Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
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Die Autoren danken Dr. Richard Nowakowski und die Florida State University Labor Tier Ressourcen für die Bereitstellung und Pflege für die Tiere zu diesem Protokoll respektvoll zu entwickeln. Wir danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh und Florida State University translationale Science Laboratory für Hilfe mit der Massenspektrometrie Arbeit zur nachgelagerten Vesikel Charakterisierung sowie die FSU Biological Science Imaging Resource-Anlage für die Verwendung des Transmissions-Elektronenmikroskop in dieser Studie. Zu guter Letzt danken wir Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) für die Spende der Tumor Proben bei der Entwicklung dieser Methode verwendet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Florida Department of Health Ed und Ethel Moore Alzheimer Krankheit Forschungsprogramm an D.G.M. und J.M.O (6AZ11) und das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Prämiennummer vergeben R01CA204621 an D.G.M. vergeben

Ganze Köpfe wurden mit Genehmigung von der institutionellen Tier Nutzung und Pflege Committee (IACUC) von der Florida State University erhalten. Insgesamt zwölf Mäusegehirnen (3 Gehirne aus jeder Altersgruppe: 2, 4, 6 und 8 Monate) aus einem C57BL/6 J Hintergrund für EV-Extraktion, wie zuvor beschrieben16dienten. Lung Tumor Proben wurden von Dr. Mandip Sachdeva unter Zustimmung des Florida Agricultural and Mechanical University IACUC großzügig gespendet. Lungentumore stammen aus der menschli...

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	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Viel wissenschaftliches Interesse wurde im Hinblick auf die Rollen, die kleine EVs in der Mikroumgebung Tumor sowie in Organentwicklung, Reifung und Funktion spielen generiert. Insgesamt bietet diese Studie einen optimierten Workflow für die Gewinnung von intakten EVs aus Gesamt-Hirn oder Tumor Proben. Während hier wir einfach die Anwendbarkeit dieser Technik auf Lunge Tumor abgeleitet EVs zeigen, könnte diese Methode einfach angepasst werden für die Arbeit auf anderen festen Geweben, Möglichkeiten für weitere Ex V...

Kleinen extrazelluläre Vesikel (EVs) gehören Endosomal abgeleitet Exosomen und kleine Membran-Schuppen-Microvesicles, die von breiten biomedizinischen Interesse sind. Kleinen EVs bestehen aus einer heterogenen Bevölkerung von 50-250 nm Membrane-springen Vesikeln mit biologisch aktiven Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die kollektiv geglaubt werden, um in einer Vielzahl von Krankheiten eine wichtige Rolle spielen. Förderung der Forschung hat diese Vesikel in Neurodegenerative und Prion-Erkrankungen, infektiöse Prozesse, Autoimmun- oder entzündlichen Bedingungen und Tumorwachstum und Metastasierung1,2,3 besonders verwickelt. , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. schnell wachsenden biomedizinischen Forschung in die Bedeutung der EVs in der Pathogenese der Krankheit hat parallel Interesse an der Entwicklung reproduzierbarer und rigoroser Methoden zur Isolierung und Reinigung von diesen Bläschen erzeugt.
Eine historische und aktuelle Herausforderung in EV Charakterisierung wurde die Unfähigkeit, kleine EV Subpopulationen vollständig zu trennen. Diese Herausforderung ist im Wesentlichen auf unser begrenztes Verständnis der unterschiedlichen molekularen Mechanismen für die Biogenese von unterschiedlichen Vesikeln. Überlappende Größe, Dichte und biologischen Fracht zwischen Subpopulationen weitere Umdrehungen diese Unterscheidungen. Teil dieser Herausforderung wurde auch die Verwendung weit unterschiedliche Anreicherung Techniken, Inkonsistenz in nachgelagerte Analyse der isolierten Vesikel in Laboratorien und aufrechtzuerhalten, und untergräbt die globale Anstrengungen zur kategorische EV Populationen zu beleuchten.
Es ist erwähnenswert, dass die Mehrheit der EV Charakterisierung von in-vitro-Sammlung der Zellkultur überstand, mit neueren Studien in vivo Beschreibung Techniken zur Isolierung von Vesikeln aus tierischen oder menschlichen Körperflüssigkeiten, einschließlich Plasma, Urin durchgeführt wurde , und Speichel. EVs in großen Mengen im Umlauf sind, erkannte sie auch, dass diese Vesikel spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikationsveranstaltungen und in das Interstitium der zellulären Gewebe vorhanden sind. In Zusammenhang mit Krebs möglicherweise interstitielle EVs Modulation der Tumor Mikroumgebung für Krebszelle Aussaat und metastasiertem Wachstum14,15besonders wichtig. Infolgedessen gibt es Wert bei der Entwicklung und Optimierung von Techniken, um Bläschen aus soliden Gewebeproben zu extrahieren. Diese Methoden bieten eine Möglichkeit direkt Orgel - Studium oder Tumor - EVs geerntet von klinischen Proben, einschließlich kleinen Biopsien und teilweise oder vollständige Orgel Resektionen abgeleitet.
In dieser Studie und in einem früheren Bericht, herausgegeben von unserem Labor16wollen wir mehrere wichtige aktuelle EV Bereicherung Methodik Bedenken: 1) um eine reproduzierbare Technik zu isolieren und reinigen EVs nach den höchsten Standards derzeit zu beschreiben auf dem Fachgebiet anerkannt; (2) zu versuchen, kleine EV Subpopulationen hochangereichertes im Endosomal abgeleitet Exosomen zu isolieren; und 3), ein Protokoll für die Gewinnung von diesen Bläschen aus massivem Gewebeproben zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung zu stellen.
Vor kurzem, Kowal und Kollegen beschrieben eine relativ kleine Iodixanol Dichtegradient zu trennen und zu reinigen EV Subpopulationen mit größerer Wirksamkeit als vergleichbare Saccharose Dichte Gradienten17. In der zitierten Studie wurden dendritische Zelle abgeleitet EVs, eingefangen in Sekundenbruchteilen relativ geringer Dichte, mit einer Dichte von 1,1 g/mL, in Endosomal Proteine als konsequenteste mit einem hohen Anteil von Exosomen vorhanden in diesem hochangereichertes Bruchteil. Nach Ansicht der Autoren enthalten dieser "bona fide" Exosomal Proteine Tumor Anfälligkeit gen 101 (TSG101), Syntenin-1, CD81 ADAM10, EHD4 und mehrere annexin Proteine17. Diese Technik, um eine Methode der Gewebe Dissoziation von Perez Gonzalez Et al.18 und eine nachfolgende differentielle Zentrifugation Protokoll zum ganzen Gehirn abgeleitet EVs16isolieren beschrieben gelingt später angepasst Wir zeigten auch die Nützlichkeit dieser Methode bei der Charakterisierung EV Proteome durch die Kombination eine sequenzielle Protokoll für nachgeschaltete quantitative und vergleichende Massenspektrometrie vesikuläre Protein, zuvor von unserem Labor19beschrieben. Diese arbeiten parallel, die aus dem Hill-Labor, in dem EVs aus der frontalen Kortex des Gehirns20angereichert wurden.
In dieser Studie wir näher auf diese Technik und die Anwendung des Protokolls vor kurzem von unserem Labor auf die Isolation der EVs aus massivem Lungentumoren zu verlängern. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie zu beschreiben, ein Protokoll zur EVs aus ex-Vivo Tumor Proben zu bereichern. Das breite Interesse im Rahmen des EFD als neuartige diagnostischen Biomarkern und ihre Rolle in der Tumorgenese gegeben, wird diese Methode wahrscheinlich für eine wachsende Zahl von wissenschaftlichen Forscher wertvoll erweisen. Aus klinischer Sicht könnte interstitielle EVs großen diagnostischen Wert, vor allem bei Exemplaren Hafen wo histologische Auswertung begrenzt ist. Unsere Hoffnung ist, dass die hier beschriebene Methode eine Grundlage für eine reproduzierbare Technik EVs aus frischen oder gefrorenen tierischen oder menschlichen chirurgische Proben, ebnet den Weg für die künftige Arbeit aufzudecken die bedeutende Rolle in der Pathogenese der Krankheit diese kleine Ernte Bläschen können spielen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Zirkulierenden und interstitielle kleine Membrane-springen extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen viel versprechende Ziele für die Entwicklung von neuartigen diagnostische oder prognostische Biomarker Assays und wahrscheinlich dienen als wichtige Akteure bei der Progression von ein breites Spektrum von Krankheiten. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung von Vesikeln aus mehreren Zelle sezerniert und Gewebetypen um besser zu verstehen, welche Rolle der EVs in der Pathogenese der Bedingungen, einschließlich Neurodegeneration, Entzündungen und Krebs. Bleiben jedoch weltweit konsistente und reproduzierbare Techniken zu isolieren und reinigen Vesikel im Gange. Darüber hinaus werden Methoden zur Gewinnung von EVs aus festen Gewebe ex Vivo kaum beschrieben. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Extrahieren von kleinen EVs von Interesse aus ganz frischen oder gefrorenen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zur weiteren Charakterisierung. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit dieser Methode für mehrere nachgeschaltete Analysen, einschließlich Elektronenmikroskopie und Immunophenotypic Charakterisierung von Vesikeln sowie quantitative Massenspektrometrie EV Proteine.

Eine schematische Übersicht über die Gewebe Dissoziation, differentielle Zentrifugation und gradient Reinigung von Vesikeln wird in Abbildung 1angezeigt. Die morphologische und Immunophenotypic Bestätigung der Gradient-gereinigte EVs wird in Abbildung 2hervorgehoben. Ein Diagramm der reproduzierbaren dichten nach Ultrazentrifugation des 10-30 % Iodixanol Verlaufs mit zwei unterschiedlichen Vesikel Populationen migrieren nach o...

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Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Dieses Protokoll bietet eine strenge und reproduzierbare Technik zur Extraktion und Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus ganzen Gewebeproben für nachgeschaltete Ex-vivo-Analysen. Mit einem der höchsten Reinheitsgrade, die derzeit erreichbar sind, erleichtert diese Methode die direkte morphologische, immunphenotypic, und tiefe Charakterisierung der interstitiellen Vesikel in verschiedenen Gewebeproben, einschließlich Tumoren sezerniert. Hier zeigen wir die Isolierung von Gewebe-EVs von Hirn- und Lungentumorproben.Diese Technik kann jedoch auch auf Studien mit verschiedenen, gutartigen oder anderen Tumorproben angewendet werden. Zu Beginn 10 Milliliter Dissoziationspuffer im Hibernate-E-Medium für jedes 0,4 bis 1,0 Gramm Gewebe vorbereiten. Fügen Sie das gesamte frische oder gefrorene Gewebe in einem 50-Milliliter-Rohr in den Puffer und in einem warmen Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren.Danach protease und Phosphatase-Inhibitoren für eine endgültige 1x Konzentration im Dissoziationspuffer hinzufügen. Gießen Sie die Lösung mit dem Gewebe in einen lockeren Fit-Down-Homogenisator. Verwenden Sie etwa 30 langsame Striche pro Probe, um das Gewebe sanft zu dissoziieren.Übertragen Sie dann die dissoziierte Gewebe- und Pufferlösung in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Zentrifugieren Sie bei 500x g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um die Zellen und die restlichen Fasern oder kohäsiven Gewebefragmente zu pellet. Übertragen Sie den Überstand auf ein sauberes 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 2.000x g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die großen Zellablagerungen zu pellet und zu entsorgen.Übertragen Sie diesen Überstand auf ein sauberes 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 10.000x g und bei vier Grad Celsius für 40 Minuten, um unerwünschte größere Vesikel oder kleine apoptotische Körper zu pellet. Dekantieren Sie den Überstand durch einen 0,45-Mikrometer-Filter in ein sauberes 12-Milliliter-Ultrazentrifugationsrohr. Als nächstes ultrazentrifugieren Sie die Probe bei 100, 000x g und bei vier Grad Celsius für zwei Stunden, um kleine Elektrofahrzeuge zu pellet.Dekantieren Sie den Überstand und lassen Sie die Ultrazentrifugationsrohre fünf bis zehn Minuten invertiert, indem Sie häufig tippen, um Restflüssigkeit an den Seiten der Rohre zu entfernen. Dann setzen Sie das EV-Pellet in 1,5 Milliliter 0,25 Molsukrosepuffer wieder aus. Bedecken Sie die Rohre mit Parafilm, und wirbeln Sie dann die Elektrofahrzeuge in Lösung.Die Ultrazentrifugenrohre 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur schaukeln. Und dann noch einmal Wirbel. Zentrifugieren Sie die Rohre kurz mit einer Geschwindigkeit von weniger als 1.000x g, um die Flüssigkeitssuspension an der Unterseite des Rohres zurückzugewinnen.Bei Bedarf die Suspension bei vier Grad Celsius über Nacht aufbewahren. Fügen Sie zunächst 1,5 Milliliter 60%Iodixanol zu den 1,5 Millilitern des Saccharose-Tris-Puffers hinzu, der die EVs enthält, um eine endige Lösung mit 30% Iodixanol zu erstellen. Pipette auf und ab mehrmals, um die Lösung gründlich zu mischen.Übertragen Sie diese Lösung auf den Boden eines 5,5 Milliliter Ultrazentrifugationsrohrs. Als nächstes mischen Sie den 60%iodixanol Stock mit ultrareinem Wasser, um mindestens 1,5 Milliliter von 20% und einer 10%iodixanol Lösung vorzubereiten. Mit einer Spritze und einer 18-Meter-Nadel 1,3 Milliliter der 20%iodixanol-Lösung messen und sorgfältig auf den unteren Farbverlauf schichten.Halten Sie die Nadelfase in Kontakt mit der Innenseite des Rohres, direkt über dem Meniskus und fügen Sie die Lösung Tropfen weise, um zu vermeiden, mischen Sie die Schichten an der Dichte-Schnittstelle. Schicht 1,2 Milliliter der 10%iodixanol Lösung auf der Oberseite der 20%-Schicht, mit der gleichen Technik. Wägen Und laden Sie die Ultrazentrifugationsrohre sorgfältig in Rotorschaufeln.Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsgeschwindigkeiten eines Schwenkschaufelrotors auf die Mindestgeschwindigkeiten und zentrifugieren Sie für 50 Minuten auf 268.000x g und auf vier Grad Celsius. Während die Probe zentrifugiert wird, beschriften Sie 10 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre für jede Probe, die den Fraktionen eins bis 10 des Dichtegradienten entsprechen. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Rohre vorsichtig aus den Rotorschaufeln und legen Sie sie in einen stabilen Halter.Pipette 10 Serielle Fraktionen von 490 Mikrolitern von der Oberseite des Farbverlaufs in die entsprechenden Rohre. Messen Sie mit einem Refraktometer die Brechungsindizes der Brüche. Übertragen Sie dann jede Fraktion in ein sauberes 12-Milliliter-Ultrazentrifugationsrohr.Fügen Sie fünf Milliliter 1x PBS zu jedem Rohr und Pipette nach oben und unten langsam zu mischen. Fügen Sie weitere sechs Milliliter 1x PBS an die Oberseite des Rohres und sorgfältig mischen. Ultrazentrifugieren Sie die Rohre bei 100, 000x g und bei vier Grad Celsius, um die kleinen Vesikel neu zu pellet.Dekantieren Sie den Überstand und tippen Sie auf die Rohre trocken, bevor Sie die Vesikel zur Proteinanalyse lysieren oder die Elektrofahrzeuge für die morphologische Analyse resuspendieren. Um die Elektrofahrzeuge für die Proteinanalyse zu lysieren, fügen Sie 40 Mikroliter starken Lysepuffers, der Proteaseinhibitor enthält, in die EV-Pellets ein. Parafilm über jedes Rohr legen und kräftig wirbeln.Als nächstes die Rohre für 20 Minuten bei Raumtemperatur und Wirbel wieder schaukeln. Zentrifugieren Sie die Probe kurz 30 bis 60 Sekunden lang bei 1.000x g, um das gesamte Probenvolumen wiederherzustellen. Jede Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben und bei einer Temperatur zwischen 20 und 80 Grad Celsius lagern, bis sie zur Weiterverarbeitung bereit ist.Um die gereinigten Lysate für die Immunoblot-Analyse vorzubereiten, fügen Sie den Proben 5x Laemmli-Probenpuffer für eine Endkonzentration von 1x hinzu. Kochen Sie die Probe bei 95 Grad Celsius für fünf bis zehn Minuten. Laden Sie dann ein gleiches Volumen von Brüchen eins bis zehn in ein 10%SDS-Seitengel.Belasten Sie eine gleiche Masse von Gewebe homogenat. Führen Sie Elektrophorese und Western Blot-Analysen durch, um EV-Proteine in den gereinigten Lysaten zu bestätigen und die relative EV-Fülle in Fraktionen zu vergleichen. In dieser Studie werden extrazelluläre Vesikel extrahiert und aus ganzem Gewebe gereinigt.Nach der Ultrazentrifugation des 10 bis 30%iodixanol Gradienten kann eine Population von Licht-EVs gesehen werden, die bis zu Bruchteil zwei migrieren, während eine Population von dichten Elektrofahrzeugen gesehen werden kann, die je nach Gewebetyp bis zu Bruchteil fünf wandert. Repräsentative Immunoblots der Gradientenfraktionen weisen die effiziente Trennung und Reinigung kleiner tumorabgeleiteter Elektrofahrzeuge in Fraktion fünf auf. Bemerkenswert ist, dass Lungentumorproben in dichten Elektrofahrzeugen angereichert erscheinen, verglichen mit Licht-EVs, die zuvor aus ganzem Hirngewebe geerntet wurden.Repräsentative Nanopartikel-Tracking-Analysen und Elektronenmikroskopie von gewebeabgeleiteten Vesikeln in der vorherrschenden Vesikel-haltigen Fraktion zeigen die Anreicherung und Konservierung ganzer Vesikel. Im Einklang mit der bekannten Größe und Struktur von kleinen Elektrofahrzeugen. Interstitielle Elektrofahrzeuge stellen vielversprechende Ziele für die Entwicklung neuartiger diagnostischer oder prognostischer Biomarker-Assays dar.Diese Technik stellt Forschern Werkzeuge für die Extraktion und Reinigung von Vesikeln für nachgeschaltete Nutzen zur Verfügung. Nach extraktion von ganzen oder lysierten Gewebe-EVs kann eine breite Charakterisierung von Vesikeln einschließlich proteomischer, genomischer und lipidomischer Analysen durchgeführt werden. Darüber hinaus können Stichproben für gezieltere Ansätze verwendet werden.Vesikel, die direkt aus Gewebeproben isoliert werden, können weitere Einblicke in Krankheitsmechanismen, einschließlich der Tumorgenese, liefern und in Zukunft wichtige diagnostische oder prognostische Werkzeuge liefern.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Forschung

Krebsforschung

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Untersuchung normaler Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolierung von exosomenangereicherten extrazellulären Vesikeln, die Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor aus embryonalen Stammzellen tragen

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Erzeugung und Bildgebung von Epithelorganoiden von Mäusen und Menschen aus normalem und Tumor-Brustgewebe ohne Passaging

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Zellfreie DNA-Extraktion von Glaskörper- und Kammerwasserproben zur Diagnose und Überwachung des vitreoretinalen Lymphoms

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...