Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

המחברים תודה ד ר ריצ'רד Nowakowski פלורידה המדינה אוניברסיטת מעבדה חיה המשאבים עבור מתן ודאגה לבעלי החיים השתמשו לפתח פרוטוקול זה, עם כל הכבוד. אנו מודים שיה ליו ר ראקש סינג, פלורידה המדינה אוניברסיטת Translational מדעי המעבדה לקבלת סיוע עם העבודה ספקטרומטר מסה המשמש אפיון שלפוחית במורד הזרם, וכן במתקן חמ ע מדע ביולוגי הדמיה משאבים עבור השימוש של המיקרוסקופ האלקטרוני שידור במחקר זה. לבסוף, אנו מודים ד ר Mandip Sachdeva (פלורידה A & M באוניברסיטת) על תרומה של דגימות הגידול בשימוש בפיתוח של שיטה זו. מחקר זה נתמך על ידי מענקים משרד הבריאות של פלורידה אד אתל מור אלצהיימר המחלה מחקר תוכנית הוענק D.G.M., J.M.O (6AZ11), המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס R01CA204621 הוענק D.G.M.

כל המוח התקבלו עם אישור של שימוש חיה מוסדיים ו טיפול הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מדינת פלורידה. סכום כולל של 12 מוח העכבר (3 המוח של כל קבוצת גיל: 2, 4, 6, ו- 8 חודשים) מ- C57BL/6 J שימשו רקע עבור EV החילוץ, כפי שתואר לעיל16. ריאות הגידול דגימות נתרמו בנדיבות על ידי ד ר Mandip Sachdeva תחת אישור של פלורי?...

<ol>
	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

עניין מדעי הרבה נוצרה לגבי התפקידים ש-evs קטן לשחק את microenvironment הגידול, וכן התפתחות האיברים, התבגרות, ופועלים. באופן כללי, מחקר זה מספק זרימת עבודה מיטביים עבור החילוץ של EVs שלם כל המוח או דגימות הגידול. ואילו כאן פשוט נדגים את הישימות של טכניקה זו EVs ריאות נגזר הגידול, שיטה זו יכול בקלות להיות מ...

שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EVs) כוללים endosomal, נגזר exosomes קטן שלפוחיות זעירות ממברנה-המחסן יש עניין הביו-רפואית רחבה. EVs קטנות המורכבות אוכלוסיה הטרוגנית של 50-250 ננומטר מאוגד-קרום שלפוחית המכילה חלבונים אקטיביות ליפידים, חומצות גרעין, כי הם האמינו קולקטיבי לשחק תפקידים חשובים שפע של תהליכי מחלה. קידום מחקר במיוחד בהפרות אלה שלפוחית ניווניות, הפרעות פריון, תהליכים זיהומיות, תנאי אוטואימוניות או דלקתיים, ואת הגידול, גרורה1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. במהירות גוברת המחקר הביו-רפואי לתוך המשמעות של EVs בפתוגנזה של המחלה יצר עניין מקבילים בפיתוח שיטות מחמירות הדירים בידוד ולטיהור שלפוחית אלה.
אתגר היסטוריים, ב- EV אפיון היה חוסר היכולת הפרדה מלאה subpopulations EV קטן. אתגר זה נובע במידה רבה הבנתנו המנגנונים המולקולריים שונות המסדירים את להן של שלפוחית ברורים מוגבלת. חופפים גודל, צפיפות מטען ביולוגיים בין subpopulations נוספות convolutes הבחנות אלו. חלק באתגר זה היה שימוש נרחב העשרה טכניקות שונות, מתן עקביות בניתוח במורד הזרם של שלפוחית מבודד מעבר מעבדות, ערעור מהמאמץ העולמי כדי להאיר קטגורית אוכלוסיות EV.
ראוי לציין כי הרוב המכריע של EV אפיון בוצעה מאוסף במבחנה של תרבית תאים supernatant, עם מחקרים מאוחרים יותר ויוו המתארת טכניקות כדי לבודד שלפוחית של נוזלי הגוף בעל חיים או אדם, לרבות פלזמה, שתן , ורוק. בעוד EVs נמצאים בכמויות גדולות במחזור, גם זיהה כי שלפוחית אלה תפקיד חשוב אירועי תקשורת לתא, נמצאים interstitium של רקמות הסלולר. בהקשר של סרטן, interstitial EVs עשוי להיות חשובה במיוחד להתכוונן microenvironment הגידול של תא סרטני זריעה, גידול גרורתי14,15. כתוצאה מכך, יש ערך לפיתוח, אופטימיזציה של טכניקות כדי לחלץ שלפוחית דגימות רקמה מוצק. שיטות אלה תספק אמצעי ללמוד ישירות איברים - או גידול נגזר EVs שנקטפו דגימות קליניים, כולל ביופסיות קטן כריתות איברים חלקיים או מלאים.
במחקר זה, בדו ח הקודם שפרסם שלנו מעבדה16, אנו שואפים כתובת מספר חששות הנוכחי העיקריים ב- EV העשרה מתודולוגיה: 1) כדי לתאר שיטה לשחזור כדי לבודד ולטהר EVs בסטנדרטים הגבוהים ביותר כיום מתקבלים בשדה; 2) כדי לנסות לבודד subpopulations EV קטן מאוד מועשר בנגזר endosomal exosomes; ו 3) כדי לספק פרוטוקול על החילוץ של שלפוחית אלה של דגימות רקמה מוצק לצורך אפיון נוסף.
לאחרונה, Kowal ועמיתיו תיאר הדרגתי צפיפות iodixanol בקנה מידה קטן יחסית כדי להפריד ולטהר subpopulations EV עם יעילות רבה יותר מאשר סוכרוז דומות צפיפות מעברי צבע17. במחקר מצוטט, דנדריטים, נגזר תא EVs בשבי שבריר צפיפות נמוכה יחסית, בקנה אחד עם צפיפות של 1.1 g/mL, היו מועשר מאוד בחלבונים endosomal האמין להיות הכי עקבי עם שיעור גבוה של exosomes נוכח בזה שבר. על פי המחברים, חלבונים אלה exosomal "בתום לב" כללה גידול הרגישות ג'ין 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 ו- חלבונים annexin מספר17. אחר כך התאמנו בטכניקה זו כדי להצליח בשיטה של דיסוציאציה רקמות מתוארת על ידי פרז גונזאלס ואח18 ו פרוטוקול עוקבות צנטריפוגה דיפרנציאלית לבודד כל הנגזרות המוח EVs16. אנחנו גם הפגינו השירות של שיטה זו של אפיון EV proteomes על-ידי שילוב פרוטוקול רציפים עבור במורד הזרם כמותיים ולמשפט השוואתי ספקטרומטר מסה של חלבון vesicular, שתואר קודם לכן על ידי המעבדה שלנו19. עבודה זו הוקרב זה מהמעבדה היל, שבו היו EVs מועשר מאזור הקליפה הקדמית של המוח20.
במחקר זה, אנו להרחיב על טכניקה זו, להרחיב את היישום של פרוטוקול שפורסם לאחרונה מן המעבדה שלנו את בידודה של EVs של גידולים מוצקים ריאות. לידע שלנו, זהו המחקר הראשון לתאר את פרוטוקול להעשיר EVs מ ex דגימות הגידול vivo. בהתחשב להתעניינות של EVs כמו הרומן אבחון סמנים ביולוגיים ותפקידם tumorigenesis, שיטה זו צפויה להוכיח ערך מספר גדל והולך של חוקרי מדעי. מבחינה קלינית, interstitial EVs יכול הנמל ערך אבחוני רב, בפרט דגימות איפה הערכה היסטולוגית היא מוגבלת. תקוותנו היא כי השיטה שמפורטות כאן תספק בסיס שיטה לשחזור לקצור EVs מטרי או קפוא בעלי חיים או אדם ניתוח דגימות, לסלול את הדרך לעבודה עתידית לחשוף התפקידים משמעותית בפתוגנזה של המחלה אלה קטן שלפוחית עשוי לשחק.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

מחזורי, interstitial קטן מאוגד-ממברנה חוץ-תאית שלפוחית (EVs) מייצגים מטרות המבטיחים פיתוח מבחני הרומן סמן prognostic או אבחון, ולשמש סביר שחקנים חשובים ההתקדמות של ספקטרום עצום של מחלות. המחקר הנוכחי מתמקד אפיון שלפוחית מופרש מן התא מרובים, סוגי רקמות כדי להבין את התפקיד של EVs בפתוגנזה של תנאים לרבות הקשורים ניוון מוחיים, דלקת סרטן. עם זאת, באופן גלובלי עקבי וטכניקות לשחזור כדי לבודד ולטהר שלפוחית נשארים בתהליך. יתר על כן, שיטות לחילוץ של EVs של רקמה מוצק שמחוץ מתוארים בקושי. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחילוץ EVs קטן עניין רקמות שלם טרי או קפוא, כולל דגימות המוח ואת הגידול, על אפיון נוסף. נדגים את יכולת ההתאמה של שיטה זו עבור מספר ניתוחים במורד הזרם, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, immunophenotypic אפיון של שלפוחית, כמו גם כמותיים ספקטרומטר מסה של חלבונים EV.

מבט סכמטי של רקמות דיסוציאציה, צנטריפוגה דיפרנציאלית, טיהור הדרגתי של שלפוחית מוצג באיור1. אישור מורפולוגיות ו immunophenotypic של EVs מטוהרים הדרגתי מודגשת באיור2. דיאגרמה של צפיפויות לשחזור בעקבות ultracentrifugation של המילוי ההדרגתי iodixanol 10-30% מוצג, עם ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

פרוטוקול זה מספק טכניקה קפדנית לשחזור עבור מיצוי ובידוד של גירויים חוץ תאיים קטנים מדגימות רקמה שלמה עבור ניתוחים במורד הזרם לשעבר vivo. עם בין הרמות הגבוהות ביותר של טוהר כיום בר השגה, שיטה זו מקלה על מורפולוגי ישיר, immunophenotypic, ואפיון עמוק של גירויים ביניים המופרשים לתוך דגימות רקמה שונות, כולל גידולים. כאן, אנו מדגימים את הבידוד של כלי רכב חשמליים רקמה מדגימות גידול במוח ובריאות.עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים באמצעות מגוון, שפיר, או דגימות גידול אחרות גם כן. כדי להתחיל, להכין 10 מיליליטר של חיץ דיסוציאציה ב Hibernate-E בינוני עבור כל 0.4 כדי 1.0 גרם של רקמה. מוסיפים רקמה טרייה או קפואה שלמה למאגר בצינור של 50 מיליליטר, וגוררים באמבט מים חמים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.לאחר מכן, מוסיפים מעכבי פרוטאז ופוספטאז לריכוז 1x הסופי במאגר הדיסוציאציה. יוצקים את הפתרון עם הרקמה לתוך התאמה רופפת downs homogenizer. השתמש כ 30 משיכות איטיות לכל מדגם כדי לנטרל בעדינות את הרקמה.לאחר מכן, להעביר את הרקמה דיסוציאציה פתרון חיץ לצינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500x גרם וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים ואת הסיבים הנותרים או שברי רקמה מגוונים. מעבירים את העל-טבעי לצינור חרוט נקי של 50 מיליליטר, ולצנטריפוגה ב-2,000x גרם וב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לסלק ולהשליך את הפסולת התאית הגדולה.מעבירים את העל-טבעי הזה לצינור חרוט נקי של 50 מיליליטר, ולצנטריפוגה ב-10, 000x g וב-4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לסלק וריצים גדולים יותר או גופים אפופטיים קטנים. Decant supernatant דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה נקי 12 מיליליטר. לאחר מכן, ultracentrifuge את המדגם ב 100, 000x g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, כדי גלולה כלי רכב חשמליים קטנים.Decant את supernatant ולהשאיר את צינורות ultracentrifugation הפוך במשך חמש עד 10 דקות, הקשה לעתים קרובות כדי להסיר כל נוזל שיורית בצידי הצינורות. לאחר מכן, לחץ מחדש את גלולת EV ב 1.5 מיליליטר של 0.25 חיץ סוכרוז טוחנת. מכסים את הצינורות עם Parafilm, ולאחר מכן מערבולת כלי רכב חשמליים לפתרון.רוק צינורות אולטרהצנטריפוגה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז מערבולת פעם נוספת. בקצרה צנטריפוגה הצינורות במהירות פחות מ 1, 000x g כדי לשחזר את המתלה הנוזלי בתחתית הצינור.במידת הצורך, לאחסן את ההשעיה בארבע מעלות צלזיוס לילה. ראשית, להוסיף 1.5 מיליליטר של 60% יודיקסנול 1.5 מיליליטר של מאגר טריס סוכרוז המכיל את כלי רכב חשמליים כדי ליצור פתרון סופי המכיל 30%יודיקסנול. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון ביסודיות.העבר פתרון זה לתחתית צינור אולטרה-מרכז 5.5 מיליליטר. לאחר מכן, מערבבים את מניית יודיקסנול 60% עם מים טהורים במיוחד כדי להכין לפחות 1.5 מיליליטר של 20% ופתרון יודיקסנול של 10%. באמצעות מזרק ומחט 18 מד, למדוד 1.3 מיליליטר של פתרון 20% iodixanol בזהירות שכבה אותו על גבי שיפוע התחתון.שמור על שפוע המחט במגע עם החלק הפנימי של הצינור, ממש מעל המניסקוס ולהוסיף את הפתרון טיפה חכם, כדי למנוע ערבוב השכבות בממשק הצפיפות. לאחר מכן, שכבה 1.2 מיליליטר של פתרון 10%iodixanol על גבי 20% שכבה, באמצעות אותה טכניקה. בזהירות לאזן ולהעמיס את צינורות אולטרה צנטריפוגה לתוך דליי רוטור.הגדר את מהירויות ההאצה וההאטה של רוטור דלי נדנדה לתעריפים המינימליים, וצנטריפוגה ב 268, 000x g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות. בעוד המדגם הוא להיות צנטריפוגה, תווית 10 1.5 צינורות microcentrifuge מיליליטר עבור כל מדגם שיתאים שברים אחד עד 10 של שיפוע הצפיפות. לאחר השלמת הצנטריפוגה, מוציאים בעדינות את הצינורות מדליי הרוטור ומציבים אותם במחזיק יציב.פיפטה 10 שברים סדרתיים של 490 מיקרוליטרים מהחלק העליון של המילוי לתוך הצינורות המתאימים. באמצעות מד שבירה, למדוד את האינדקסים שבירה של שברים. לאחר מכן, להעביר כל שבר לצינור נקי 12 מיליליטר אולטרהצנטריות.הוסף חמישה מיליליטר של 1x PBS לכל צינור פיפטה למעלה ולמטה לאט לערבב. מוסיפים שישה מיליליטר נוספים של PBS 1x לראש הצינור, ומערבבים בזהירות שוב. Ultracentrifuge הצינורות ב 100, 000x גרם וב ארבע מעלות צלזיוס כדי לסלק מחדש את הווסיקלים הקטנים.דקאנט את supernatant והקש על הצינורות יבשים לפני lysing את הווסיקים לניתוח חלבון או reresuspending כלי רכב חשמליים לניתוח מורפולוגי. כדי lyse כלי רכב חשמליים לניתוח חלבון, להוסיף 40 microliters של חיץ תזה חזקה המכיל מעכב פרוטאז כדורי EV. מניחים פרפילם מעל כל צינור, ומערבולת במרץ.לאחר מכן, לטלטל את הצינורות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ומערבולת שוב. בקצרה צנטריפוגה המדגם ב 1, 000x g במשך 30 עד 60 שניות כדי לשחזר את נפח המדגם כולו. מעבירים כל דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, ומאחסנים אותו בטמפרטורה שבין 20 ל-80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לעיבוד נוסף.כדי להכין את lysates מטוהרים לניתוח immunoblot, להוסיף מאגר מדגם 5x Laemmli לדגימות לריכוז סופי של 1x. מרתיחים את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, טען נפח שווה של שברים אחד עד 10 לתוך ג'ל דף 10%SDS.לטעון מסה שווה של הומוגנית רקמות. בצע אלקטרופורזה וניתוח כתם מערבי כדי לאשר חלבוני EV lysates מטוהרים ולהשוות שפע EV יחסי בשברים. במחקר זה, צמחים חוץ תאיים מופצים ומטוהרים מרקמות שלמות.לאחר אולטרהצנטריפוגה של 10 עד 30% שיפוע יודיקסנול, ניתן לראות אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים קלים נודדים עד שבר שני, בעוד אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים צפופים ניתן לראות נודד עד שבר חמש, בהתאם לסוג הרקמה. immunoblots נציג של שברים הדרגתיים להפגין הפרדה יעילה וטיהור של גידול קטן נגזר כלי רכב חשמליים בשבריר חמש. יש לציין, דגימות גידול ריאות מופיעים מועשרים כלי רכב חשמליים צפופים לעומת כלי רכב חשמליים קלים שנקטפו בעבר מרקמה מוחית שלמה.ניתוח מעקב חלקיקי ננו מייצג ומיקרוסקופ אלקטרונים של וריסקים שמקורם ברקמות בווסיקל השולט המכיל שבר מדגימים את ההעשרה והשימור של וריסקים שלמים. עולה בקנה אחד עם הגודל והמבנה הידועים של כלי רכב חשמליים קטנים. כלי רכב חשמליים Interstitial מייצגים מטרות מבטיחות לפיתוח בדיקות סמן ביולוגי אבחון או פרוגנוסטיות חדשניות.טכניקה זו מספקת לחוקרים כלים לחילוץ וטיהור של וויסיקים עבור השירות במורד הזרם. לאחר החילוץ של כלי רכב חשמליים של רקמות שלמות או lysed, אפיון רחב של ווסיקים כולל ניתוחים פרוטומיים, גנומיים וליפידומיים עשוי להתבצע. בנוסף, ניתן להשתמש בדוגמאות לגישות ממוקדות יותר.סיקלים מבודדים ישירות מדגימות רקמה יכולים לספק תובנה נוספת על מנגנוני המחלה, כולל בראשית הגידול, ועשויים לספק כלים אבחוניים או פרוגנוסטיים חשובים בעתיד.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

הפקה והדמיה של אורגנואידים עכבריים ואפיתל אנושי מרקמת חלב רגילה וגידולית ללא מעבר

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

שיטת העשרה לבועיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

הקמת אורגנואידים ופיברובלסטים מגידולים שמקורם בסרטן הלבלב מרקמה טרייה

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

מיצוי DNA ללא תאים של דגימות הומור זגוגיות ומימיות לאבחון וניטור של לימפומה זגוגית

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...