Name: sample preparation for mass-spectrometry-based proteomics analysis of ocular microvessels
Uploaded: 2019-02-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels at JoVE.com

Dr. Manicam er understøttet af de interne Universitet forskningsmidler (Stufe 1) fra University Medical Center af Johannes Gutenberg Universitet Mainz og tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

Alle eksperimentelle procedurer ved hjælp af animalske prøver blev udført i nøje overholdelse af foreningen for forskning i Vision og oftalmologi (ARVO) erklæring om brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning og af institutionelle retningslinjer. Denne undersøgelse blev gennemført og godkendt på Institut for oftalmologi, University Medical Center Mainz.
Bemærk: Svin øjne synsnerven og ekstraokulær væv blev indhentet friske fra det lokale slagteri straks efter sla...

<ol>
	<li>Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honor&#233;, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+proteomics+with+emphasis+on+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry.">Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.</a> Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).</li><li>Gregorich, Z. R., Ge, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+proteomics+in+health+and+disease:+Challenges+and+opportunities.">Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities.</a> Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function.">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537, 347-355 (2016).</li><li>Cehofski, L. J., Mandal, N., Honor&#233;, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+platforms+in+vitreoretinal+proteomics.">Analytical platforms in vitreoretinal proteomics.</a> Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).</li><li>Manicam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Unravels+the+Regulatory+Mechanisms+in+Human+Tears+Following+Acute+Renouncement+of+Contact+Lens+Use:+A+Comparison+between+Hard+and+Soft+Lenses.">Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses.</a> Scientific Reports. 8, 11526 (2018).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+(PRR+4)+in+human+tear+proteome.">Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome.</a> Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+human+tears+from+aqueous-deficient+and+evaporative+dry+eye+patients.">Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients.</a> Scientific Reports. 6, 29629 (2016).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+reflex+tear+proteome+reveals+high+expression+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+(PRR4).">Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4).</a> Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).</li><li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+aqueous+humour+proteome:+A+comparison+of+the+genders.">Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders.</a> PloS ONE. 12, 0172481 (2017).</li><li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+ciliary+artery+circulation+in+health+and+disease+the+Weisenfeld+lecture.">Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 749-757 (2004).</li><li>Zeitz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma+progression+is+associated+with+decreased+blood+flow+velocities+in+the+short+posterior+ciliary+artery.">Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery.</a> British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).</li><li>Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+use+of+Sus+scrofa+(pig)+as+a+model+system+for+proteomic+studies.">Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies.</a> Proteomics. 11, 776-793 (2011).</li><li>Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+of+selective+retinal+capillary+closure+induced+by+embolization+with+fluorescent+microspheres.">A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).</li><li>Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+insight+into+the+proteome+landscape+of+the+porcine+short+posterior+ciliary+arteries:+Key+signalling+pathways+maintaining+physiologic+functions.">First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions.</a> Scientific Reports. 6, 38298 (2016).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).</li><li>Feist, P., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+challenges:+sample+preparation+techniques+for+microgram-quantity+protein+analysis+from+biological+samples.">Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).</li><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mouse+liver+plasma+membrane:+use+of+differential+extraction+to+enrich+hydrophobic+membrane+proteins.">Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins.</a> Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+recovery+and+identification+of+membrane+proteins+from+rat+hepatic+cells+using+a+centrifugal+proteomic+reactor.">Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).</li><li>de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+proteomics+to+the+management+of+vascular+disorders.">Contribution of proteomics to the management of vascular disorders.</a> Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).</li><li>Cottingham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1DE+proves+its+worth...+again.">1DE proves its worth... again.</a> Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).</li></ol>

Omfattende proteomet profilering af en bred vifte af okulær prøver er en vigtig og uundværlig første skridt til at belyse molekylære mekanismer og signalering veje impliceret i sundhed og sygdom. For at få data af høj kvalitet og sikre reproducerbarheden af resultaterne fra disse analyser de foregående prøve forberedelsestrin er vigtigt, som understreget i en anmeldelse af Mandal et al., diskuteres indgående prøve behandling procedurer til forskellige dele af øjet beskæftiger to-dimensionelle gel elektrofore...

Avancement inden for proteomics, hvilke tilladelser integreret og uovertruffen data indsamling magt, har stærkt revolutioneret vores forståelse for de molekylære mekanismer bag visse sygdomstilstande samt som afspejler den fysiologiske tilstand af en bestemt celle population eller væv1,2,3,4. Proteomics har også vist sig for at være en vigtig platform i oftalmologiske forskning på grund af følsomhed og uvildig analyse af forskellige okulær prøver, at den lettere identifikation af potentielle sygdom markører til endelige diagnose og prognose, som fremgår elegant af mange undersøgelser i de seneste år, herunder nogle af vores1,5,6,7,8,9,10. Det er dog ofte vanskeligt at opnå menneskelige prøver for proteom analyser af etiske grunde, især i betragtning af behovet for kontrolmateriale fra raske personer for pålidelig komparative analyser. På den anden side er det også udfordrende at opnå tilstrækkelig mængde af prøver for optimal og pålidelig massespektrometrisk analyser. Dette er især vigtigt for masse-begrænsede biologiske materialer såsom mikro-blodkar i øjet. En sådan større retrobulbær blodkar, som spiller afgørende roller i reguleringen af okulær blodgennemstrømningen er den korte bageste ciliaere arterie (sPCA). Enhver undertrykkelse af netbårne eller uregelmæssigheder i denne vaskulære seng kan resultere i alvorlige kliniske konsekvenser, hvilket kan føre til patogenesen af flere sight-truende sygdomme såsom grøn stær og nonarteritic forreste iskæmisk optisk neuropati (NAION)11 , 12. men der er en manglende undersøgelser belyse proteomet ændringer i denne arteriel sengen på grund af de ovennævnte ulemper. Derfor, i de seneste år, har huset svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) opstået som en god dyremodel i oftalmologiske forskning på grund af de høje morfologiske og fylogenetiske ligheder mellem mennesker og svin13, 14,15. Svin okulær prøver er let tilgængelige og vigtigst, er mere nøjagtig repræsentation af menneskelige væv.
I betragtning af den vigtige rolle af disse blodkar i øjet, samt mangel på metodik sørget for effektiv protein udvinding og analyser fra disse microvessels, har vi tidligere karakteriseret proteomet af svin sPCA ved hjælp af en in-house protokol, der resulterede i identifikation af et stort antal proteiner16. Baseret på denne undersøgelse, har vi yderligere optimeret og beskrevet dybdegående vores metodologi i denne artikel, som tillader proteomet analyse fra små mængder af prøver ved hjælp af de svin sPCA som model væv. Omend det vigtigste formål med denne undersøgelse var at etablere en MS-kompatibel metode til masse-limited okulær blodkar, har vi givet betydelige eksperimentelle bevismateriale at arbejdsprocessen beskrives også kan anvendes bredt til forskellige væv-baserede prøver.
Det er forestillede sig, at denne arbejdsproces vil være medvirkende til forberedelse af høj kvalitet MS-kompatible prøver fra små mængder af materialer til omfattende proteomet analyser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1040px;" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:436px;">A. Chemicals</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1, 4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">1.11474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium bicarbonate (ABC, CH&#8325;NO&#8323;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5.33005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Calcium chloride dihydrate (CaCl2)&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>5239.1</td>
			<td>2.5 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Formic acid (CH2O2)</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A0748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N)</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A1605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HPLC-grade methanol (CH3OH)</td>
			<td style="width:281px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC-grade water&#160;</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A1589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kalium chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>4.7 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>1.2 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS-grade acetic acid</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AE69.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium sulphate (MgSO4)&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td style="width:120px;">261.2</td>
			<td>1.2 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Antioxidant</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE LDS Sample buffer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>4x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Sample reducing agent&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td style="width:281px;">Promega</td>
			<td style="width:120px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>9265.2</td>
			<td>118.3 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>965.3</td>
			<td>25 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trifluoroacetic acid (TFA,&#160; C2HF3O2)</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">108178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>6780.1</td>
			<td>11 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B. Reagents and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5mm zirconium oxide beads&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.0mm zirconium oxide beads&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">ZROB10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining&#160; Kit</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">LC6025</td>
			<td>To stain 25 mini gels per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">71772-3</td>
			<td>20 reactions per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER)</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">78510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. Tools</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well V-bottom plates</td>
			<td style="width:281px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:120px;">651180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:281px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">CLS3595-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable microtome blades</td>
			<td>pfm Medical</td>
			<td>207500014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scalpels #21</td>
			<td>pfm Medical</td>
			<td>200130021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection pins&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:120px;">PK47.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon conical centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mayo scissors, Tough cut</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision tweezers</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Type 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td style="width:281px;">Carl Roth</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>Type 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-adhesive sealing films for microplates</td>
			<td style="width:281px;">Ratiolab (vWR)</td>
			<td style="width:120px;">RATI6018412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Vannas spring scissors</td>
			<td>&#160;Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas capsulotomy scissors&#160;&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Geuder</td>
			<td style="width:120px;">19760</td>
			<td>&#160;Straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZipTipC18 pipette tips</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D. Equipment and devices</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 &#215; 0.5 mm BioBasic C18 column</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">72105-150565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 &#215; 0.5 mm BioBasic C18 pre-column&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">72105-030515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">UFC500396</td>
			<td>Pack of 96.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>H51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autosampler&#160;</td>
			<td>CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland</td>
			<td style="width:120px;">HTS Pal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BBY24M Bullet Blender Storm&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">NA-BB-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf concentrator, model 5301</td>
			<td style="width:281px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">Z368172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microcentrifuge, model 5424</td>
			<td style="width:281px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">05-403-93</td>
			<td>Non-refrigerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heraeus Primo R Centrifuge</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">75005440</td>
			<td>Refrigerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Labsonic M Ultrasonic homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Sartorius</td>
			<td style="width:120px;">BBI-8535027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS pump, model Rheos Allegro</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">22080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LTQ Orbitrap XL mass spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiskan Ascent plate reader&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Labsystems</td>
			<td style="width:120px;">v2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator with vortex&#160;</td>
			<td style="width:281px;">neoLab</td>
			<td style="width:120px;">7-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Titanium probe (&#216; 0.5mm, 80mm long)</td>
			<td style="width:281px;">Sartorius</td>
			<td style="width:120px;">BBI-8535612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonic bath, type RK 31</td>
			<td style="width:281px;">Bandelin</td>
			<td style="width:120px;">329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xcell Surelock Mini Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>El0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass-spectrometry-based proteomics analysis of ocular microvessels

Brug af isolerede okulær blodkar in vitro-at dechifrere den patofysiologiske tilstand i øjet ved hjælp af avancerede teknologiske metoder har stærkt udvidet vores forståelse af visse sygdomme. Massespektrometri (MS)-baseret proteomics fremstod som et kraftfuldt værktøj til at optrævle ændringer i de molekylære mekanismer og protein signalering veje i de vaskulære senge i sundhed og sygdom. Prøven forberedelsestrin før MS analyser er imidlertid afgørende at få reproducerbare resultater og grundig udredning af det komplekse proteomet. Dette er især vigtigt for forberedelse af okulær microvessels, hvor mængden af prøven til analyser er ofte begrænset og således udgør en udfordring for optimal protein udvinding. Denne artikel bestræber sig på at yde en effektiv, hurtig og robust protokol for forberedelse af prøver fra en eksemplarisk retrobulbær okulær vaskulære seng beskæftiger de svin kort bageste ciliaere arterier. De nuværende metode fokuserer på protein ekstraktion procedurer fra både supernatanten og pellet af prøven efter homogenisering, prøve rengøring med centrifugal filter anordningerne inden endimensional gel elektroforese og peptid rensning trin til label-fri kvantificering i en liquid chromatography-electrospray Ionisation-lineær ion trap-Orbitrap MS system. Selvom denne metode er blevet udviklet specielt til proteomics analyser af okulær microvessels, har vi også givet overbevisende beviser for at det kan også være let ansat til andre væv-baserede prøver.

Begrænset udsnit tilgængelighed er en af de store ulemper i oftalmologiske forskning. Tilsvarende, udvindingsmetoder for optimal protein udbytte fra små mængder af prøver som okulær blodkar er ofte diskutabel. Til dato, er der en mangel på metoder dækket især protein udvinding fra retrobulbær blodkar. Derfor, som et første trin i metoden optimering og som en proof-of-principle at sammenligne effektivitet og robusthed af flere almindeligvis ansat protein udvinding rengøringsmid...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels at JoVE.com

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Proteom karakterisering af okulær mikrovaskulære senge er afgørende for dybdegående forståelse af mange okulær sygdomme hos mennesker. Denne undersøgelse viser en effektiv, hurtig og robust metode for protein udvinding og forberedelse af prøver fra små blodkar, der beskæftiger de svin kort bageste ciliaere arterier som model skibe til masse-massespektrometri-baseret proteomics analyser.

Prøveforberedelse til masse-massespektrometri-baseret Proteomics analyser af okulær Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Udarbejdelse af massespektrometrikompatible prøver af høj kvalitet til omfattende proteomanalyse af okulære prøver er afgørende for at belyse de molekylære mekanismer og signalveje, der er impliceret i sundhed og sygdom. Den beskrevne arbejdsflow repræsenterer en enkel, men robust tilgang til strenge prøveforberedelsestrin, der specifikt er taget højde for analyse af massenedholdte prøver såsom okulære mikro blodkar. Selv om hovedformålet med undersøgelsen er at fastlægge en MS-kompatibel metode for okulære blodkar, kan den beskrevne arbejdsflow anvendes bredt på forskellige celle- og vævsbaserede prøver.Generelt, personer nye til denne metode kan kæmpe, fordi identifikation og isolering af den valgte korte posterior ciliae arterie, eller SPCA grene, kan være udfordrende. Friske svin øjne, sammen med synsnerven og ekstraokulært væv, blev opnået fra det lokale slagteri straks post-mortem. Placer øjet kloden i en dissektion kammer, der indeholder iskolde Krebs-Henseleit buffer.Skær forsigtigt væk omkringliggende muskler og væv med et par skarpe Mayo saks. Lav et snit med en skalpel, og skær kloden langs ækvatoriale plan med et par skarpe Mayo saks, indtil øjet er adskilt i den forreste og bageste halvdele. Fjern så meget glasagtig krop som muligt fra den bageste halvdel af øjet ved hjælp af et par standard mønster kraftvibe.Efter at have brugt dissektion stifter til omhyggeligt pin ned den bageste halvdel af øjet, forsigtigt skæres væk bindevæv omkring synsnerven, at udsætte den underliggende retrobulbar vaskulatur med et par studerende Vannas foråret saks. Isoler den paraoptiske og distale korte posterior ciliaearterie sammen med det omgivende bindevæv med et par type fem præcision pincet og Vannas capsulotomy saks. Fjern forsigtigt bindevæv fra arteriesegmenterne ved hjælp af ekstra fine pincet og saks, før de isolerede arterier skylles i iskold PBS for at fjerne forurenende stoffer og blodrester.Pool arterier fra to øjne for at opnå en biologisk replika, derefter veje prøverne ved hjælp af en analytisk balance. Til hvert rør tilsættes en blanding af 0,5 og en millimeter zirkoniumoxidperler efterfulgt af reagens til vævsproteinekstraktion. Nu indlæse prøven rør i en blender homogenisator.Indstil timeren til to minutter, indstil hastighedsniveauet til seks, og start homogeniseringen. Efter endt kørsel kontrolleres prøverne for fuldstændig homogenisering, og prøverne opbevares på is mellem hver løbetur. Cyklussen gentages, indtil prøverne er fuldstændig homogeniserede.Pipette homogeniseres forsigtigt til friske mikrocentrifugerør. Centrifuge prøverne ved 10,000 gange G i 20 minutter ved fire grader Celsius til pellet uopløselige proteiner. Forsigtigt pipette supernatant indeholder opløselige proteiner uden at røre pellet lag, og overføres til friske mikrocentrifuge rør.Der tilsættes 200 mikroliter ekstraktionsbuffer 2A og fem mikroliter proteasehæmmercocktail til hver pelletprøve. Derefter suspendere pellet flere gange med en pipette. Brug en ultralydshomogenisator til helt at homogenisere pellet.Indstil amplituden til 60 og cyklussen til en. Brug en sonde af titanium, som er egnet til homogenisering af prøver med små mængder. Sænk sonden i pellet- og ekstraktionsbufferblandingen på is, og tryk på startknappen.Sonikere prøven, indtil pelletklumperne er fuldstændig homogeniseret, pauser i et par sekunder mellem hver sonikering. Kontroller for fuldstændig homogenisering visuelt. Homogenatet blandes flere gange med en pipette for at sikre, at der ikke er klumper.Brug centrifugalfilterenheder med tre kilodalton cutoff til denne procedure. Sæt den tre kilodalton cutoff filterenhed i et mikrocentrifugerør. Pipette 200 mikroliter af prøve homogenat til en filterenhed, og tilsæt 200 mikroliter af deioniseret vand i samme filter.Efter udjævning det sikkert, placere filteret enhed i en centrifuge, og spin i 14, 000 gange G i 15 minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering adskilles filterenheden, der indeholder prøvekoncentratet, fra det mikrocentrifugerør, der indeholder filtratet, og filtratet kasseres. Rekonstituere koncentratet ved at tilsætte 400 mikroliter deioniseret vand i filterenheden.Efter at have gentaget filtreringen tre gange, pipetteres forsigtigt det rensede prøvekoncentrat i en ren mikrorør. Forbered prøverne til endimensional gelelektroforese som anført i tekstprotokollen, og bland godt med en pipette. Varm prøverne ved 70 grader Celsius i en tør blok varmelegem i 15 minutter, og afkøles til stuetemperatur.Belastning omhyggeligt 50 mikrogram prøve pr vognbane ved hjælp af en pipette, samt den forudindstillede proteinstandard som molekylær massemarkør. Kør gelerne i ca. 60 minutter ved en konstant spænding på 175 volt. I slutningen af løbet fjernes gelen forsigtigt fra kassetten med en gelkniv, og gelen overføres til en gelfarvningskasse.Udfør fastsættelse og farvning af gelen som beskrevet i tekstprotokollen. Ryst gelerne i farvningsopløsningen natten over for at opnå de bedste samlede resultater. Farvningsopløsningen dekanteres omhyggeligt, og den udskiftes med 200 milliliter deioniseret vand, før gelerne rystes i mindst syv til otte timer i vand for at rydde baggrunden.Punktafgifter proteinbåndene fra gelen med rene nye mikrotomblade. Skær båndet i små stykker, og overfør forsigtigt gelstykkerne i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Der tilsættes 500 mikroliter afstainerende opløsning indeholdende 100 millimolar ammoniumbikarbonat og acetonitril.Prøverne inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter med lejlighedsvis omrystning. Pipetter forsigtigt af destaining-opløsningen. Kontroller visuelt for eventuelle rør med resterende plet, og gentag dette trin, hvis gel stykker stadig er farves blå.Tilsæt ca. 400 mikroliter frisklavet DTT-opløsning, og inkuber ved 56 grader Celsius i 30 minutter. Efter at reducereopløsningen er kasseret med en pipette, tilsættes ca. 400 mikroliter frisklavet IAS-opløsning, og der inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter. Fjern den alkylerende buffer med en pipette, og kassér den.Tilsæt 500 mikroliter af pæn acetonitril ved stuetemperatur i 10 til 15 minutter, indtil gelstykkerne krymper og bliver uigennemsigtige. Pipette ud acetonitrile, og lufttørre gel stykker i fem til 10 minutter under kølerhjelmen. Derefter pipette 50 mikroliter trypsin opløsning i hvert rør til helt at dække gel stykker, og inkubere rørene ved fire grader Celsius.Efter 30 minutter tilsættes tilstrækkelig mængde trypsinbuffer til helt at dække gelstykkerne, hvis det er nødvendigt. Inkuber prøverne natten over ved 37 grader Celsius. For at udføre peptidekstraktion, pipetteres omhyggeligt den ekstraherede peptidopløsning fra rørene og overføres til rene mikrorør.Supernatanten tørres af i en centrifugalvakuumfordator. Tilsæt 100 mikroliter af ekstraktionsbuffer til hvert rør med gelstykker, og inkuber i 30 minutter med omrystning. Pipette supernatanten i de samme mikrorør, der indeholder de ekstraherede peptider i henhold til deres respektive bånd, og tør ned i en vakuumcentrifuge.Gå videre til peptidrensning og flydende kromatografi-elektrospray ionisering MS / MS analyser som beskrevet i tekstprotokollen. Den samlede mængde proteiner i prøver ekstraheret med hver type vaskemiddel er afbildet her. Det højeste udbytte kom fra væv, der blev udvundet med en vævsproteinekstraktionsbuffer, efterfulgt af DDM, CHAPS, ASB-14 og det laveste udbytte fra ACN og TFA.Konsekvent var de samlede identificerede proteiner også de højeste i den udtrukne prøve af tissueproteinekstraktionsbuffer og fulgte samme tendens som det samlede udbytte. Vist her er sammenligningen af den endimension gel elektroforese protein profiler af SPCA, før og efter at være blevet udsat for den optimerede prøve forberedelse og rengøring trin. Samlet set blev der observeret en høj grad af udtværing og dårlig adskillelse af proteinbåndene ved vognbane tre.Denne profil viser, at prøverne kan indeholde ekstraktion reagens, og også forurenende stoffer såsom lipider og cellulære snavs. Men SPCA prøver, der blev opdelt i supernatant og pellet, og derefter udsat for den optimerede protokol, resulterede i eksemplarisk endimensionale gel elektroforese profiler. Den optimerede metode til hurtig, robust og effektiv proteinekstraktion fra okulære mikroløg kan også let anvendes på andre vævsbaserede prøver.Vist her er protein profiler af supernatant og pellet af murine hjerne og hjertevæv prøver. Under forsøget på denne procedure, er det vigtigt at huske at udsætte prøverne for fuldstændig homogenisering, at adskille supernatanten fra pellet, og at fjerne forurenende stoffer og ekstraktion reagenser. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for eksperimentel og translationel oftalmologi til grundigt at udforske proteome af oscular vaskulatur ved hjælp af svin øjne som model.

Research

JoVE Journal

Biology

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolisk mærkning og membranfraktionering for Komparativ proteomiske analyse af<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomiske Prøveforberedelse fra formalin Faste og Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Berigelse af ekstracellulære matrixproteiner fra væv og fordøjelse til peptider for massespektrometri Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Prøvefremstilling til Mass cytometrianalyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

En alternativ metode til Sample Preparation med lav Cell Antal for TEM Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniaturiserede prøveforberedelse til transmissions Elektron Mikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Omfattende arbejdsgang af massespektrometri-baserede Shotgun Proteomics af vævsprøver

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Prøveforberedelse til metabolisk profilering ved hjælp af MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...