning, pålitlighet och repeterbarhet i en mikroplattan assay.
I denna studie presenteras en kostnadseffektiv, hög genomströmning CAS-Fe-analys för att upptäcka siderophore produktion för att bedöma anrikningen av siderophore produktion från komplexa prover (dvs, mark och anläggning vävnad homogenates). Bulk, löst bundna och tätt-bundna odlingsbädden jord (i termer av hur jorden var bunden till roten) erhölls tillsammans med korn, skjuta och roten vävnader från fyra distinkta vete (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, och PI561727. Det antogs att grundläggande skillnader i de vete genotyperna kan leda till skillnader i rekrytering och urval av siderophore producerar samhällen. Av särskilt intresse är skillnaden mellan mikrobiella samhällen är associerad med PI561725 syngena linjen, vilket är aluminium toleranta eftersom det äger ALMT1 (aluminium-aktiverad Malate transportören 1), jämfört med aluminium känsliga PI561727 syngena line, som äger en icke-aluminium responsiv form av genen, almt123,24,25,26. Det främsta syftet med studien var att utveckla en enkel, snabb metod för att kvantitativt bedöma siderophore produktion i siderophore anrikning kulturer av komplexa provtyper samtidigt bevara kulturer för det framtida arbetet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex</td>
			<td>LF451320014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Baking Pan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>152315A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave and Sterilizer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>171428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAS (Chrome Azurol S)</td>
			<td>Chem-Impex Int&#39;l Inc)</td>
			<td>000331-27168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>1521754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>JI2476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol, Anhydrous</td>
			<td>Baker Analyzed</td>
			<td>C22634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide</td>
			<td>Reagent World</td>
			<td>FZ0941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloride acid</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>B0756767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 PRO plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (III) chloride hexahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0342179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Fume Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Incubator</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>27855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niric Acid, (69-70)%</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>72287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES buffer, 98.5%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0338723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, dibaisc,powder</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>J48594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyoverdine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>078M4094V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SI-600R Shaker</td>
			<td>Lab Companion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, granular</td>
			<td>Fiesher Scientific</td>
			<td>136539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide, pellets</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>G48K53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99%</td>
			<td>ACROS Organic</td>
			<td>A0371705</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput siderophore screening from environmental samples: plant tissues, bulk soils, and rhizosphere soils

Sideroforer (lågmolekylärt metall kelaterande föreningar) är viktiga i olika ekologiska fenomen alltifrån järn (Fe) biogeokemiska cykling i jordar, till patogen konkurrens, växt tillväxtfrämjande och cross-rike signalering. Sideroforer är dessutom också kommersiella intresset bioupplösning och bioweathering av metall-bärande mineraler och malmer. En snabb, kostnadseffektiv och robust innebär att kvantitativt bedöma siderophore produktion i komplexa prover är nyckeln till att identifiera viktiga aspekter av ekologiska konsekvenserna av siderophore verksamhet, inklusive, roman siderophore producerar mikrober. Metoden presenteras här har utvecklats för att bedöma siderophore aktivitet i i-takt mikrobiomet gemenskaperna, miljöprov, såsom jord eller växt vävnader. Proverna var homogeniserad och utspädd i en modifierad M9 medium (utan Fe) och anrikning kulturer inkuberades i 3 dagar. Siderophore produktion bedömdes i prover vid 24, 48 och 72 timmar (h) med en roman 96 brunnar mikroplattan CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, en anpassning av traditionellt tråkiga och tidskrävande kolorimetriska metoden för att bedöma siderophore verksamhet, som utförs på enskilda odlade mikrobiell isolat. Vi tillämpade vår metod till 4 olika genotyper/linjer av vete (Triticum aestivum L.), inklusive Lewjain, Madsen, och PI561725 och PI561727 som ofta odlas i inlandet Pacific Northwest. Siderophore produktionen påverkades helt klart av genotypen av vete, och i de särskilda typerna av växt vävnader observerades. Vi har framgångsrikt använt vår metod att snabbt skärmen för påverkan av växten genotyp på siderophore produktion, en nyckelfunktion i terrestra och akvatiska ekosystem. Vi producerade många tekniska replikat, ger mycket tillförlitliga statistiska skillnader i jordar och inom växt vävnader. Ännu viktigare, visar resultaten den föreslagna metoden kan användas för att snabbt behandla siderophore produktion i komplexa prover med en hög grad av tillförlitlighet, på ett sätt som gör att samhällen att bevaras för senare arbete att identifiera taxa och funktionella gener.

En pyoverdine blandning biosyntetiseras av Pseudomonas fluorescens användes som en standard för att tolka och kvantifiera absorbans (vid 420 nm) av prover i form av pyoverdine medel i µM. diagram 1 visar förhållandet mellan absorbans (420 nm) och börjar koncentrationen av pyoverdine (Log10 molariteten i µM). EDTA inte ger en tillräcklig standard eftersom prover utställda större absorbansen mätningar än var uppnåeligt med pyove...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils at JoVE.com

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Vi presenterar ett protokoll för snabb screening av miljöprov för siderophore potential bidrar till mikronäringsämnen biotillgänglighet och omsättning i terrestra system.

High-throughput Siderophore Screening från miljöprover: växt vävnader, Bulk jordar och odlingsbädden jordar

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Siderophores är låg molekylvikt, metall-kelat biomolekyler som deltar i järn cykling i miljön. Detta protokoll möjliggör snabb hög genomströmning bedömning av siderophore verksamhet i jord och växtprover. Tidigare metoder för siderophore upptäckt har eliminerat den avgörande miljön i det mikrobiella samhället.Vår teknik möjliggör upptäckt inom den relativt intakta mikrobiella samhället och den livsmiljö som det innebar. Eftersom järn tillgänglighet är avgörande för jordbrukets produktivitet, så i detta protokoll skulle kunna användas för att undersöka den roll som mikrober i modulera tillgången på järn till växter. Dessutom skulle denna metod kunna användas för att bedöma effekterna av jordbruksförvaltningsmetoder på markens hälsa och siderophore-producerande samhällen samt utvecklingen av sådana samhällen över tiden.Till att börja med, syra tvätta alla glas i 100 millimolar saltlösning 100 millimol salpetersyra i minst två timmar före utnyttjande i CAS-analysen. Förbered en aluminiumbakningspanna fylld med sand av laboratoriekvalitet och täck den med aluminiumfolie. Autoklavera vid 121 grader Celsius i 30 minuter och ställ åt sidan.Förbered HDTMA genom att lägga till 0365 gram till 20 milliliter dubbel avjoniserat vatten, och placera lösningen i ett vattenbad vid 37 grader Celsius för att främja solubilisering. Tillsätt 0302 gram CAS till 25 milliliter dubbel avjoniserat vatten medan du försiktigt rör om med en steril magnetisk stirbar. Tillsätt sedan fem milliliter av en molar järnklorid hexahydrat till 25 milliliter cas-lösning samtidigt som du fortsätter att försiktigt röra.Nu, tillsätt långsamt 20 milliliter HDTMA lösning i järn CAS komplexa lösningen medan försiktigt omrörning. Förbered buffertlösningen genom att lösa upp 15,12 gram rör i 375 milliliter dubbel avjoniserat vatten med varsamt omrörning. Justera pH-värdet till 6,8 med fem molar natriumhydroxid.Tillsätt sedan vatten för att få volymen till 450 milliliter. Nu lägga till fem gram agaros till lösningen. Autoklavera PIPAs buffertlösning och järn CAS-komplexlösningen vid 121 grader Celsius i 30 minuter.Tillsätt noggrant hela den komplexa lösningen av järn CAS till hela PIPES-bufferten i biosäkerhetsskåpet efter att var och en av dem har autoklaverats. Placera den blandade lösningen i ett vattenbad vid 50 grader Celsius. Placera nu en steril reagensbåt i den sterila sanden i biosäkerhetsskåpet och värm till 50 grader Celsius.Överför järn CAS komplexa agar till båten, sedan snabbt aliquot 100 mikroliter till varje brunn av en klar plattbottnad steril 96-väl mikroplatta. Förbered 800 mikromolar pyoverdin standard i tidigare beredd modifierad M9 medium. Späd lösningen i 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, och 6,25 mikromolarlösningar.Lägg till EDTA till 500 milliliter av tidigare förberett modifierat M9-medium för att förbereda 3,2 millimolar EDTA-standarden. Späd ut denna lösning i 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, och 6,25 mikromolarlösningar. För att generera en standardkurva, tillsätt 100 mikroliter av varje koncentration av pyoverdin och EDTA för att separera brunnar av en 96-brunns mikroplatta som innehåller 100 mikroliter av järn CAS-komplexagarium.Gör duplicerade tekniska replikeringar av varje koncentration. Lägg även till tomma brunnar med endast M9. Med hjälp av en mikroplattläsare mäter du absorbans efter en, sex och 24 timmars inkubation vid 22 grader Celsius och använder absorbansmätningar för att generera standardkurvor. Tvätta provtagningsutrustningen med 22 mikronfilter dubbel avjoniserat vatten följt av 70%etanol och torka av med hushållspapper.Utför tvätten före provtagning och in mellan proverna för att bibehålla steril teknik och minska korskontaminering. Efter excation växtvävnader och gräva en liten rotboll från växter i fältet, placera rotkulan i en separat märkt plastpåse för provseparation i laboratoriemiljön. Placera alla prover direkt på is och hålla vid fyra grader Celsius tills prover bearbetas för siderophore produktionsanalys.Separat rot associerade jordprover i bulk, löst bundna rhizosfär jord och tätt bundna rhizosfär jord. För att göra det, ta rotbollarna ur påsarna och skaka försiktigt av jord från rotbollen. Skakad av jord, tillsammans med jorden kvar i påsen, utgör bulkjord.Detta är den löst bundna rhizosfären jord. Generera tätt bunden rhizopshere jord genom att ta rötter med tätt bundna provet och sätta dem i en centrifug röret. Tillsätt 30 milliliter dubbel avjoniserat vatten och virvel i två till tre minuter.Ta bort rötterna för att få den tätt bundna rhizosfären jord slurry utspädning. Homogenisera varje jordprov inom provpåsen genom att blanda och vrida jorden så mycket som möjligt utan att öppna påsen. Efter att varje prov har blandats grundligt, alikvot och suspendera två gram av varje jordprov i 20 milliliter modifierat M9-medium inom ett sterilt centrifugerrör på 50 milliliter.Späd provet och sedan försegla röret med en steril skumplugg för att möjliggöra avluftning. För tätt bundna rhizosfärprover, tillsätt två milliliter av jordslammen rhizosfären till 20 milliliter modifierat M9-medium i ett sterilt centrifugeringsrör på 50 milliliter. Späd provet och sedan försegla röret med en steril skumplugg för att möjliggöra avluftning.För att förbereda vävnadsprovet, ytsterilisera roten, skjuta, och korn med 70%etanol. Macerate två gram färsk vävnad i 20 milliliter modifierad M9 medium med hjälp av en mixer på hög i 30 sekunder. Sedan, överföra provet till en steril 50 milliliter centrifugrör, späd, och försegla röret med en steril skum plugg.Att berika produktionen av siderophore genom järnbegränsning inkubera de 50 millilitercentrifugerören vid rumstemperatur och skaka vid 160 RPM. Vid 24, 48 och 72 timmar efter att anrikningskulturen initierats, avlägsnar du en milliliter-delprov från anrikningsrören med steril teknik. Centrifugera delproven vid 10, 000 gånger G i en minut i två milliliter centrifugrör för att pelletisera cellerna.Med hjälp av steril teknik, tillsätt 100 mikroliter av supernatanten till en 100 mikroliterlösning av järn CAS-komplexagar i två exemplar eller tre exemplar inom mikroplattan. Lägg även till 100 mikroliter av sterilt M9 medium som ämnen. Sedan inkubera plattan vid 28 grader Celsius.Varje platta ska förseglas och täckas med folie före placering i inkubatorn. Suspendera resterande supernatant och pellet för varje prov i sitt eget sterila två milliliter centrifugrör. Tillsätt 400 mikroliter av steril glycerol i varje prov supernatant rör och åter upphäva pelleten för att skapa glycerol lager.Frys beståndet på minus 80 grader Celsius för senare analys. Mät absorbansen vid sex, 24, 48 och 72 timmar vid en våglängd på 420 nanometer. En pyoverdinblandning som biosyntetiseras av Pseudomonas fluorescens användes som standard för att tolka och kvantifiera absorbans av prover i prover av pyoverdinekvivalens i mikromolar.Förhållandet mellan absorbans vid 420 nanometer och startkoncentrationen av pyoverdin visas här. Siderophore verksamhet av 72 timmars anrikning bedömdes vid 48 timmar inkubation för att bestämma påverkan av genotyp och prov typ på siderophore isolering. Siderophore-aktiviteten i bulkjordprover var relativt låg och uppvisade inte skillnader mellan den vete genotyp från vilken bulkjorden provsmakas.Anrikningar av löst bunden jord som isolerats från 725 genotypen uppvisade dock större siderophore-produktion jämfört med den löst bundna jorden från Madsen och 727 men inte från Lewjain. Omvänt påverkades siderophore produktion i anrikning från tätt bunden jord inte tungt av genotyp. Anrikning kulturer av säd vävnad gav relativt låg siderophore produktion oavsett genotyp.Anrikningar av Lewjain skjuta vävnad hade betydligt lägre siderophore produktion än de andra genotyper, och 725 skjuta vävnad kulturer resulterade i mer variabel siderophore produktion. Den största skillnaden i siderophore verksamhet observerades i rot vävnad anrikning kulturer där 725 hade mer än 200%större siderophore verksamhet än alla andra genotyper. En av de mest beskatta aspekter av verkställande av protokollet är att upprätthålla aseptiska villkor samtidigt som du fyller i många steg för att generera CAS järn agar mikroplatta och testa prover för siderophore aktivitet.Ett brett spektrum av kromatografisk kulturbaserad eller DNA-baserade tekniker kan tillämpas antingen på den faktiska mikrotiter väl eller glycerol bevaras kultur för ytterligare biokemiska tester eller genetisk karakterisering och metabolisk modellering. Genom att använda detta protokoll siderophore verksamhet kan senare kopplas till specifika organismer som ansvarar för denna verksamhet eller därefter riktade som en mekanism för större ekologiska effekter. Detta protokoll skulle lätt kunna ändras för att bedöma siderophore produktion i anrikning kulturer som genereras från prover som samlats in från andra miljöavdelningar inklusive luft, vatten och sediment.

Research

JoVE Journal

Environment

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Fastställande av mikrobiell extracellulär enzymaktivitet i Vatten, Jord och sediment med hjälp av hög genomströmning mikroplattor Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Integrerad fält Lysimetry och porvatten Provtagning för utvärdering av kemiska mobilitet i jord och Etablerad Vegetation

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Mätning av Greenhouse Gas Flux från jordbruksmark Använda Statiska Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Fysisk Isolering av Endospores från miljöprover genom riktade Lys av vegetativa celler

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

En Bending test för att bestämma den Atterberg Plastic Limit i jordar

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Utvinning och analys av mikrobiell Phospholipid fettsyror i jordar

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Metoder för mark Omsampling att övervaka förändringar i de kemiska koncentrationer av skogsmark

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

En 3-dimensionell (3D)-tryckt mall för hög genomströmning zebrafiskar Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Provtagning jordar i en heterogen forskning tomt

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

Combined Size and Density Fractionation of Soils for Investigations of Organo-Mineral Interactions

Kombinerad storlek och densitet fraktionering av jordar för undersökningar av Organo-Mineral interaktioner

Combined size and density fractionation (CSDF) is a method used to physically separate soil into fractions differing in particle size and mineralogy. CSDF ...