Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Les auteurs remercient Dr Richard Nowakowski et la Floride état Université laboratoire Animal ressources pour fournir et prendre soin des animaux utilisés afin d’élaborer ce protocole, respectueusement. Nous remercions Liu Xia, Dr Rakesh Singh et la Florida State University translationnelle Science Laboratory d’assistance avec le œuvre de spectrométrie de masse utilisée pour la caractérisation de la vésicule en aval, ainsi que la facilité aus Biological Sciences Imaging Resource l’utilisation du microscope électronique à transmission dans cette étude. Enfin, nous remercions le Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pour don des spécimens tumeur utilisés dans le développement de cette méthode. Cette étude a été financée par des subventions de la Floride ministère de la santé Ed et Ethel Moore Alzheimer maladie recherche programme attribué à D.G.M. et J.M.O (6AZ11) et le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous le numéro Award R01CA204621 attribué à D.G.M.

Cerveau entier ont été obtenus avec l’approbation de l’Institutional Animal Use et soin Comité (IACUC) de l’Université d’Etat de Floride. Un total de douze cerveaux de souris (3 cerveaux de chaque groupe d’âge : 2, 4, 6 et 8 mois) d’un J C57BL/6 fond ont été utilisés pour l’extraction de EV, comme précédemment décrit16. Les échantillons de tumeur pulmonaire ont été généreusement donnés par Dr Mandip Sachdeva sous approbation de la Florida Agricultural and IACUC méc...

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	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Intérêt scientifique s’est dégagé en ce qui concerne les rôles Qu'evs petits jouent dans le microenvironnement de la tumeur, ainsi que dans la fonction, la maturation et le développement de l’orgue. Dans l’ensemble, cette étude fournit un flux de travail optimisé pour l’extraction du SVE intact du cerveau entier ou les échantillons de tumeur. Alors qu’ici nous avons tout simplement démontrer l’applicabilité de cette technique au poumon dérivées de tumeurs SVE, cette méthode pourrait facilement ?...

Petites vésicules extracellulaires (EVs) incluent exosomes dérivés endosomale et petite membrane-hangar microvésicules qui sont d’intérêt biomédical en général. Petits EVs sont composées d’une population hétérogène de 50 à 250 nm membranaires vésicules contenant des protéines biologiquement actives, des lipides et des acides nucléiques qui sont censés collectivement jouent un rôle important dans une multitude de processus morbides. Faire avancer la recherche a impliqué notamment ces vésicules neurodégénératives et maladies à prions, processus infectieux, conditions autoimmunes ou inflammatoires et la croissance tumorale et métastase1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. essor de la recherche biomédicale dans la signification du SVE dans la pathogenèse de la maladie a suscité un intérêt parallèle à l’élaboration des méthodes reproductibles et rigoureux pour l’isolement et la purification de ces vésicules.
Un défi historique et actuel dans la caractérisation de l’EV a été l’incapacité de séparer entièrement petites sous-populations EV. Ce défi est en grande partie en raison de notre compréhension limitée des différents mécanismes moléculaires régissant la biogenèse des vésicules distinctes. Chevauchement de taille, densité et biologiques marchandises entre sous-populations plus matérielle de ces distinctions. Partie de ce défi a été également l’utilisation de différentes techniques d’enrichissement largement, offrant des incohérence dans l’analyse en aval de vésicules isolées dans les laboratoires et saper l’effort mondial visant à éclairer les populations EV catégoriques.
Il est à noter que la majorité des EV caractérisation a été effectuée de la collection in vitro de culture cellulaire surnageante, avec les plus récentes études in vivo, décrivant des techniques pour isoler les vésicules de sécrétions animales ou humaines, y compris plasma, urine et la salive. Alors que le serveur virtuel Exchange est présents en grande quantité en circulation, il est également reconnu que ces vésicules jouent un rôle important dans les événements de communication de cellule-cellule et sont présents dans l’interstitium des tissus cellulaires. Dans le contexte du cancer, EVs interstitielles peuvent être particulièrement importants dans la modulation du microenvironnement tumoral pour cellule cancéreuse semis et croissance métastatique14,15. Par conséquent, il y a valeur dans le développement et l’optimisation des techniques pour extraire des vésicules d’échantillons de tissus solides. Ces méthodes fournira un moyen d’étudier directement orgue - ou tumeur dérivée EVs récoltées à partir des échantillons cliniques, y compris les petites biopsies et résection partielle ou totale des organes.
Dans cette étude et dans un précédent rapport, publié par notre laboratoire16, nous avons pour objectif d’aborder plusieurs grandes préoccupations actuelles dans la méthodologie d’enrichissement EV : 1) pour décrire une technique reproductible pour isoler et purifier les EVs au plus haut niveau actuellement acceptée dans le domaine ; 2) pour tenter d’isoler les petites sous-populations EV fortement enrichies en dérivés endosomale exosomes ; et 3) de fournir un protocole pour l’extraction de ces vésicules provenant d’échantillons de tissu solide aux fins de la caractérisation plus loin.
Récemment, Kowal et collègues ont décrit un gradient de densité relativement petits iodixanol pour séparer et purifier les sous-populations EV avec une plus grande efficacité que saccharose comparables densité dégradés17. Dans l’étude citée, les EVs de culture cellulaire dendritiques capturés en une fraction de densité relativement légers, compatible avec une densité de 1,1 g/mL, ont été fortement enrichis en protéines endosomale censés être plus compatible avec une forte proportion des exosomes présent dans cette fraction. Selon les auteurs, ces protéines exosomal « bona fide » incluent gène de susceptibilité tumeur 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 et plusieurs annexin protéines17. Plus tard, nous avons adapté cette technique pour réussir une méthode de dissociation tissulaire décrite par Perez-Gonzalez et al.18 et un protocole de centrifugation différentielle suivantes pour isoler ensemble encéphales EVs16. Nous avons aussi démontré l’utilité de cette méthode pour la caractérisation des protéomes EV en combinant un protocole séquentiel pour la spectrométrie de masse quantitative et comparative en aval de protéine vésiculaire, déjà décrite par notre laboratoire19. Ce travail est parallèle à celle du laboratoire Hill, où EVs ont été enrichies du cortex frontal du cerveau20.
Dans cette étude, nous avons des précisions sur cette technique et étendre l’application du protocole a récemment publié dans notre laboratoire à l’isolement du SVE de tumeurs pulmonaires solide. À notre connaissance, c’est la première étude pour décrire un protocole afin d’enrichir les EVs d’ex vivo les échantillons de tumeur. Compte tenu de l’intérêt général suscité par EVs comme nouveaux biomarqueurs diagnostiques et leur rôle dans la tumorigenèse, cette méthode s’avérera sans doute précieuse pour un nombre croissant de chercheurs scientifiques. D’un point de vue clinique, EVs interstitielles pourraient abriter grande valeur diagnostique, en particulier dans les échantillons où évaluation histologique l'est limitée. Notre espoir est que la méthode décrite ici constituera un fondement pour une technique reproductible pour récolter des EVs des échantillons frais ou congelés animales ou humaines chirurgicales, ouvrant la voie à des travaux futurs découvrir le rôle important dans la pathogenèse de la maladie ces petites les vésicules peuvent jouer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Circulation et interstitielles petits extracellulaires vésicules membranaires (EVs) représentent des cibles prometteuses pour le développement de tests de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques et probablement servent comme des acteurs importants dans la progression d’un vaste éventail de maladies. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation des vésicules sécrétées par les cellules multiples et les types de tissus afin de mieux comprennent le rôle des véhicules électriques dans la pathogenèse de conditions, y compris la neurodégénérescence, l’inflammation et le cancer. Cependant, les techniques à l’échelle mondiale cohérentes et reproductibles pour isoler et purifier les vésicules demeurent en cours. En outre, méthodes d’extraction d’EVs de tissu solide ex vivo sont guère décrits. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour extraire l’EVs petits intérêt de tissus entiers frais ou congelés, y compris des échantillons de cerveau et tumeur, pour davantage de caractérisation. Nous avons démontré la capacité d’adaptation de cette méthode pour plusieurs analyses en aval, y compris la microscopie électronique et immunophénotypiques caractérisation des vésicules, ainsi que la spectrométrie de masse quantitative des protéines EV.

Un aperçu schématique de la dissociation tissulaire, centrifugation différentielle et gradient purification des vésicules est affiché à la Figure 1. La confirmation morphologique et immunophénotypiques des EVs purifiés par gradient est mis en évidence dans la Figure 2. Un schéma des densités reproductibles après ultracentrifugation du gradient iodixanol 10 à 30 % est donné, avec deux populations distinctes de vésic...

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Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’isoler les petites vésicules extracellulaires (EVs) de tissus entiers, y compris des échantillons de cerveau et la tumeur. Cette méthode offre une technique reproductible pour extraire les EVs de tissu plein pour approfondir les analyses en aval.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Ce protocole fournit une technique rigoureuse et reproductible pour l’extraction et l’isolement des petites vésicules extracellulaires provenant de spécimens de tissus entiers pour les analyses ex vivo en aval. Avec parmi les niveaux les plus élevés de pureté actuellement réalisables, cette méthode facilite la caractérisation directe morphologique, immunophéotypique et profonde des vésicules interstitielles sécrétées en divers spécimens de tissus, y compris les tumeurs. Ici, nous démontrons l’isolement des VE de tissu des spécimens de tumeur de cerveau et de poumon.Cependant, cette technique peut être appliquée aux études utilisant divers spécimens bénins, ou d’autres tumeurs aussi bien. Pour commencer, préparez 10 millilitres de tampon de dissociation dans le milieu Hibernate-E pour chaque 0,4 à 1,0 gramme de tissu. Ajouter les tissus entiers frais ou congelés au tampon dans un tube de 50 millilitres et incuber dans un bain d’eau chaude à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.Après cela, ajouter des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pour une concentration finale de 1 x dans le tampon de dissociation. Versez la solution avec le tissu dans un ajustement lâche vers le bas homogénéiseur. Utilisez environ 30 coups lents par échantillon pour dissocier doucement le tissu.Ensuite, transférez le tissu dissocié et la solution tampon dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse à 500x g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour pelleter les cellules et les fibres restantes ou des fragments de tissu cohésif. Transférer le supernatant dans un tube conique propre de 50 millilitres, et la centrifugeuse à 2000x g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter et jeter les gros débris cellulaires.Transférez ce supernatant dans un tube conique propre de 50 millilitres, et centrifugeuse à 10 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 40 minutes pour granuler les vésicules plus grandes non désirables ou les petits corps apoptotiques. Décanter le supernatant à travers un filtre de 0,45 micromètre dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 millilitres. Ensuite, ultracentrifugez l’échantillon à 100 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant deux heures, pour pelleter les petits VE.Décanter le supernatant et laisser les tubes d’ultracentrifugation inversés pendant cinq à dix minutes, en tapant fréquemment pour enlever tout liquide résiduel sur les côtés des tubes. Ensuite, resuspendez la pastille EV en tampon de saccharose molaire de 1,5 millilitres de 0,25. Couvrez les tubes avec Parafilm, puis vortex les VE dans la solution.Faire basculer les tubes d’ultracentrifugeuse de 10 à 15 minutes à température ambiante. Et puis vortex une fois de plus. Centrifugez brièvement les tubes à une vitesse inférieure à 1000x g pour récupérer la suspension liquide au fond du tube.Au besoin, conserver la suspension à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Tout d’abord, ajouter 1,5 millilitres de 60% iodixanol aux 1,5 millilitres du tampon tris saccharose qui contient les VE pour créer une solution finale contenant 30% iodixanol. Pipette de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger la solution.Transférez cette solution au fond d’un tube d’ultracentrifugation de 5,5 millilitres. Ensuite, mélangez le stock de 60% iodixanol avec de l’eau ultra pure pour préparer au moins 1,5 millilitres d’une solution 20% et 10% iodixanol. À l’aide d’une seringue et d’une aiguille de calibre 18, mesurez 1,3 millilitres de la solution iodixanol à 20 % et superposez-la soigneusement au-dessus du gradient inférieur.Gardez le biseau de l’aiguille en contact avec l’intérieur du tube, juste au-dessus du ménisque et ajoutez la solution goutte sage pour éviter de mélanger les couches à l’interface de densité. Ensuite, superposer 1,2 millilitres de la solution 10% iodixanol sur le dessus de la couche de 20%, en utilisant la même technique. Équilibrez soigneusement et chargez les tubes d’ultracentrifugation dans des seaux de rotor.Réglez les vitesses d’accélération et de décélération d’un rotor de seau de balançoire aux taux minimaux, et la centrifugeuse à 268 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 50 minutes. Pendant que l’échantillon est centrifugé, étiquetez 10 tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour chaque échantillon qui correspondront à des fractions d’un à dix du gradient de densité. Une fois la centrifugation terminée, retirez doucement les tubes des seaux du rotor et placez-les dans un support stable.Pipette 10 fractions de série de 490 microlitres du haut du gradient dans les tubes correspondants. À l’aide d’un réfractomètre, mesurer les indices réfractifs des fractions. Ensuite, transférez chaque fraction dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 millilitres.Ajouter cinq millilitres de 1x PBS à chaque tube et pipette de haut en bas lentement pour mélanger. Ajouter six millilitres supplémentaires de 1x PBS sur le dessus du tube, et mélanger soigneusement à nouveau. Ultracentrifugez les tubes à 100 000 x g et à quatre degrés Celsius pour re-pelleter les petites vésicules.Décanter le supernatant et appuyez sur les tubes secs avant de lyser les vésicules pour l’analyse des protéines ou de réutiliser les VE pour l’analyse morphologique. Pour lyse les VE pour l’analyse des protéines, ajouter 40 microlitres de tampon de lyse forte contenant inhibiteur de la protéase pour les granulés EV. Placez le parafilm sur chaque tube et vortex vigoureusement.Ensuite, faire basculer les tubes pendant 20 minutes à température ambiante et vortex à nouveau. Centrifugez brièvement l’échantillon à 1 000 x g pendant 30 à 60 secondes pour récupérer tout le volume de l’échantillon. Transférez chaque échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et rangez-le à une température comprise entre 20 et 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour un traitement ultérieur.Pour préparer les lysates purifiés à l’analyse des immunoblots, ajoutez 5 x tampon d’échantillon laemmli aux échantillons pour une concentration finale de 1x. Faire bouillir l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Ensuite, chargez un volume égal de fractions d’un à 10 dans un gel de page SDS de 10%.Chargez une masse égale d’homogénéité tissulaire. Effectuez l’analyse de l’électrophoresis et de la tache occidentale pour confirmer les protéines EV dans les lysates purifiés et comparer l’abondance relative d’EV en fractions. Dans cette étude, les vésicules extracellulaires sont extraites et purifiées à partir de tissus entiers.Après l’ultracentrifugation du gradient iodixanol de 10 à 30 %, on peut voir une population de VE légers migrer jusqu’à la fraction deux, tandis qu’une population de VE denses peut être vue migrant jusqu’à la fraction cinq, selon le type de tissu. Les immunoblots représentatifs des fractions de gradient montrent la séparation et la purification efficaces des petits VE dérivés de tumeur dans la fraction cinq. Notamment, les spécimens de tumeur de poumon semblent enrichis en VE denses comparés aux VE légers qui ont été précédemment récoltés du tissu entier de cerveau.L’analyse représentative de suivi des nanoparticules et la microscopie électronique des vésicules dérivées des tissus dans la vésicule prédominante contenant une fraction démontrent l’enrichissement et la préservation de vésicules entières. Compatible avec la taille et la structure connues des petits VE. Les VE interstitiels représentent des cibles prometteuses pour le développement de nouveaux tests diagnostiques ou pronostiques de biomarqueurs.Cette technique fournit aux chercheurs des outils pour l’extraction et la purification des vésicules pour l’utilité en aval. Après l’extraction des VE de tissu entiers ou lysed, la caractérisation large des vésicules comprenant les analyses protéomiques, génomiques, et lipidomiques peut être exécutée. En outre, des échantillons peuvent être utilisés pour des approches plus ciblées.Les vésicules isolées directement des échantillons de tissus peuvent fournir un aperçu supplémentaire des mécanismes de la maladie, y compris la genèse tumorale, et peuvent fournir des outils diagnostiques ou pronostiques importants à l’avenir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolement de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes transportant un facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages à partir de cellules souches embryonnaires

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Génération et imagerie d’organoïdes épithéliaux de souris et humains à partir de tissus mammaires normaux et tumoraux sans passage

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Procédé d’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Mise en place d’organoïdes tumoraux et de fibroblastes dérivés du cancer du pancréas à partir de tissus frais

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Extraction d’ADN acellulaire d’échantillons d’humeur vitréenne et aqueuse pour le diagnostic et la surveillance du lymphome vitréo-rétinien

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...