Name: sample preparation for mass-spectrometry-based proteomics analysis of ocular microvessels
Uploaded: 2019-02-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels at JoVE.com

Dr. Manicam stützt sich auf die interne Universität Forschungsförderung (Stufe 1) aus dem Universitätsklinikum der Johannes-Gutenberg-Universität Mainz und ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

Alle experimentelle Verfahren mit tierischen Proben wurden unter strikter Einhaltung der Association for Research in Vision und Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und von institutionellen Richtlinien durchgeführt. Diese Studie wurde durchgeführt und an der Abteilung für Augenheilkunde, University Medical Center Mainz genehmigt.
Hinweis: Porcines Augen zusammen mit Sehnerv und extraokulären Geweben stammen frisch...

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	<li>Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honor&#233;, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+proteomics+with+emphasis+on+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry.">Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.</a> Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).</li><li>Gregorich, Z. R., Ge, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+proteomics+in+health+and+disease:+Challenges+and+opportunities.">Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities.</a> Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function.">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537, 347-355 (2016).</li><li>Cehofski, L. J., Mandal, N., Honor&#233;, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+platforms+in+vitreoretinal+proteomics.">Analytical platforms in vitreoretinal proteomics.</a> Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).</li><li>Manicam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Unravels+the+Regulatory+Mechanisms+in+Human+Tears+Following+Acute+Renouncement+of+Contact+Lens+Use:+A+Comparison+between+Hard+and+Soft+Lenses.">Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses.</a> Scientific Reports. 8, 11526 (2018).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+(PRR+4)+in+human+tear+proteome.">Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome.</a> Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+human+tears+from+aqueous-deficient+and+evaporative+dry+eye+patients.">Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients.</a> Scientific Reports. 6, 29629 (2016).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+reflex+tear+proteome+reveals+high+expression+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+(PRR4).">Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4).</a> Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).</li><li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+aqueous+humour+proteome:+A+comparison+of+the+genders.">Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders.</a> PloS ONE. 12, 0172481 (2017).</li><li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+ciliary+artery+circulation+in+health+and+disease+the+Weisenfeld+lecture.">Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 749-757 (2004).</li><li>Zeitz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma+progression+is+associated+with+decreased+blood+flow+velocities+in+the+short+posterior+ciliary+artery.">Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery.</a> British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).</li><li>Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+use+of+Sus+scrofa+(pig)+as+a+model+system+for+proteomic+studies.">Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies.</a> Proteomics. 11, 776-793 (2011).</li><li>Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+of+selective+retinal+capillary+closure+induced+by+embolization+with+fluorescent+microspheres.">A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).</li><li>Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+insight+into+the+proteome+landscape+of+the+porcine+short+posterior+ciliary+arteries:+Key+signalling+pathways+maintaining+physiologic+functions.">First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions.</a> Scientific Reports. 6, 38298 (2016).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).</li><li>Feist, P., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+challenges:+sample+preparation+techniques+for+microgram-quantity+protein+analysis+from+biological+samples.">Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).</li><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mouse+liver+plasma+membrane:+use+of+differential+extraction+to+enrich+hydrophobic+membrane+proteins.">Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins.</a> Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+recovery+and+identification+of+membrane+proteins+from+rat+hepatic+cells+using+a+centrifugal+proteomic+reactor.">Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).</li><li>de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+proteomics+to+the+management+of+vascular+disorders.">Contribution of proteomics to the management of vascular disorders.</a> Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).</li><li>Cottingham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1DE+proves+its+worth...+again.">1DE proves its worth... again.</a> Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).</li></ol>

Umfassende Proteom Profilierung der unterschiedlichsten okuläre Proben ist eine wichtige und unverzichtbare erste Schritt, die molekularen Mechanismen und Signalwege verwickelt in Gesundheit und Krankheit aufzuklären. Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus diesen Analysen zu gewährleisten, die vorhergehenden Probe Vorbereitungsschritte sind von entscheidender Bedeutung, wie hervorgehoben in einer Rezension von Mandal Et Al., die eingehende diskutiert die Probe Verarbe...

Die Weiterentwicklung im Bereich der Proteomik, welche Genehmigungen integriert und unübertroffen Daten Sammlung macht, hat unser Verständnis der molekularen Mechanismen, die bestimmte Erkrankungen ebenso wie in reflektiert stark revolutioniert die physiologischen Zustand einer bestimmten Zelle Bevölkerung oder Gewebe1,2,3,4. Proteomics auch erwies sich eine wichtige Plattform in Augenheilkunde aufgrund der Empfindlichkeit und unvoreingenommene Analyse der verschiedenen augenfälligen Proben, die Identifizierung von potenziellen Krankheitsmarker für eventuelle Diagnose und Prognose, als erleichtert belegt elegant durch viele Studien in den letzten Jahren, darunter auch einige von uns1,5,6,7,8,9,10. Allerdings ist es oft schwierig, humanen Proben für Proteomic Analysen aus ethischen Gründen, vor allem in Anbetracht der Notwendigkeit für Kontrollmaterial von gesunden Personen für zuverlässige vergleichende Analysen zu erhalten. Auf der anderen Seite ist es auch schwierig, genügend Proben für optimale und zuverlässige massenspektrometrische Analysen zu erhalten. Dies ist besonders wichtig für die Masse zeitlich begrenzte biologische Materialien wie die Mikro-Blutgefäße des Auges. Eine solche große retrobulbären Blutgefäß, das spielt entscheidende Rolle bei der Regulierung der okulären Durchblutung ist die kurzen hinteren ciliary Arterie (sPCA). Jede Störung oder Anomalien in diesem Kreislauf Bett führen schwere klinische Auswirkungen die Pathogenese verschiedener Sicht lebensbedrohliche Krankheiten wie Glaukom und Nonarteritic anterior ischämische optische Neuropathie (NAION)11 führen kann , 12. Allerdings gibt es einen Mangel an Studien, die Aufklärung der Proteome Änderungen in diesem arteriellen Bett wegen der oben genannten Nachteile. Daher hat in den letzten Jahren die Haus Schwein (Sus Scrofa Domestica Linnaeus, 1758) ein gutes Tiermodell in Augenheilkunde aufgrund der hohen morphologischen und phylogenetischen Ähnlichkeiten zwischen Menschen und Schweinen13entwickelt, 14,15. Porcines okuläre Proben sind leicht zugänglich und vor allem sind genauere Darstellung der menschlichen Geweben.
In Anbetracht der wichtigen Rolle dieser Blutgefäße im Auge, sowie der Mangel an Methoden für effiziente Proteingewinnung und Analysen von diesen Mikrogefäßen gesorgt haben wir zuvor das Proteom von porcinen sPCA mit einer hauseigenen gekennzeichnet. Protokoll, das die Identifizierung der eine hohe Anzahl von Proteinen16geführt. Basierend auf dieser Studie, haben wir weiter optimiert und ausführlichen beschrieben unsere Methodik in diesem Artikel die Proteomanalyse von winzigen Mengen von Proben mit den Schweinen sPCA als Modell Gewebe ermöglicht. Wenn auch das Hauptziel dieser Studie war es, eine Frau-kompatible Methodik für Masse-limitierte okuläre Blutgefäße, haben wir erhebliche experimentelle Beweise bereitgestellt, dass der beschriebene Workflow auch weitgehend auf verschiedene Gewebe-basierten Proben angewendet werden kann.
Es ist vorgesehen, dass dieser Workflow instrumental für Herstellung von qualitativ hochwertigen MS-kompatible Proben von kleinen Mengen von Materialien für die umfassende Proteom-Analyse werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1040px;" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:436px;">A. Chemicals</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1, 4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">1.11474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium bicarbonate (ABC, CH&#8325;NO&#8323;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5.33005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Calcium chloride dihydrate (CaCl2)&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>5239.1</td>
			<td>2.5 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Formic acid (CH2O2)</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A0748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N)</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A1605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HPLC-grade methanol (CH3OH)</td>
			<td style="width:281px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC-grade water&#160;</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A1589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kalium chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>4.7 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>1.2 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS-grade acetic acid</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AE69.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium sulphate (MgSO4)&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td style="width:120px;">261.2</td>
			<td>1.2 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Antioxidant</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE LDS Sample buffer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>4x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Sample reducing agent&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td style="width:281px;">Promega</td>
			<td style="width:120px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>9265.2</td>
			<td>118.3 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>965.3</td>
			<td>25 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trifluoroacetic acid (TFA,&#160; C2HF3O2)</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">108178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>6780.1</td>
			<td>11 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B. Reagents and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5mm zirconium oxide beads&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.0mm zirconium oxide beads&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">ZROB10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining&#160; Kit</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">LC6025</td>
			<td>To stain 25 mini gels per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">71772-3</td>
			<td>20 reactions per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER)</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">78510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. Tools</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well V-bottom plates</td>
			<td style="width:281px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:120px;">651180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:281px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">CLS3595-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable microtome blades</td>
			<td>pfm Medical</td>
			<td>207500014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scalpels #21</td>
			<td>pfm Medical</td>
			<td>200130021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection pins&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:120px;">PK47.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon conical centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mayo scissors, Tough cut</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision tweezers</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Type 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td style="width:281px;">Carl Roth</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>Type 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-adhesive sealing films for microplates</td>
			<td style="width:281px;">Ratiolab (vWR)</td>
			<td style="width:120px;">RATI6018412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Vannas spring scissors</td>
			<td>&#160;Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas capsulotomy scissors&#160;&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Geuder</td>
			<td style="width:120px;">19760</td>
			<td>&#160;Straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZipTipC18 pipette tips</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D. Equipment and devices</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 &#215; 0.5 mm BioBasic C18 column</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">72105-150565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 &#215; 0.5 mm BioBasic C18 pre-column&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">72105-030515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">UFC500396</td>
			<td>Pack of 96.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>H51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autosampler&#160;</td>
			<td>CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland</td>
			<td style="width:120px;">HTS Pal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BBY24M Bullet Blender Storm&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">NA-BB-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf concentrator, model 5301</td>
			<td style="width:281px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">Z368172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microcentrifuge, model 5424</td>
			<td style="width:281px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">05-403-93</td>
			<td>Non-refrigerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heraeus Primo R Centrifuge</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">75005440</td>
			<td>Refrigerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Labsonic M Ultrasonic homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Sartorius</td>
			<td style="width:120px;">BBI-8535027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS pump, model Rheos Allegro</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">22080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LTQ Orbitrap XL mass spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiskan Ascent plate reader&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Labsystems</td>
			<td style="width:120px;">v2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator with vortex&#160;</td>
			<td style="width:281px;">neoLab</td>
			<td style="width:120px;">7-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Titanium probe (&#216; 0.5mm, 80mm long)</td>
			<td style="width:281px;">Sartorius</td>
			<td style="width:120px;">BBI-8535612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonic bath, type RK 31</td>
			<td style="width:281px;">Bandelin</td>
			<td style="width:120px;">329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xcell Surelock Mini Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>El0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass-spectrometry-based proteomics analysis of ocular microvessels

Die Verwendung von isolierten okulären Blutgefäße in vitro zu entschlüsseln, die pathophysiologischen Zustand des Auges mit fortgeschrittenen technologischen Ansätzen hat unser Verständnis bestimmter Krankheiten erheblich erweitert. Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomics entstanden als ein mächtiges Werkzeug, um Änderungen in den molekularen Mechanismen und Protein Signalwege in der vaskulären Betten in Gesundheit und Krankheit zu entwirren. Probe Vorbereitungsschritte vor MS-Analysen sind jedoch entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse und ausführliche Aufklärung des komplexen Proteome zu erhalten. Dies ist besonders wichtig für die Vorbereitung der okulären Mikrogefäßen, wo die Menge der Probe für Analysen zur Verfügung ist oft begrenzt und somit eine Herausforderung für optimale Proteingewinnung. Dieser Artikel ist bestrebt, eine effiziente, schnelle und robuste Protokoll für die Probenvorbereitung von eine beispielhafte retrobulbären okuläre vaskulären Bett beschäftigt porcinen kurzen hinteren ciliary Arterien anzubieten. Die vorliegende Methode konzentriert sich auf Protein Extraktionsverfahren aus dem überstand und Pellet der Probe nach der Homogenisierung, probieren mit zentrifugalen Filtergeräten vor eindimensionale Gel-Elektrophorese und Peptid-Reinigung Reinigung Schritte für die markierungsfreie Quantifizierung in eine flüssige Chromatographie-Elektrospray-Ionisation-lineare Ionenfalle-Orbitrap-MS-System. Obwohl diese Methode speziell für Proteomics Analysen der okulären Mikrogefäßen entwickelt wurde, haben wir auch überzeugende Beweise bereitgestellt, dass es auch ohne weiteres für andere Gewebe-basierten Proben eingesetzt werden kann.

Begrenzten Stichprobe Verfügbarkeit ist einer der großen Nachteile in Augenheilkunde. Dementsprechend ergeben Extraktionsmethoden für optimale Protein von kleinen Mengen an Proben wie okuläre Blutgefäße oft umstritten sind. Bis heute gibt es ein Mangel an Methoden besonders Proteingewinnung aus retrobulbären Blutgefäßen versorgt. Daher, als ein erster Schritt in der Optimierung der Methode sowie eine Proof-of-Principle zum Vergleich der Wirksamkeit und Robustheit von mehreren all...

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Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Proteome Charakterisierung der okulären mikrovaskuläre Betten ist von zentraler Bedeutung für tiefes Verständnis für viele okulären Erkrankungen beim Menschen. Diese Studie zeigt eine effektive, schnelle und robuste Methode zur Proteingewinnung und Probenvorbereitung aus kleinen Blutgefäßen beschäftigt porcinen kurzen hinteren ciliary Arterien als Modell-Schiffe für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen.

Probenvorbereitung für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analyse der okulären Mikrogefäßen

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Die Herstellung hochwertiger massenspektrometrieskompatibler Proben für eine umfassende Proteomanalyse von Augenproben ist entscheidend, um die molekularen Mechanismen und Signalwege zu klären, die mit Gesundheit und Krankheit zu kämpfen haben. Der beschriebene Arbeitsablauf stellt einen einfachen, aber robusten Ansatz für strenge Probenvorbereitungsschritte dar, die speziell für die Analyse von massenbegrenzten Proben wie okulären Mikroblutgefäßen vorgesehen sind. Obwohl das Hauptziel der Studie darin besteht, eine MS-kompatible Methodik für okuläre Blutgefäße zu etablieren, kann der beschriebene Arbeitsablauf weitgehend auf verschiedene zell- und gewebebasierte Proben angewendet werden.Im Allgemeinen können Personen, die neu mit dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil die Identifizierung und Isolierung der gewählten kurzen hinteren Ziliararterie oder SPCA-Zweige eine Herausforderung darstellen kann. Frische Schweineaugen, zusammen mit Sehnerv und extraokularen Geweben, wurden sofort nach dem Tod aus dem lokalen Schlachthof gewonnen. Legen Sie die Augenkugel in eine Sezierkammer mit eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer.Mit einer scharfen Mayo-Schere vorsichtig umumliegende Muskeln und Gewebe abschneiden. Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell, und schneiden Sie den Globus entlang der äquatorialen Ebene mit einem Paar scharfer Mayo-Schere, bis das Auge in die vordere und hintere Hälfte getrennt ist. Entfernen Sie so viel Glaskörper wie möglich aus der hinteren Hälfte des Auges mit einem Paar Standard-MusterZange.Nach der Verwendung von Sezierstiften, um die hintere Hälfte des Auges vorsichtig festzunageln, schneiden Sie das Bindegewebe, das den Sehnerv umgibt, vorsichtig ab, um die zugrunde liegende retrobulbare Vaskulatur mit einer Student-Vannas-Federschere freizulegen. Isolieren Sie die paraoptische und distale kurze hintere Ziliararterie zusammen mit den umgebenden Bindegeweben mit einer Präzisions-Pinzette vom Typ fünf und einer Vannas-Capsulotomieschere. Entfernen Sie das Verbindungsgewebe vorsichtig aus den arteriellen Segmenten mit einer extra fein gekippten Pinzette und Schere, bevor Sie die isolierten Arterien in eiskaltes PBS spülen, um Verunreinigungen und Blutrückstände zu entfernen.Pool Arterien von zwei Augen, um eine biologische Replikation zu erhalten, dann wiegen Sie die Proben mit einem analytischen Gleichgewicht. Fügen Sie jeder Röhre eine Mischung aus 0,5- und ein Millimeter-Zirkonoxidperlen gefolgt von Gewebeproteinextraktionsreagenz hinzu. Laden Sie nun die Probenröhrchen in einen Mischerhomogenisator.Stellen Sie den Timer auf zwei Minuten ein, stellen Sie den Geschwindigkeitspegel auf sechs ein, und starten Sie die Homogenisierung. Überprüfen Sie nach dem Laufen die Proben auf vollständige Homogenisierung und halten Sie die Proben zwischen den einzelnen Läufen auf Eis. Wiederholen Sie den Zyklus, bis die Proben vollständig homogenisiert sind.Pipette sorgfältig zu frischen Mikrozentrifugenrohren homogenisieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um unlösliche Proteine zu pelleten. Den Überstand, der die löslichen Proteine enthält, sorgfältig pipetten, ohne die Pelletschicht zu berühren, und in frische Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.Fügen Sie 200 Mikroliter Extraktionspuffer 2A und fünf Mikroliter Protease-Hemmer-Cocktail zu jeder Pelletprobe hinzu. Dann das Pellet mehrmals mit einer Pipette aufhängen. Verwenden Sie einen Ultraschallhomogenisator, um das Pellet vollständig zu homogenisieren.Stellen Sie die Amplitude auf 60 ein und fahren Sie auf eins. Verwenden Sie eine Sonde aus Titan, die für die Homogenisierung von Proben mit kleinen Volumina geeignet ist. Tauchen Sie die Sonde in das Pellet- und Extraktionspuffergemisch auf Eis und drücken Sie den Startknopf.Beschallen Sie die Probe, bis die Pelletklumpen vollständig homogenisiert sind, und pausieren Sie für ein paar Sekunden zwischen jeder Beschallung. Prüfen Sie visuell auf vollständige Homogenisierung. Mischen Sie das Homogenat mehrmals mit einer Pipette, um sicherzustellen, dass es keine Klumpen gibt.Verwenden Sie für dieses Verfahren Zentrifugalfiltergeräte mit Drei-Kilodalton-Cutoff. Legen Sie die Drei-Kilodalton-Cutoff-Filtereinheit in ein Mikrozentrifugenrohr ein. Pipette 200 Mikroliter Probe homogenisieren zu einem Filtergerät, und fügen Sie 200 Mikroliter entionisiertes Wasser in den gleichen Filter.Nachdem Sie sie sicher gedeckelt haben, legen Sie die Filtereinheit in eine Zentrifuge und drehen Sie 14.000 Mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Trennen Sie nach der Zentrifugation die Filtereinheit, die das Probenkonzentrat enthält, vom Mikrozentrifugenrohr, das das Filtrat enthält, und entsorgen Sie das Filtrat. Rekonstituieren Sie das Konzentrat, indem Sie 400 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Filtereinheit einfügen.Nachdem Sie die Filtration dreimal wiederholt haben, konpipetten Sie das gereinigte Probenkonzentrat vorsichtig in ein sauberes Mikrorohr. Bereiten Sie die Proben für die eindimensionale Gelelektrophorese vor, wie im Textprotokoll aufgeführt, und mischen Sie sie gut mit einer Pipette. Die Proben bei 70 Grad Celsius in einem trockenen Blockheizer 15 Minuten erhitzen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.Laden Sie vorsichtig 50 Mikrogramm Probe pro Spur mit einer Pipette sowie den vorgefärbten Proteinstandard als Molekularmassenmarker. Führen Sie die Gele ca. 60 Minuten bei einer konstanten Spannung von 175 Volt. Am Ende des Laufs das Gel vorsichtig mit einem Gelmesser von der Kassettenplatte entfernen und in eine Gel-Färbebox geben.Führen Sie die Fixierung und Färbung des Gels wie im Textprotokoll beschrieben durch. Schütteln Sie die Gele in der Färbelösung über Nacht für beste Gesamtergebnisse. Dekantieren Sie die Färbelösung sorgfältig und ersetzen Sie sie durch 200 Milliliter entionisiertes Wasser, bevor sie die Gele mindestens sieben bis acht Stunden im Wasser schütteln, um den Hintergrund zu klären.Die Proteinbänder mit sauberen neuen Mikrotomklingen aus dem Gel ausnehmen. Schneiden Sie das Band in kleine Stücke und übertragen Sie die Gelstücke sorgfältig in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren. Fügen Sie 500 Mikroliter Entsalzungslösung mit 100-Millimolar-Ammonium-Bicarbonat und Acetonitril hinzu.Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 30 Minuten, mit gelegentlichem Schütteln. Die Entkernungslösung sorgfältig herausführen. Überprüfen Sie visuell auf alle Rohre mit Restfleck, und wiederholen Sie diesen Schritt, wenn Gelstücke noch blau gefärbt sind.Etwa 400 Mikroliter frisch zubereitete DTT-Lösung hinzufügen und 30 Minuten bei 56 Grad Celsius brüten. Nach dem Wegwerfen der Reduktionslösung mit einer Pipette ca. 400 Mikroliter frisch zubereitete IAA-Lösung hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln brüten. Entfernen Sie den Alkylierungspuffer mit einer Pipette und entsorgen Sie ihn.500 Mikroliter ordentliches Acetonitril bei Raumtemperatur 10 bis 15 Minuten hinzufügen, bis die Gelstücke schrumpfen und undurchsichtig werden. Das Acetonitril auspfeifen und die Gelstücke fünf bis zehn Minuten unter der Haube lüften. Dann Pipette 50 Mikroliter Trypsin-Lösung in jedes Rohr, um die Gel-Stücke vollständig zu bedecken, und bebrüten die Rohre bei vier Grad Celsius.Nach 30 Minuten ausreichend Trypsinpuffer hinzufügen, um die Gelstücke bei Bedarf vollständig abzudecken. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um die Peptidextraktion durchzuführen, pipettedien Sie vorsichtig die extrahierte Peptidlösung aus den Rohren und übertragen Sie sie in saubere Mikroröhren.Trocknen Sie den Überstand in einem Zentrifugal-Vakuumverdampfer. Fügen Sie 100 Mikroliter Extraktionspuffer in jedes Rohr mit Gelstücken und inkubieren für 30 Minuten mit Schütteln. Den Überstand in die gleichen Mikroröhrchen, die die extrahierten Peptide entsprechend ihren jeweiligen Bändern enthalten, zu zerkleinern und in einer Vakuumzentrifuge auszutrocknen.Fahren Sie mit Peptidreinigung und Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisation MS/MS-Analysen fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier wird die Gesamtmenge der Proteine in Proben dargestellt, die mit jedem Waschmitteltyp extrahiert werden. Der höchste Ertrag stammte aus Geweben, die mit Einem Gewebeproteinextraktionspuffer extrahiert wurden, gefolgt von DDM, CHAPS, ASB-14 und dem niedrigsten Ertrag von ACN und TFA.Konsequenterweise waren die identifizierten Gesamtproteine auch die höchsten in der Gewebeproteinextraktionspuffer extrahiert E-Probe, und folgte dem gleichen Trend wie die Gesamtausbeute. Hier ist der Vergleich der eindimensionierten Gelelektrophorese-Proteinprofile von SPCA vor und nach der optimierten Probenvorbereitung und -reinigung zu sehen. Insgesamt wurde in Bahn drei ein hohes Maß an Verschmierung und schlechte Trennung der Proteinbänder beobachtet.Dieses Profil zeigt, dass die Proben Extraktionsreagenz und auch Verunreinigungen wie Lipide und Zellablagerungen enthalten können. Die SPCA-Proben, die in Überstand und Pellet getrennt und dann dem optimierten Protokoll unterzogen wurden, führten jedoch zu beispielhaften eindimensionalen Gelelektrophoreseprofilen. Die optimierte Methode zur schnellen, robusten und effizienten Proteinextraktion aus augenförmigen Mikrogefäßen kann auch problemlos auf andere gewebebasierte Proben angewendet werden.Gezeigt werden hier Proteinprofile des Überstandes und des Pellets von murinen Hirn- und Herzgewebeproben. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Proben einer vollständigen Homogenisierung zu unterwerfen, den Überstand vom Pellet zu trennen und die Verunreinigungen und die Extraktionsreagenzien zu entfernen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der experimentellen und translationalen Ophthalmologie den Weg, um das Proteom der oskulären Vaskulatur unter Verwendung von Schweineaugen als Modell gründlich zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Biology

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Forschung

Biologie

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Umfassender Workflow der massenspektrometrischen Schrotflintenproteomik von Gewebeproben

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...