Name: sample preparation for mass-spectrometry-based proteomics analysis of ocular microvessels
Uploaded: 2019-02-22T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels at JoVE.com

Dr. Manicam støttes av den interne University forskningsmidler (Stufe 1) fra Universitetet medisinske sentrum av Johannes Gutenberg University Mainz og stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

Alle eksperimentelle prosedyrer dyr utvalg ble utført i streng overholdelse av foreningen for i visjon og Oftalmologi (ARVO) erklæring for bruk av dyr i Ophthalmic og visjon forskning og institusjonelle retningslinjer. Denne studien ble utført og godkjent på Institutt for Oftalmologi, Universitetet medisinske sentrum Mainz.
Merk: Svin øyne synsnerven og extraocular vev anskaffet frisk fra den lokale abattoir umiddelbart evaluering. Enucleated øyne ble transportert til la...

<ol>
	<li>Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honor&#233;, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+proteomics+with+emphasis+on+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry.">Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.</a> Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).</li><li>Gregorich, Z. R., Ge, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+proteomics+in+health+and+disease:+Challenges+and+opportunities.">Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities.</a> Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function.">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537, 347-355 (2016).</li><li>Cehofski, L. J., Mandal, N., Honor&#233;, B., Vorum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+platforms+in+vitreoretinal+proteomics.">Analytical platforms in vitreoretinal proteomics.</a> Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).</li><li>Manicam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Unravels+the+Regulatory+Mechanisms+in+Human+Tears+Following+Acute+Renouncement+of+Contact+Lens+Use:+A+Comparison+between+Hard+and+Soft+Lenses.">Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses.</a> Scientific Reports. 8, 11526 (2018).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+(PRR+4)+in+human+tear+proteome.">Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome.</a> Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+human+tears+from+aqueous-deficient+and+evaporative+dry+eye+patients.">Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients.</a> Scientific Reports. 6, 29629 (2016).</li><li>Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+reflex+tear+proteome+reveals+high+expression+of+lacrimal+proline-rich+protein+4+(PRR4).">Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4).</a> Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).</li><li>Perumal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+aqueous+humour+proteome:+A+comparison+of+the+genders.">Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders.</a> PloS ONE. 12, 0172481 (2017).</li><li>Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+ciliary+artery+circulation+in+health+and+disease+the+Weisenfeld+lecture.">Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45, 749-757 (2004).</li><li>Zeitz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma+progression+is+associated+with+decreased+blood+flow+velocities+in+the+short+posterior+ciliary+artery.">Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery.</a> British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).</li><li>Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+use+of+Sus+scrofa+(pig)+as+a+model+system+for+proteomic+studies.">Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies.</a> Proteomics. 11, 776-793 (2011).</li><li>Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+of+selective+retinal+capillary+closure+induced+by+embolization+with+fluorescent+microspheres.">A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).</li><li>Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+insight+into+the+proteome+landscape+of+the+porcine+short+posterior+ciliary+arteries:+Key+signalling+pathways+maintaining+physiologic+functions.">First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions.</a> Scientific Reports. 6, 38298 (2016).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).</li><li>Feist, P., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+challenges:+sample+preparation+techniques+for+microgram-quantity+protein+analysis+from+biological+samples.">Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).</li><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mouse+liver+plasma+membrane:+use+of+differential+extraction+to+enrich+hydrophobic+membrane+proteins.">Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins.</a> Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+recovery+and+identification+of+membrane+proteins+from+rat+hepatic+cells+using+a+centrifugal+proteomic+reactor.">Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).</li><li>de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+proteomics+to+the+management+of+vascular+disorders.">Contribution of proteomics to the management of vascular disorders.</a> Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).</li><li>Cottingham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1DE+proves+its+worth...+again.">1DE proves its worth... again.</a> Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).</li></ol>

Omfattende proteom profilering av en rekke ulike okulær prøver er et viktig og uunnværlig første skritt å belyse den molekylære mekanismer og signalnettverk trasé innblandet i helse og sykdom. For å oppnå høy kvalitet dataene og sikre reproduserbarhet av resultatene fra disse analysene, foregående eksempel forberedelsene er avgjørende, som fremhevet i en gjennomgang av Mandal et al. som diskuteres grundig eksempel behandling prosedyrer ansette todimensjonal gel gelelektroforese og massespektrometri strategi<s...

Fremme innen Proteomikk, integrert og uovertruffen data samling makt som tillater, revolusjonert sterkt vår forståelse av molekylære mekanismer underliggende visse sykdom forhold så vel som reflekterer den fysiologisk tilstand hos en bestemt celle befolkningen eller vev1,2,3,4. Proteomikk har også vist seg for å være en viktig plattform i ophthalmica forskning følsomhet og objektiv analyse av forskjellige okulær prøver som lettere identifikasjon av potensielle sykdom markører for eventuell diagnose og prognose, som dokumentert elegant av mange studier de siste årene, inkludert noen av oss1,5,6,7,8,9,10. Men er det ofte vanskelig å få menneskelige prøver for proteomic analyser av etiske grunner, spesielt med tanke på behovet for kontroll materiale fra friske individer for pålitelig sammenlignende analyser. På den annen side, er det også vanskelig å skaffe tilstrekkelig mengde prøver for optimal og pålitelig masse spectrometric analyser. Dette er spesielt viktig for masse-begrenset biologiske materialer som mikro-blodkar i øyet. En slik stor retrobulbar blod fartøy som spiller viktige roller i regulering av okulære blodstrøm er kort bakre ciliary arterien (sPCA). Forstyrrelsene eventuelle uregelmessigheter i denne vaskulær seng kan resultere i alvorlig klinisk konsekvenser, som kan føre til patogenesen av flere sight-truende sykdommer som grønn stær og nonarteritic fremre iskemiske fiberoptisk nevropati (NAION)11 , 12. men det er en mangel på studier Klargjørende proteom endringene i denne arteriell sengen på grunn av ovennevnte ulempene. Derfor de siste årene, hus svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) har dukket opp som en god dyremodell ophthalmica forskning på grunn av høy morfologiske og Fylogenetiske likhetene mellom mennesker og griser13, 14,15. Svin okulær prøvene er lett tilgjengelig og viktigst er mer nøyaktig gjengivelse av menneskelig vev.
Vurderer den viktige rollen blodkar i øyet, samt mangel på metodikk hensyn til effektiv protein utvinning og analyser fra disse microvessels, har vi tidligere preget proteom av svin sPCA med en protokoll som resulterte i identifikasjon av mange proteiner16. Basert på denne studien, har vi ytterligere optimalisert og beskrev grundig vår metode i denne artikkelen, som lar proteom analyse fra minutt mengder prøver ved svin sPCA som modell vev. Selv om Hovedformålet med denne studien var å etablere en MS-kompatibel metode for masse-begrenset okulær blodårene, har vi gitt betydelige eksperimentelle bevis at beskrevet arbeidsflyten kan også være bredt brukt til forskjellige vev-basert prøver.
Det er tenkt at denne arbeidsflyten vil være instrumentell for utarbeidelse av høy kvalitet MS-kompatible prøver fra små mengder materialer for omfattende proteomanalyser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1040px;" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:436px;">A. Chemicals</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1, 4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">1.11474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium bicarbonate (ABC, CH&#8325;NO&#8323;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5.33005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Calcium chloride dihydrate (CaCl2)&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>5239.1</td>
			<td>2.5 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Formic acid (CH2O2)</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A0748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N)</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A1605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HPLC-grade methanol (CH3OH)</td>
			<td style="width:281px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPLC-grade water&#160;</td>
			<td style="width:281px;">AppliChem</td>
			<td style="width:120px;">A1589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kalium chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>6781.1</td>
			<td>4.7 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>3904.2</td>
			<td>1.2 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS-grade acetic acid</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td style="width:120px;">AE69.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Magnesium sulphate (MgSO4)&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td style="width:120px;">261.2</td>
			<td>1.2 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Antioxidant</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE LDS Sample buffer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>4x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Sample reducing agent&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sequencing grade modified trypsin</td>
			<td style="width:281px;">Promega</td>
			<td style="width:120px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>9265.2</td>
			<td>118.3 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>965.3</td>
			<td>25 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Trifluoroacetic acid (TFA,&#160; C2HF3O2)</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">108178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>&#160;Carl Roth&#160;</td>
			<td>6780.1</td>
			<td>11 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B. Reagents and Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5mm zirconium oxide beads&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">ZROB05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.0mm zirconium oxide beads&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">ZROB10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining&#160; Kit</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td style="width:120px;">LC6025</td>
			<td>To stain 25 mini gels per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>1.0 mm, 10-well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">71772-3</td>
			<td>20 reactions per kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER)</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">78510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. Tools</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well V-bottom plates</td>
			<td style="width:281px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:120px;">651180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:281px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">CLS3595-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable microtome blades</td>
			<td>pfm Medical</td>
			<td>207500014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable scalpels #21</td>
			<td>pfm Medical</td>
			<td>200130021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection pins&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:120px;">PK47.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon conical centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mayo scissors, Tough cut</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision tweezers</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Type 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td style="width:281px;">Carl Roth</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>Type 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-adhesive sealing films for microplates</td>
			<td style="width:281px;">Ratiolab (vWR)</td>
			<td style="width:120px;">RATI6018412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:281px;">&#160;Fine Science Tools</td>
			<td style="width:120px;">11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Vannas spring scissors</td>
			<td>&#160;Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas capsulotomy scissors&#160;&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Geuder</td>
			<td style="width:120px;">19760</td>
			<td>&#160;Straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZipTipC18 pipette tips</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td>ZTC18S096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D. Equipment and devices</td>
			<td style="width:281px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 &#215; 0.5 mm BioBasic C18 column</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">72105-150565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 &#215; 0.5 mm BioBasic C18 pre-column&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">72105-030515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:120px;">UFC500396</td>
			<td>Pack of 96.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>H51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autosampler&#160;</td>
			<td>CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland</td>
			<td style="width:120px;">HTS Pal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BBY24M Bullet Blender Storm&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Next Advance</td>
			<td style="width:120px;">NA-BB-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf concentrator, model 5301</td>
			<td style="width:281px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">Z368172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf microcentrifuge, model 5424</td>
			<td style="width:281px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:120px;">05-403-93</td>
			<td>Non-refrigerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heraeus Primo R Centrifuge</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">75005440</td>
			<td>Refrigerated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Labsonic M Ultrasonic homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Sartorius</td>
			<td style="width:120px;">BBI-8535027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS pump, model Rheos Allegro</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Scientific, Rockford, USA</td>
			<td style="width:120px;">22080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LTQ Orbitrap XL mass spectrometer&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiskan Ascent plate reader&#160;</td>
			<td style="width:281px;">Thermo Labsystems</td>
			<td style="width:120px;">v2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotator with vortex&#160;</td>
			<td style="width:281px;">neoLab</td>
			<td style="width:120px;">7-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Titanium probe (&#216; 0.5mm, 80mm long)</td>
			<td style="width:281px;">Sartorius</td>
			<td style="width:120px;">BBI-8535612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonic bath, type RK 31</td>
			<td style="width:281px;">Bandelin</td>
			<td style="width:120px;">329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xcell Surelock Mini Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>El0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass-spectrometry-based proteomics analysis of ocular microvessels

Bruk av isolerte okulær blodkar i vitro å dechiffrere patofysiologiske delstaten øyet ved hjelp av avanserte teknologiske tilnærminger er betydelig utvidet vår forståelse av visse sykdommer. Massespektrometri (MS)-basert Proteomikk har dukket opp som et kraftig verktøy for å løse endringer i molekylære mekanismer og signalnettverk trasé i vaskulær senger i helse og sykdom protein. Eksempel forberedelsene før MS analyser er imidlertid avgjørende reproduserbar resultater og grundig forklaring av den komplekse proteom. Dette er spesielt viktig for utarbeidelse av okulære microvessels, der eksemplar tilgjengelig for analyser er ofte begrenset og dermed utgjør en utfordring for optimal protein utvinning. Denne artikkelen forsøker å gi en effektiv, rask og robust protokoll for eksempel forberedelse fra en eksemplarisk retrobulbar okulær vaskulær seng ansette svin kort bakre ciliary arteriene. De nåværende metoden fokuserer på protein utvinning prosedyrer fra både nedbryting og pellet på utvalget etter homogenisering prøve rengjøring med sentrifugal filter enheter før endimensjonal gel gelelektroforese og peptid rensing trinn for etikett-fri kvantifisering i en væske kromatografi-electrospray ionization-lineær ion felle-Orbitrap MS system. Selv om denne metoden har blitt utviklet spesifikt for Proteomikk analyser av okulære microvessels, har vi også gitt overbevisende bevis at det kan også lett brukes for andre vev-basert prøver.

Begrenset utvalg tilgjengelighet er en av de største ulempene ophthalmica forskning. Tilsvarende utvinning metoder for optimal protein avkastning fra små mengder av prøver som okulær blodkar er ofte diskuteres. Dato er det en paucity metoder rettet spesielt for protein utvinning fra retrobulbar blodkar. Derfor, som et første skritt i metoden optimalisering og som et bevis-av-prinsipp å sammenligne effekten og robusthet av flere ofte ansatt protein utvinning vaskemidler til en relati...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels at JoVE.com

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

Proteom karakteristikk av okulære mikrovaskulær senger er avgjørende for grundig forståelse av mange okulær patologi hos mennesker. Denne studien viser en effektiv, rask og robust metode for protein utvinning og prøve forberedelse fra små blodkar ansette svin kort bakre ciliary arteriene som modell fartøy for masse-massespektrometri-baserte Proteomikk analyser.

Eksempel forberedelse til masse-massespektrometri-baserte Proteomikk analyse av okulære Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Utarbeidelsen av massespektrometrikompatible prøver av høy kvalitet for omfattende proteomanalyse av okulære prøver er avgjørende for å belyse molekylære mekanismer og signalveier innblandet i helse og sykdom. Den beskrevne arbeidsflyten representerer en enkel, men robust tilnærming til strenge prøveforberedelsestrinn som er tatt spesielt hensyn til analyse av massebegrensede prøver som okulære mikroblodkar. Selv om hovedmålet med studien er å etablere en MS-kompatibel metodikk for okulære blodkar, kan den beskrevne arbeidsflyten brukes bredt på ulike celle- og vevsbaserte prøver.Generelt kan personer som er nye på denne metoden slite fordi identifisering og isolering av den valgte korte bakre ciliary arterien, eller SPCA grener, kan være utfordrende. Friske svineøyne, sammen med optisk nerve og ekstraokulært vev, ble hentet fra det lokale slakteriet umiddelbart etter mortem. Plasser øyekloden i et disseksjonskammer som inneholder iskald Krebs-Henseleit buffer.Skjær forsiktig bort om muskler og vev med et par skarpe Mayo saks. Lag et snitt med en skalpell, og kutt kloden langs ekvatorplanet med et par skarpe Mayo saks til øyet er delt inn i fremre og bakre halvdeler. Fjern så mye glasslegemet kropp som mulig fra den bakre halvdelen av øyet ved hjelp av et par standard mønster tang.Etter å ha brukt disseksjonspinnene til å forsiktig feste ned den bakre halvdelen av øyet, kutt forsiktig bort bindevevet rundt optisk nerve, for å avsløre den underliggende retrobulbarvaskulaturen med et par student Vannas vårsaks. Isoler paraoptisk og distal kort bakre ciliary arterie sammen med de omkringliggende bindevev med et par type fem presisjon pinsett og Vannas capsulotomy saks. Fjern forsiktig bindevev fra arterielle segmenter ved hjelp av ekstra fine tippede pinsett og saks før du skyller de isolerte arteriene i iskald PBS for å fjerne forurensninger og blodrester.Pool arterier fra to øyne for å få en biologisk replikere, deretter veie prøvene ved hjelp av en analytisk balanse. Til hvert rør, tilsett en blanding av 0,5 og en millimeter zirkoniumoksidperler etterfulgt av vevproteinekstraksjonsreagens. Last nå prøverørene inn i en blender homogenisator.Sett timeren på to minutter, still inn hastighetsnivået til seks, og start homogenisering. Etter løping, sjekk prøvene for fullstendig homogenisering og hold prøver på is mellom hvert løp. Gjenta syklusen til prøvene er helt homogenisert.Rør homogenat forsiktig i friske mikrocentrifuge rør. Sentrifuger prøvene ved 10 000 ganger G i 20 minutter ved fire grader Celsius for å pellet uoppløselige proteiner. Pipette overnatanten som inneholder de løselige proteinene forsiktig uten å berøre pelletlaget, og overfør til friske mikrocentrifugerør.Tilsett 200 mikroliter ekstraksjonsbuffer 2A og fem mikroliter proteasehemmercocktail til hver pelletprøve. Deretter suspenderer du pelleten flere ganger med en pipette. Bruk en ultralyd homogenisator for å fullstendig homogenisere pellet.Sett amplituden til 60 og bla til en. Bruk en sonde laget av titan, som er egnet for homogenisering av prøver med små volumer. Senk sonden ned i pellet- og ekstraksjonsbufferblandingen på is, og trykk på startknappen.Sonicate prøven til pellet klumper er helt homogenisert, pause i noen sekunder mellom hver sonikering. Se etter fullstendig homogenisering visuelt. Bland homogenatet flere ganger med en pipette for å sikre at det ikke er klumper.Bruk sentrifugalfilterenheter med tre kilodalton avskjæring for denne prosedyren. Sett tre kilodalton cutoff filterenheten inn i et mikrocentrifugerør. Pipette 200 mikroliter prøvehomogenat til en filterenhet, og tilsett 200 mikroliter av deionisert vann i samme filter.Etter å ha kappet den sikkert, plasser filterenheten i en sentrifuge, og spinn i 14 000 ganger G i 15 minutter ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering skiller du filterenheten som inneholder prøvekonsentratet fra mikrocentrifugerøret som inneholder filtratet, og kaster filtratet. Rekonstituer konsentratet ved å tilsette 400 mikroliter av deionisert vann i filterenheten.Etter gjentatt filtrering tre ganger, pipetter forsiktig den rengjorte prøven konsentrere seg i et rent mikrorør. Forbered prøvene på endimensjonal gelelektroforese som oppført i tekstprotokollen, og bland godt med en pipette. Varm prøvene ved 70 grader Celsius i en tørr blokkvarmer i 15 minutter, og avkjøl til romtemperatur.Last forsiktig 50 mikrogram prøve per kjørefelt ved hjelp av en pipette, samt den forløpende proteinstandarden som en molekylær massemarkør. Kjør gelene i ca 60 minutter med en konstant spenning på 175 volt. På slutten av løpet fjerner du forsiktig gelen fra kassettplaten ved hjelp av en gelkniv, og overfører gelen til en gelfargingsboks.Utfør feste og farging av gelen som beskrevet i tekstprotokollen. Rist gelene i fargeløsningen over natten for best generelle resultater. Dekanter fargeløsningen forsiktig og erstatt med 200 ml deionisert vann før du rister gelene i minst syv til åtte timer i vann for å tømme bakgrunnen.Avgift proteinbåndene fra gelen med rene nye mikrotomblader. Skjær båndet i små biter, og overfør forsiktig gelbitene i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Tilsett 500 mikroliter av destaining løsning som inneholder 100-millimolar ammonium bikarbonat og acetonitril.Inkuber prøvene ved romtemperatur i 30 minutter, med sporadisk risting. Pipette forsiktig ut destaining løsningen. Kontroller visuelt for alle rør med gjenværende flekk, og gjenta dette trinnet hvis gelbitene fortsatt er farget blå.Tilsett ca. 400 mikroliter nylaget DTT-oppløsning, og inkuber ved 56 grader Celsius i 30 minutter. Etter å ha kastet reduksjonsløsningen med en pipette, tilsett ca. 400 mikroliter nylaget IAA-løsning, og inkuber i mørket ved romtemperatur i 30 minutter. Fjern alkylerende buffer med en pipette og kast.Tilsett 500 mikroliter med pent acetonitril ved romtemperatur i 10 til 15 minutter, til gelbitene krymper og blir ugjennomsiktige. Pipette ut acetonitril, og lufttørke gelbitene i fem til 10 minutter under panseret. Deretter pipette 50 mikroliter trypsin løsning i hvert rør for å fullstendig dekke gel stykker, og inkubere rørene på fire grader Celsius.Etter 30 minutter legger du til tilstrekkelig volum trypsinbuffer for å dekke gelbitene fullstendig om nødvendig. Inkuber prøvene over natten ved 37 grader Celsius. For å utføre peptidekstraksjon, pipette forsiktig den ekstraherte peptidløsningen fra rørene og overfør til rene mikrorør.Tørk overnatanten i en sentrifugalvakuumfordamper. Tilsett 100 mikroliter ekstraksjonsbuffer til hvert rør med gelbiter, og inkuber i 30 minutter med risting. Pipette supernatanten i de samme mikrorørene som inneholder de ekstraherte peptidene i henhold til deres respektive bånd, og tørk ned i en vakuumsentridug.Fortsett til peptidrensing og flytende kromatografi-elektrosprayionisering MS/MS-analyser som beskrevet i tekstprotokollen. Den totale mengden proteiner i prøver ekstrahert med hver type vaskemiddel er avbildet her. Det høyeste utbyttet kom fra vev ekstrahert med vevproteinekstraksjonsbuffer, etterfulgt av DDM, CHAPS, ASB-14 og det laveste utbyttet fra ACN og TFA.Konsekvent var de totale proteinene som ble identifisert, også de høyeste i vevsproteinekstraksjonsbufferen ekstrahert prøven, og fulgte samme trend som det totale utbyttet. Vist her er sammenligningen av endimensjon gel elektroforese protein profiler av SPCA, før og etter å ha blitt utsatt for optimalisert prøve forberedelse og rengjøring trinn. Samlet sett ble en høy grad av smøring og dårlig separasjon av proteinbåndene observert på kjørefelt tre.Denne profilen viser at prøvene kan inneholde ekstraksjonsreagens, og også forurensninger som lipider og cellulært avfall. Imidlertid resulterte SPCA-prøvene som ble delt inn i supernatant og pellet, og deretter utsatt for den optimaliserte protokollen, i eksemplariske endimensjonale gelelektroforeseprofiler. Den optimaliserte metoden for rask, robust og effektiv proteinekstraksjon fra okulære mikrovesker kan også lett brukes på andre vevsbaserte prøver.Vist her er proteinprofiler av supernatant og pellet av murine hjerne og hjertevevsprøver. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å utsette prøvene for å fullføre homogenisering, for å skille supernatanten fra pelleten, og for å fjerne forurensningene og ekstraksjonsreagensene. Etter utviklingen banet denne teknikken veien for forskere innen eksperimentell og translasjonell oftalmologi for å grundig utforske proteomet av oscular vaskulatur ved hjelp av svineøyne som modell.

Research

JoVE Journal

Biology

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolsk Merking og Membran Fraksjone for komparativ proteomikk analyser av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension cellekulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomikk Prøvepreparering fra formalinfiksert og parafin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av Ekstracellulære Matrix Proteiner fra Vev og Fordøyelse inn Peptider for massespektrometrianalyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Prøvepreparering for Mass Cytometry Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

En alternativ tilnærming for prøveopparbeidelse med lav celle nummer for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Eksempel forberedelse og bildebehandling for Exosomes av overføring elektronmikroskop

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniatyriserte eksempel forberedelse til overføring elektronmikroskop

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Comprehensive Workflow of Mass Spectrometry-based Shotgun Proteomics of Tissue Samples

Omfattende arbeidsflyt av massespektrometribasert hagleproteomikk av vevsprøver

Recent advances in mass spectrometry have resulted in deep proteomic&#160;analysis along with the generation of&#160;robust and&#160;reproducible ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Prøvepreparering for metabolsk profilering ved bruk av MALDI-massespektrometriavbildning

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...