Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Forfatterne takke Dr. Richard Nowakowski og Florida State University laboratorium dyr ressourcer for at levere og pasning af de dyr, der anvendes til at udvikle denne protokol, respektfuldt. Vi takker Xia Liu, Dr. Rakesh Singh og de Florida State University translationel videnskab laboratorium for bistand med massespektrometri arbejde anvendes til downstream vesikel karakterisering, samt FSU biologisk videnskab Imaging Resource facilitet for brugen af transmissions-elektronmikroskop i denne undersøgelse. Endelig vil takke vi Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) for donation af tumor prøver, der anvendes i udviklingen af denne metode. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Alzheimer's Disease Research Program tildelt til D.G.M. og J.M.O (6AZ11) og National Cancer Institute af National Institutes of Health under Award nummer R01CA204621 tildeles D.G.M.

Hele hjerner blev indhentet med samtykke fra institutionelle dyr brug og pleje udvalg (IACUC) af Florida State University. Tolv mus hjerner i alt (3 hjerner fra hver aldersgruppe: 2, 4, 6 og 8 måneder) fra en C57BL/6 J baggrund blev brugt til EV udvinding, som tidligere beskrevet16. Lunge tumor prøver var generøst doneret af Dr. Mandip Sachdeva under godkendelse af Florida landbrugs og mekaniske Universitet IACUC. Lunge tumorer blev afledt fra menneskelige adenocarcinom cellelinie H1975 dyrkes ...

<ol>
	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Meget videnskabelig interesse er blevet genereret med hensyn til de roller, små evt spille i tumor mikromiljø og i orgel udvikling, modning og funktion. Samlet set giver denne undersøgelse en optimeret arbejdsgang for udvinding af intakt evt fra hele hjernen eller tumor prøver. Mens her vi blot demonstrere anvendeligheden af denne teknik til lunge tumor-afledte evt, kunne denne metode nemt være tilpasset til arbejde på andre solid væv, giver muligheder for yderligere ex vivo karakterisering af små udskilles blær...

Lille ekstracellulære vesikler (EVs) omfatter endosomal-afledte exosomes og lille membran-stald microvesicles, der er af bred biomedicinsk interesse. Lille evt består af en heterogen population af 50-250 nm membran-bundet vesikler indeholdende biologisk aktive proteiner, lipider og nukleinsyrer, der kollektivt menes at spille en vigtig rolle i et væld af sygdomsprocesser. Fremme forskning har særligt impliceret disse vesikler i neurodegenerative og prion sygdomme, smitsomme processer, autoimmune eller inflammatoriske betingelser, og tumorvækst og metastase1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. hastigt voksende biomedicinsk forskning i betydningen af evt i sygdom patogenese har genereret parallelle interesse i at udvikle reproducerbare og strenge metoder til isolering og oprensning af disse vesikler.
En historiske og aktuelle udfordring i EV karakterisering har været den manglende evne til fuldt adskille små EV delpopulationer. Denne udfordring er hovedsagelig på grund af vores begrænsede forståelse af de forskellige molekylære mekanismer for Biogenese af særskilte vesikler. Overlappende størrelse, tæthed og biologiske gods mellem delpopulationer yderligere convolutes disse sondringer. En del af denne udfordring har også været brugen af almindeligt afvigende berigelse teknikker, giver inkonsistens i downstream analyse af isolerede vesikler på tværs af laboratorier og undergrave den globale indsats for at belyse kategorisk EV populationer.
Det er værd at bemærke, at størstedelen af EV karakterisering er blevet udført fra in vitro-samling af cellekultur supernatanten, med nyere in vivo-undersøgelser beskriver teknikker til at isolere vesikler fra dyr eller humane legemsvæsker, herunder plasma, urin , og spyt. Mens evt er til stede i store mængder i omløb, anerkendes det også at disse vesikler spiller en vigtig rolle i celle-til-celle kommunikation begivenheder og er til stede i interstitium af cellulære væv. I forbindelse med kræft, kan interstitiel evt være særlig vigtig i modulerende tumor mikromiljø for kræftcelle såning og metastatisk vækst14,15. Derfor er der værdi i udvikling og optimering af teknikker til at udvinde vesikler fra solid væv prøver. Disse metoder vil være et middel til direkte studerer orgel - eller tumor - afledt evt høstet fra klinisk prøvemateriale, herunder små biopsier og delvis eller fuldstændig orgel resektion.
I denne undersøgelse, og i en tidligere rapport udgivet af vores laboratorium16, vi sigter mod at løse flere store aktuelle bekymringer i EV berigelse metode: 1) til at beskrive en reproducerbar teknik for at isolere og rense evt til de højeste standarder i øjeblikket accepteret i feltet. 2) at forsøge at isolere lille EV delpopulationer stærkt beriget i endosomal-afledte exosomes; og 3) til at give en protokol til udvinding af disse vesikler fra solid væv prøver med henblik på yderligere karakterisering.
Kowal og kolleger beskrev for nylig, en forholdsvis små iodixanol tæthed farveforløb for at adskille og rense EV delpopulationer med større effekt end sammenlignelige saccharose tæthed gradienter17. I den citerede undersøgelse, var dendritiske celle-afledte evt fanget i en relativt let tæthed brøkdel, i overensstemmelse med en massefylde på 1,1 g/mL, stærkt beriget i endosomal proteiner menes at være mest konsistente med en høj andel af exosomes i dette brøk. Ifølge forfatterne omfattede disse "bona fide" exosomal proteiner tumor modtagelighed gen 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 og flere annexin proteiner17. Vi er senere tilpasset denne teknik for at lykkes en metode af væv dissociation beskrevet af Perez-Gonzalez mfl18 og en efterfølgende differential centrifugering protokol at isolere hele hjernen-afledte evt-16. Vi viste også nytte af denne metode i kendetegner EV proteomes ved at kombinere en sekventiel protokol for downstream kvantitative og sammenlignende massespektrometri af vesikulære protein, tidligere beskrevet af vores laboratorium19. Dette arbejde sideløbende at fra Hill laboratorium, hvor evt blev beriget fra den frontale cortex af hjerner20.
I denne undersøgelse, vi uddybe denne teknik og udvide anvendelsen af protokollen for nylig offentliggjort fra vores laboratorium til dyrkning af evt fra solid lunge tumorer. Til vores viden er dette den første undersøgelse til at beskrive en protokol for at berige evt fra ex vivo tumor prøver. Givet den udbredte interesse i evt som roman diagnostiske biomarkører og deres rolle i tumordannelse, denne metode vil sandsynligvis vise sig værdifulde til et stigende antal forskere. Fra et klinisk perspektiv, kunne interstitiel evt havnen stor diagnostisk værdi, især i enheder hvor histologisk vurdering er begrænset. Vores håb er, at metoden beskrevet her vil give et fundament for en reproducerbar teknik til høst evt fra frisk eller frossen dyrs eller menneskers kirurgiske enheder, baner vejen for fremtidige arbejde til at afdække de betydelige roller i sygdom patogenese disse små blærer kan spille.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Cirkulerende og interstitiel lille membran-bundet ekstracellulære vesikler (evt) udgør lovende mål for udviklingen af nye diagnostiske eller prognostiske biomarkør assays, og sandsynligvis fungere som vigtige aktører i udviklingen af et stort spektrum af sygdomme. Aktuelle forskning er fokuseret på karakterisering af vesikler udskilles fra flere celle og vævstyper for bedre at kunne forstå evt rolle i patogenesen af betingelser herunder neurodegeneration, betændelse og cancer. Globalt konsekvent og reproducerbar teknikker til at isolere og rense vesikler er dog stadig i gang. Derudover beskrives metoder til udvinding af evt fra solid væv ex vivo næppe. Her give vi en detaljeret protokol til at udtrække lille evt interesse fra hele frisk eller frossen væv, herunder hjerne og tumor prøver, for yderligere karakterisering. Vi demonstrere tilpasningsevne af denne metode for flere downstream analyser, herunder Elektron Mikroskopi og immunophenotypic karakterisering af vesikler og kvantitativ massespektrometri af proteiner, EV.

En skematisk oversigt over væv dissociation, differential centrifugering og gradient rensning af vesikler vises i figur 1. Den morfologiske og immunophenotypic bekræftelse af gradient-renset evt er fremhævet i figur 2. Et diagram over reproducerbare tætheder efter ultracentrifugering af 10-30% iodixanol gradient er vist, med to særskilte vesikel befolkningen migrerer opad til fraktion 2 (light EVs) og brøkdel 5 (tætte EVs)...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Udvinding af ekstracellulære vesikler fra hele væv

Her give vi en detaljeret protokol for at isolere lille ekstracellulære vesikler (EVs) fra hele væv, herunder hjerne og tumor prøver. Denne metode giver en reproducerbar teknik for at udtrække evt fra solid væv for videre downstream analyse.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Denne protokol giver en streng og reproducerbar teknik til ekstraktion og isolering af små ekstracellulære vesikler fra hele vævsprøver til downstream ex vivo-analyser. Med blandt de højeste niveauer af renhed i øjeblikket opnåelige, denne metode letter den direkte morfologiske, immunophenotypic, og dyb karakterisering af interstitielle vesikler udskilles i forskellige vævsprøver, herunder tumorer. Her demonstrerer vi isolering af vævs-el fra hjerne- og lungetumorprøver.Men, denne teknik kan anvendes til undersøgelser ved hjælp af forskellige, godartede, eller andre tumor prøver samt. Til at begynde, forberede 10 milliliter dissociation buffer i Dvale-E medium for hver 0,4 til 1,0 gram væv. Tilsæt hele frisk eller frosset væv til bufferen i en 50 milliliter rør, og inkuberes i et varmt vandbad ved 37 grader celsius i 20 minutter.Derefter tilsættes protease- og fosfatasehæmmere til en endelig 1x koncentration i dissociationsbufferen. Hæld opløsningen med vævet i en løs pasform downs homogenisator. Brug ca. 30 langsomme strøg pr. prøve til forsigtigt at adskille vævet.Derefter overføres den dissocierede vævs- og bufferopløsning til et konisk rør på 50 milliliter. Centrifuge ved 500x g og ved fire grader celsius i fem minutter for at pellet cellerne og de resterende fibre eller sammenhængende vævsfragmenter. Overfør supernatanten til et rent 50 milliliter konisk rør, og centrifuge ved 2, 000x g og ved fire grader celsius i 10 minutter for at pelletere og kassere de store cellulære snavs.Overfør denne supernatant til en ren 50 milliliter konisk rør, og centrifuge ved 10, 000x g og ved fire grader celsius i 40 minutter til pellet eventuelle uønskede større vesicles eller små apoptotiske organer. Supernatanten dekanteres gennem et 0,45 mikrometerfilter i et rent 12 milliliter ultracentrifugeringsrør. Dernæst ultracentrifuge prøven ved 100, 000x g og ved fire grader celsius i to timer, at pellet små elbiler.Dekanter supernatanten og lad de ultracentrifugeringsrør vendes om i fem til 10 minutter, og der trykkes ofte for at fjerne eventuel resterende væske på siderne af rørene. Derefter resuspend ev pellet i 1,5 milliliter 0,25 molar saccharose buffer. Dæk rørene med Parafilm, og vortex elverne til løsning.Rock ultracentrifugerørene i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur. Og så vortex igen. Rørene centrifugeres kortvarigt med en hastighed på under 1.000 x g for at genvinde væskeaffjedringen i bunden af røret.Hvis det er nødvendigt, opbevares suspensionen ved fire grader celsius natten over. Først tilsættes 1,5 milliliter 60% iodixanol til de 1,5 milliliter af saccharose tris buffer, der indeholder eldrevne køretøjer til at skabe en endelig opløsning, der indeholder 30% iodixanol. Pipette op og ned flere gange for at blande opløsningen grundigt.Denne opløsning overføres til bunden af et 5,5 milliliter ultracentrifugeringsrør. Dernæst blandes 60% iodixanol bestand med ultra rent vand til at forberede mindst 1,5 milliliter af både en 20% og en 10% iodixanol opløsning. Ved hjælp af en sprøjte og en 18 gauge nål, måle 1,3 milliliter af 20% iodixanol opløsning og omhyggeligt lag det på toppen af bunden gradient.Hold kanylens facet i kontakt med indersiden af røret lige over menisken og tilsæt opløsningen dråbe klogt for at undgå at blande lagene på tætheden interface. Derefter lag 1,2 milliliter af 10% iodixanol opløsning på toppen af 20%-laget, ved hjælp af samme teknik. Balanceret forsigtigt og indlæs ultracentrifugeringsrørene i rotorspande.Indstil accelerations- og decelerationshastighederne for en svingspandrotor til minimumshastighederne, og centrifugering ved 268, 000x g og ved fire grader celsius i 50 minutter. Mens prøven centrifugeres, mærkes 10 1,5 milliliter mikrocentrifugerør for hver prøve, der svarer til fraktioner 1 til 10 af massegradienten. Når centrifugering er færdig, skal du forsigtigt fjerne rørene fra rotorspandene og placere dem i en stabil holder.Pipette 10 serielle fraktioner af 490 mikroliter fra toppen af gradienten til de tilsvarende rør. Ved hjælp af et refraktometer måles brydningsindeksene for fraktionerne. Derefter overføres hver fraktion til et rent 12 milliliter ultracentrifugeringsrør.Tilsæt fem milliliter 1x PBS til hvert rør og pipette op og ned langsomt for at blande. Tilsæt yderligere seks milliliter 1x PBS til toppen af røret, og bland forsigtigt igen. Ultracentrifuge rørene ved 100, 000x g og ved fire grader celsius for at re-pellet de små vesicles.Supernatanten dekanteres, og rørene tørres, før vesiklerne lyser for proteinanalyse eller reresuspending af eldrevne køretøjer til morfologisk analyse. For at lyse eldrevne køretøjer til proteinanalyse tilsættes 40 mikroliter stærk lysisbuffer indeholdende proteasehæmmer til EV-pellets. Placer Parafilm over hvert rør, og vortex kraftigt.Dernæst rock rørene i 20 minutter ved stuetemperatur og vortex igen. Prøven centrifugeres kort ved 1,000x g i 30 til 60 sekunder for at genvinde hele prøvevolumenet. Hver prøve overføres til et nyt mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter, og den opbevares ved en temperatur på mellem 20 og 80 grader celsius, indtil det er klar til videre behandling.For at forberede de rensede lysater til immunoblotanalyse tilsættes 5x Laemmli prøvebuffer til prøverne for en endelig koncentration på 1x. Prøven koges ved 95 grader celsius i fem til 10 minutter. Indlæs derefter en tilsvarende mængde brøker en til 10 i en 10% SDS-sidegel.Belastning en lige masse af væv homogenat. Udfør elektroforese og western blot analyse for at bekræfte EV proteiner i de rensede lysater og sammenligne relative EV overflod i fraktioner. I denne undersøgelse udvindes og renses ekstracellulære vesikler fra hele vævet.Efter ultracentrifugering af 10 til 30% iodixanol gradient, en population af lette elbiler kan ses migrere op til fraktion to, mens en population af tætte elbiler kan ses migrere op til fraktion fem, afhængigt af vævstype. Repræsentative immunoblots af gradient fraktioner udviser effektiv adskillelse og rensning af små tumor afledte elbiler i fraktion fem. Især, lunge tumor prøver synes beriget i tætte elbiler i forhold til lette elbiler, der tidligere blev høstet fra hele hjernen væv.Repræsentativ nanopartikelsporingsanalyse og elektronmikroskopi af vævsafledte vesikler i den fremherskende vesikel, der indeholder fraktion, viser tilsætning og konservering af hele vesikler. I overensstemmelse med små elbilers kendte størrelse og struktur. Interstitielle elbiler repræsenterer lovende mål for udviklingen af nye diagnostiske eller prognostiske biomarkøranalyser.Denne teknik giver forskerne værktøjer til ekstraktion og rensning af vesikler til downstream nytte. Efter ekstraktion af hele eller lysede vævs-eVs kan der udføres en bred karakterisering af vesikler, herunder proteomiske, genomiske og lipidomic analyser. Derudover kan prøver anvendes til mere målrettede tilgange.Vesicles isoleret direkte fra vævsprøver kan give yderligere indsigt i sygdomsmekanismer, herunder tumorgener, og kan give vigtige diagnostiske eller prognostiske værktøjer i fremtiden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrofile ekstracellulære fælder genereret af Low Density neutrofiler fremstillet af Peritoneal Lavage væske mægle tumorcellevækst og vedhæftet fil

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studere normale vævs stråling effekter ved hjælp af ekstracellulære matrix Hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Ekstraktion af vandige metabolitter fra kultiverede Vedklædende celler til Metabolomic analyse af kapillar elektroforese-massespektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering af exosome-beriget ekstracellulære vesikler Transporterer Granulocyte-Makrofag Colony-stimulerende faktor fra embryonale stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funktionel vurdering af stamceller fra brystkræft fra celle- og vævsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Immunogenicitetsscreening af tumorafledte ekstracellulære vesikler ved flowcytometri af milt-T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generering og billeddannelse af muse- og humane epitelorganoider fra normalt væv og tumorbrystvæv uden passage

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

En berigelsesmetode til små ekstracellulære vesikler afledt af leverkræftvæv

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Etablering af tumororganoider og fibroblaster afledt af kræft i bugspytkirtlen fra frisk væv

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Cellefri DNA-ekstraktion af glasagtige og vandige humorprøver til diagnose og overvågning af vitreoretinal lymfom

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...