Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Gli autori ringraziano il Dr. Richard Nowakowski e la Florida State University laboratorio animale risorse per fornire e la cura per gli animali utilizzati per sviluppare questo protocollo, rispettosamente. Ringraziamo Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e il Florida State University traslazionale Science Laboratory per assistenza con il lavoro di spettrometria di massa utilizzato per la caratterizzazione della vescicola a valle, come pure del fondo per la FSU biologico Scienza Imaging Resource l'utilizzo del microscopio elettronico trasmissione in questo studio. Infine, ringraziamo il dottor Mandip Sachdeva (Florida A & M University) per la donazione degli esemplari del tumore utilizzato nello sviluppo di questo metodo. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma di ricerca di la Florida reparto di salute Ed ed Ethel Moore Alzheimer malattia assegnato a d. G.M. e J.M.O (6AZ11) e il National Cancer Institute, del National Institutes of Health, premio numero R01CA204621 assegnato a d. G.M.

Tutto cervelli sono stati ottenuti con approvazione dall'uso animale istituzionale e cura Committee (IACUC) della Florida State University. Un totale di dodici cervelli di topo (3 cervelli da ogni gruppo d'età: 2, 4, 6 e 8 mesi) da un C57BL/6 J sfondo sono stati utilizzati per l'estrazione di EV, come descritto in precedenza16. Esemplari del tumore del polmone sono stati generosamente donati da Dr. Mandip Sachdeva sotto approvazione del Florida agricola e meccanica Università IACUC. Tumori del p...

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	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Interesse molto scientifico è stato generato per quanto riguarda i ruoli che piccoli EVs giocare nel microambiente tumorale, come pure in funzione, la maturazione e lo sviluppo dell'organo. Nel complesso, questo studio fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per l'estrazione del SVE intatti da intero cervello o esemplari del tumore. Mentre qui abbiamo semplicemente dimostrare l'applicabilità di questa tecnica per EVs derivate da tumore del polmone, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per lavoro su altri ...

Piccole vescicole extracellulari (SVE) includono endosomal-derivato esosomi e microvescicole membrana-capannone piccolo di ampio interesse biomedico. Piccoli SVE sono composti da una popolazione eterogenea di vescicole di membrana-limitano nm 50-250 contenenti proteine biologicamente attive, i lipidi e gli acidi nucleici che collettivamente sono creduti per svolgere ruoli importanti in una moltitudine di processi di malattia. Progresso della ricerca è particolarmente implicata queste vescicole in neurodegenerative e malattie da prioni, processi infettivi, condizioni infiammatorie o autoimmuni e la crescita del tumore e metastasi1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ricerca biomedica in rapida crescita del significato di EVs nella patogenesi della malattia ha generato interesse parallela allo sviluppo di metodi riproducibili e rigorosi per l'isolamento e la purificazione di queste vescicole.
Una sfida storica e attuale nella caratterizzazione di EV è stata l'incapacità di separare completamente piccola EV sottopopolazioni. Questa sfida è in gran parte a causa della nostra comprensione limitata dei differenti meccanismi molecolari che regolano la biogenesi delle vescicole distinte. Sovrapposizione di dimensioni, densità e carico biologico tra sottopopolazioni ulteriormente spire queste distinzioni. Parte di questa sfida è stato anche l'uso di diverse tecniche di arricchimento, fornendo un'incoerenza in analisi a valle delle vescicole isolate attraverso laboratori e minare lo sforzo globale per illuminare categorico EV popolazioni ampiamente.
Vale la pena notare che la maggior parte della caratterizzazione EV è stata eseguita da collezione in vitro della coltura delle cellule surnatante, con studi in vivo più recenti che descrivono le tecniche per isolare le vescicole da fluidi corpo umani o animale, tra cui plasma, urina e la saliva. Mentre SVE sono presenti in grandi quantità in circolazione, ha anche riconosciuto che queste vescicole svolgono un ruolo importante negli eventi di comunicazione cellula-cellula e sono presenti nell'interstizio dei tessuti cellulari. Nel contesto di cancro, EVs interstiziale può essere particolarmente importante nella modulazione del microambiente tumorale per la semina delle cellule di cancro e crescita metastatica14,15. Di conseguenza, non c'è valore nello sviluppo e nell'ottimizzazione delle tecniche per estrarre le vescicole da campioni di tessuto solido. Questi metodi fornirà un mezzo per studiare direttamente organo - o tumore - derivato EVs raccolti da campioni clinici, tra cui piccole biopsie e resezioni organo parziale o completo.
In questo studio e in un precedente rapporto pubblicato dal nostro laboratorio16, intendiamo affrontare parecchie preoccupazioni attuali principali nella metodologia di arricchimento EV: 1) per descrivere una tecnica riproducibile per isolare e purificare EVs ai più alti standard attualmente accettato nel campo; 2) per tentare di isolare piccole sottopopolazioni EV altamente arricchite in endosomal-derivato esosomi; e 3) per fornire un protocollo per l'estrazione di queste vescicole da campioni di tessuto solido ai fini di ulteriore caratterizzazione.
Recentemente, Kowal e colleghi descritti una pendenza di densità relativamente piccoli iodixanol per separare e purificare le sottopopolazioni di EV con maggiore efficacia rispetto paragonabile saccarosio densità gradienti17. Nello studio citato, EVs di derivati da cellule dendritiche catturato in una frazione di densità relativamente leggera, coerenza con una densità di 1,1 g/mL, altamente sono stati arricchiti in proteine endosomal credute di essere più coerente con una proporzione elevata degli esosomi presenti in questo frazione. Secondo gli autori, queste proteine "bona fide" exosomal includevano gene di suscettibilità del tumore 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 e diversi annessina proteine17. Più tardi abbiamo adattato questa tecnica per avere successo un metodo di dissociazione del tessuto descritto da Gonzalez Perez et al.18 e un protocollo di successiva centrifugazione differenziale per isolare l'intero cervello-derivato SVE16. Inoltre, abbiamo dimostrato l'utilità di questo metodo nella caratterizzazione dei proteomi EV combinando un protocollo sequenza per la spettrometria di massa a valle quantitativo e comparativo della proteina vescicolare, precedentemente descritta dal nostro laboratorio19. Questo lavoro era equivalente a quello del laboratorio di Hill, in cui SVE sono state arricchite dalla corteccia frontale del cervello20.
In questo studio, abbiamo elaborato su questa tecnica ed estendere l'applicazione del protocollo recentemente pubblicato dal nostro laboratorio all'isolamento del SVE da tumori solidi del polmone. A nostra conoscenza, questo è il primo studio per descrivere un protocollo per arricchire SVE da ex vivo esemplari del tumore. Visto il diffuso interesse verso EVs come nuovi biomarcatori diagnostici e il loro ruolo nella tumorigenesi, questo metodo probabilmente si rivelerà prezioso per un numero crescente di ricercatori scientifici. Da un punto di vista clinico, EVs interstiziale potrebbe porto grande valore diagnostico, in particolare negli esemplari dove la valutazione istologica è limitata. La nostra speranza è che il metodo descritto qui fornirà un fondamento per una tecnica riproducibile raccogliere EVs in freschi o surgelati umani o animali esemplari chirurgici, spianando la strada per il lavoro futuro scoprire i ruoli significativi nella patogenesi della malattia questi piccoli le vescicole possono giocare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Circolante e interstiziale piccole membrana-limita (SVE) vescicole di extracellulare rappresentano un bersaglio promettente per lo sviluppo di saggi di nuovo biomarcatore diagnostico o prognostico e probabilmente servono come giocatori importanti nella progressione di un vasto spettro di malattie. Ricerca corrente è focalizzata sulla caratterizzazione delle vescicole secernuta da cellule multiple e tipi di tessuto al fine di meglio comprendere il ruolo di EVs nella patogenesi di condizioni tra cui neurodegenerazione, infiammazione e cancro. Tuttavia, globalmente coerenti e riproducibili tecniche per isolare e purificare le vescicole rimangono in corso. Inoltre, a malapena vengono descritti metodi per l'estrazione del SVE da tessuto solido ex vivo . Qui, forniamo un protocollo dettagliato per estrarre piccoli EVs di interesse dai tessuti intero freschi o congelati, compreso i campioni del cervello e del tumore, per ulteriore caratterizzazione. Dimostriamo l'adattabilità di questo metodo per analisi multiple a valle, tra cui la microscopia elettronica e immunophenotypic caratterizzazione delle vescicole, così come la spettrometria di massa quantitativa delle proteine di EV.

Nella Figura 1viene visualizzata una descrizione schematica della dissociazione del tessuto, centrifugazione differenziale e gradienti purificazione delle vescicole. Conferma della morfologica e immunophenotypic del gradiente-purificato sve è evidenziata nella Figura 2. Un diagramma di densità riproducibile dopo ultracentrifugazione di pendenza di iodixanol il 10-30% viene mostrato, con due popolazioni distinte della vescicola ...

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Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Questo protocollo fornisce una tecnica rigorosa e riproducibile per l'estrazione e l'isolamento di piccole vescicole extracellulari da campioni di tessuto intero per analisi ex-vivo a valle. Con tra i più alti livelli di purezza attualmente raggiungibili, questo metodo facilita la caratterizzazione morfologica diretta, immunofenotipica e profonda delle vescicole interstiziali secrete in vari campioni di tessuto, compresi i tumori. Qui, dimostriamo l'isolamento dei veicoli elettrici tissutali dagli esemplari di tumore al cervello e ai polmoni.Tuttavia, questa tecnica può essere applicata anche a studi che utilizzano diversi, benigni o altri campioni di tumore. Per iniziare, preparare 10 millilitri di tampone di dissociazione nel mezzo Hibernate-E per ogni 0,4-1,0 grammi di tessuto. Aggiungere il tessuto intero fresco o congelato al tampone in un tubo da 50 millilitri e incubare in un bagno d'acqua calda a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Dopo questo, aggiungere proteasi e inibitori della fosfatasi per una concentrazione finale di 1x nel tampone di dissociazione. Versare la soluzione con il tessuto in un omogeneizzatore di fit down sciolti. Utilizzare circa 30 colpi lenti per campione per dissociare delicatamente il tessuto.Quindi, trasferire il tessuto dissociato e la soluzione tampone in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifuga a 500x g e a quattro gradi celsius per cinque minuti per pellettare le cellule e le fibre rimanenti o frammenti di tessuto coesivi. Trasferire il supernatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri e centrifugare a 2.000x g e a quattro gradi celsius per 10 minuti per pellet e scartare i grandi detriti cellulari.Trasferire questo supernatante in un tubo conico pulito da 50 millilitri e centrifugare a 10,000x g e a quattro gradi celsius per 40 minuti per pellettare eventuali vescicole più grandi indesiderate o piccoli corpi apoptotici. Decantare il supernatante attraverso un filtro da 0,45 micrometri in un tubo di ultracentrifugazione pulito da 12 millilitri. Successivamente, ultracentrifugare il campione a 100,000x g e a quattro gradi celsius per due ore, per pellet piccoli veicoli elettrici.Decantare il supernatante e lasciare i tubi di ultracentrifugazione invertiti per cinque-10 minuti, toccando frequentemente per rimuovere qualsiasi liquido residuo ai lati dei tubi. Quindi, resostigliere il pellet EV in 1,5 millilitri di tampone di saccarosio molare 0,25. Coprire i tubi con Parafilm, quindi vortice i veicoli elettrici in soluzione.Dondolare i tubi ultracentrifugo per 10-15 minuti a temperatura ambiente. E poi il vortice ancora una volta. Centrifugare brevemente i tubi a una velocità inferiore a 1.000x g per recuperare la sospensione liquida nella parte inferiore del tubo.Se necessario, conservare la sospensione a quattro gradi Celsius durante la notte. In primo luogo, aggiungere 1,5 millilitri di iodixanolo al 60%iodixanolo agli 1,5 millilitri del tris tampone di saccarosio che contiene i veicoli elettrici per creare una soluzione finale contenente il 30%iodixanolo. Pipetta su e giù più volte per mescolare accuratamente la soluzione.Trasferire questa soluzione sul fondo di un tubo di ultracentrifugazione da 5,5 millilitri. Quindi, mescolare lo stock di iodixanolo al 60% con acqua ultra pura per preparare almeno 1,5 millilitri sia di una soluzione del 20% che di uno iodixanolo al 10%. Utilizzando una siringa e un ago calibro 18, misurare 1,3 millilitri della soluzione di iodixanolo al 20% e stratificarlo con cura sopra il gradiente inferiore.Tenere la smussatura dell'ago a contatto con l'interno del tubo, appena sopra il menisco e aggiungere la soluzione per evitare di mescolare gli strati all'interfaccia di densità. Quindi, strato 1,2 millilitri della soluzione di iodixanolo al 10% sopra lo strato del 20%, utilizzando la stessa tecnica. Bilanciare e caricare con cura i tubi di ultracentrifugazione in benne del rotore.Impostare le velocità di accelerazione e decelerazione di un rotore a benna oscillante alle velocità minime e centrifugare a 268,000x g e a quattro gradi celsius per 50 minuti. Durante la centrifugazione del campione, etichettare 10 tubi di microcentrifugo da 10 1,5 millilitri per ogni campione che corrisponderanno con frazioni da uno a 10 del gradiente di densità. Una volta completata la centrifugazione, rimuovere delicatamente i tubi dalle benne del rotore e posizionarli in un supporto stabile.Pipetta 10 frazioni seriali di 490 microlitri dalla parte superiore del gradiente nei tubi corrispondenti. Utilizzando un rifrattametro, misurare gli indici di rifrazione delle frazioni. Quindi, trasferire ogni frazione in un tubo di ultracentrifugazione pulito da 12 millilitri.Aggiungere cinque millilitri di 1x PBS a ciascun tubo e pipetta su e giù lentamente per mescolare. Aggiungere altri sei millilitri di 1x PBS alla parte superiore del tubo e mescolare accuratamente di nuovo. Ultracentrifugare i tubi a 100.000x g e a quattro gradi celsius per ri-pellettizzare le piccole vescicole.Decantare il supernatante e toccare i tubi asciutti prima di leccare le vescicole per l'analisi proteica o di rimescolare i veicoli elettrici per l'analisi morfologica. Per lisciviare i veicoli elettrici per l'analisi proteica, aggiungere 40 microlitri di tampone di lisi forte contenente inibitore della proteasi ai pellet EV. Posizionare Parafilm su ogni tubo e vortice vigorosamente.Successivamente, dondolare di nuovo i tubi per 20 minuti a temperatura ambiente e vortice. Centrifugare brevemente il campione a 1.000x g per 30-60 secondi per recuperare l'intero volume del campione. Trasferire ogni campione in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e conservarlo a una temperatura compresa tra 20 e 80 gradi celsius fino a quando non è pronto per un'ulteriore lavorazione.Per preparare i lysati purificati per l'analisi immunoblot, aggiungere 5x Tampone campione di Laemmli ai campioni per una concentrazione finale di 1x. Far bollire il campione a 95 gradi celsius per cinque-10 minuti. Quindi, caricare un volume uguale di frazioni da una a 10 in un gel di pagina 10%SDS.Caricare una massa uguale di omogeneato tissutale. Eseguire l'elettroforesi e l'analisi western della macchia per confermare le proteine EV nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di veicoli elettrici in frazioni. In questo studio, le vescicole extracellulari vengono estratte e purificate da tutto il tessuto.A seguito dell'ultracentrifugazione del gradiente di iodixanolo dal 10 al 30%, si può vedere una popolazione di veicoli elettrici leggeri migrare fino alla frazione due, mentre una popolazione di veicoli elettrici densi può essere vista migrare fino alla frazione cinque, a seconda del tipo di tessuto. Le immunoblot rappresentative delle frazioni gradienti mostrano l'efficiente separazione e purificazione dei piccoli veicoli elettrici derivati dal tumore nella frazione cinque. In particolare, i campioni di tumore al polmone appaiono arricchiti in veicoli elettrici densi rispetto ai veicoli elettrici leggeri precedentemente raccolti da tutto il tessuto cerebrale.L'analisi rappresentativa del tracciamento delle nanoparticelle e la microscopia elettronica delle vescicole derivate dai tessuti nella frazione predominante contenente vescicole dimostrano l'arricchimento e la conservazione di intere vescicole. Coerentemente con le dimensioni e la struttura note dei piccoli veicoli elettrici. I veicoli elettrici interstiziali rappresentano obiettivi promettenti per lo sviluppo di nuovi test diagnostici o prognostici sul biomarcatore.Questa tecnica fornisce ai ricercatori strumenti per l'estrazione e la purificazione delle vescicole per l'utilità a valle. A seguito dell'estrazione di veicoli elettrici a tessuto intero o lysed, può essere eseguita un'ampia caratterizzazione di vescicole, comprese analisi proteomiche, genomiche e lipidomiche. Inoltre, i campioni possono essere utilizzati per approcci più mirati.Le vescicole isolate direttamente dai campioni di tessuto possono fornire ulteriori informazioni sui meccanismi della malattia, compresa la genesi del tumore, e possono fornire importanti strumenti diagnostici o prognostici in futuro.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolamento di vescicole extracellulari arricchite con esosomi che trasportano il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi da cellule staminali embrionali

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generazione e imaging di organoidi epiteliali di topo e umani da tessuto mammario normale e tumorale senza passaggio

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Costituzione di organoidi e fibroblasti tumorali derivati dal cancro del pancreas da tessuto fresco

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Estrazione di DNA senza cellule di campioni di vitreo e umor acqueo per la diagnosi e il monitoraggio del linfoma vitreoretinico

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...