Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

저자는 박사 리처드 Nowakowski와 플로리다 주립 대학 실험실 동물의 리소스를 제공 하 고 정중 하 게이 프로토콜을 개발 하는 데 사용 하는 동물에 대 한 배려 감사 합니다. 우리는 다운스트림 소포 특성 뿐만 아니라 FSU 생물 과학 이미징 리소스 시설 사용 질량 분석 작업과 쌰 Liu, 박사 Rakesh 싱, 그리고 지원에 대 한 플로리다 주립 대학 변환 과학 연구소 감사 이 연구에서 전송 전자 현미경의 사용. 마지막으로, 우리는이 방법의 개발에 사용 되는 종양 견본의 기부에 대 한 박사 Mandip Sachdeva (플로리다 A & M 대학) 감사 합니다. 이 연구는 플로리다 학과의 건강에 드와 델 무어 Alzheimer의 질병 연구 프로그램에서 D.G.M. 및 J.M.O (6AZ11)와 보너스 번호 아래 국립 보건원의 국립 암 연구소 수 여 교부 금에 의해 지원 되었다 R01CA204621 D.G.M.에 게 수 여

전체 두뇌에서 기관 동물 사용 및 관리 위원회 (IACUC) 플로리다 주립 대학교의 승인을 획득 했다. 12 마우스 두뇌의 총 (각 연령 집단에서 두뇌를 3: 2, 4, 6, 및 8 개월) C57BL/6 J에서 배경 앞에서 설명한16EV 추출에 사용 되었다. 폐 종양 표본은 프로 리 다 농업과 기계적인 대학 IACUC의 승인 아래 박사 Mandip Sachdeva에 의해 아낌없이 기부 했다. 폐 종양은 인간의 선 암 세포 선 immunodeficient Ba...

<ol>
	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

많은 과학적인 관심사 작은 EVs 종양 microenvironment 뿐만 아니라 장기 개발, 성숙, 및 기능을 재생 하는 역할에 관하여 생성 되었다. 전반적으로,이 연구 전체 뇌 또는 종양 표본에서 그대로 EVs의 추출에 대 한 최적화 된 워크플로 제공합니다. 여기 단순히 폐 종양에서 파생 된 EVs에이 기술의 적용 시연,이 방법은 쉽게 수 추가의 작은 분 비 소포 ex vivo 특성에 대 한 기회를 제공, 다른 단단한 조직에 대 ...

작은 세포 외 소포 (EVs) endosomal에서 파생 된 exosomes 등의 광범위 한 생물은 작은 막 창 고 microvesicles. 작은 EVs는 이기종 인구의 50-250 nm 막 도약 소포 포함 하는 생물학적으로 활성 단백질, 지질, 그리고 공동으로 다양 한 질병 과정에에서 중요 한 역할을 믿고 핵 산의 구성 됩니다. 특히 신경 프리온 질환, 전염 성 프로세스, 면역 이나 염증, 및 종양 성장 및 전이1,2,3 에이 소포를 연루는 연구 발전 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 빠르게 성장 하는 생물 의학 연구 질병 병 인에서 EVs의 중요성으로 재현 하 고 엄격한 격리와 이러한 vesicles의 정화에 대 한 방법을 개발에 병렬 관심을 생성 했다.
EV 특성에서 역사적이 고 현재 도전 못하는 작은 EV 모집단을 완전히 분리 되었습니다. 이 문제는 주로 통치 별개 소포 속 다른 분자 메커니즘의 우리의 제한 된 이해 예정 이다. 크기, 밀도, 그리고 생물 학적 화물 더 부분 모집단 사이 오버랩이 구분 convolutes. 이 과제의 일부 또한 널리 다른 농축 기술, 실험실, 걸쳐 격리 vesicles의 다운스트림 분석에 불일치를 제공 하 고 범주별 EV 인구를 밝히는 글로벌 노력을 훼손 사용 되었습니다.
그것은 대부분 EV 특성화의 플라스마, 소변을 포함 한 동물이 나 인간의 체액에서 소포를 분리 하는 기법을 설명 하는 더 최근의 vivo에서 연구 표면에 뜨는, 세포 배양의 생체 외에서 컬렉션에서 수행 되었습니다 협조할 그리고 타 액. EVs는 순환에 대량에서 존재, 그것은 또한 이러한 vesicles 셀 통신 이벤트에서 중요 한 역할을 하 고 세포 조직의 interstitium에 인식. 암의 맥락에서 중간 EVs는 특히 암 세포 시드 및 전이성 성장14,15종양 microenvironment 변조에 중요 한 있을 수 있습니다. 따라서, 개발 및 단단한 조직 표본에서 소포를 추출 하는 기술의 최적화 값이입니다. 이러한 방법은 직접 연구 기관-수단을 제공할 것입니다 또는 종양에서 파생 된 EVs 작은 biopsies을 부분 또는 전체 기관 절제술을 포함 하 여 임상 표본에서 수확.
이 연구와 우리의 실험실16출판 이전 보고서 우리는 EV 농축 방법론에서 여러 주요 현재 문제를 해결 하고자: 1) 격리 하 고 현재 수준에 EVs를 정화 재현 기술을 설명 하 필드 확인 허용 작은 EV 모집단 endosomal에서 파생 된 exosomes;에 고도로 농축을 시도 2) 그리고 3) 더 특성을 위해 단단한 조직 표본에서 이러한 vesicles의 추출에 대 한 프로토콜을 제공 하.
최근, Kowal 및 동료 상대적으로 소규모 iodixanol 밀도 그라디언트 분리 및 정화 EV 모집단 비교 자당 밀도 기울기17보다 큰 효능을 설명 합니다. 매우 인용된 연구 수지상 세포 유래 EVs에 상대적으로 가벼운 밀도 분수, 1.1 g/mL의 조밀도와 일치 했다 endosomal 단백질이에 exosomes의 높은 비율로 가장 일관 된 것으로 농축 분수입니다. 저자에 따르면이 "진실한" exosomal 단백질 종양 민감성 유전자 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4, 그리고 여러 annexin 단백질17포함. 우리는 나중에 성공 조직 분리 페레즈 곤잘레스 외18 및 전체 두뇌 파생 EVs16을 후속 차등 원심 분리 프로토콜에서 설명 하는 방법에이 기술을 적응. 우리는 또한 우리의 실험실19설명한 기공을 단백질의 다운스트림 양적 및 비교 질량 분석에 대 한 순차적 프로토콜을 결합 하 여 EV proteomes 특성화에이 방법의 유틸리티를 설명 했다. 이 작품은 EVs 두뇌20담당에서 농축 된 힐 연구소에서 그을 평행 시켰다.
이 연구에서 우리이 기술에 대해 자세히 설명 하 고 최근 우리의 실험실에서 고체 폐 종양에서 EVs의 격리에 게시 하는 프로토콜의 응용 프로그램을 확장. 우리의 지식을 하려면이 ex vivo 종양 표본에서 EVs를 풍부 하 게 하는 프로토콜을 설명 하기 위해 첫 번째 연구 이다. 새로운 진단 바이오 마커 및 tumorigenesis에서 그들의 역할 EVs에 광범위 한 관심을 감안할 때,이 방법은 가능성이 증명 과학 연구원의 성장 수에 중요 한. 임상의 관점에서 중간 EVs 더 평가 제한 됩니다 표본에서 특히 훌륭한 진단 가치를 항구 수 있습니다. 우리의 희망은 여기에 설명 된 방법 신선 또는 냉동 동물 또는 인간 수술 표본, 밝히기 위해서 질병 병 인에 중요 한 역할이 작은 미래의 일에 대 한 방법을 포장에서 EVs를 수확 하는 재현 기법에 대 한 기초를 제공할 것입니다. 소포를 재생할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

순환 및 중간 작은 막 도약 extracellular 소포 (EVs) 새로운 진단 이나 예 후 바이오 마커 분석, 개발을 위한 유망한 목표를 대표 하 고 가능성이 역할의 광범위 한 스펙트럼의 진행에 중요 한 선수 질병입니다. 현재 연구는 여러 세포에서 분 비 소포 특성에 집중 하 고 하기 위해서는 더 나은 조직 종류 조건 neurodegeneration, 염증, 암 등의 병 인에서 EVs의 역할을 이해. 그러나, 세계적으로 일관 되 고 재현 가능한 기술을 분리 하 고 소포를 정화 진행에 남아 있습니다. 또한, ex vivo 단단한 조직에서 EVs의 추출 방법 부족 하 게 설명 합니다. 여기, 우리는 추가 특성에 대 한 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 신선 또는 냉동 조직에서 관심의 작은 EVs를 추출 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 여러 다운스트림 분석, 전자 현미경 검사 법 및 소포의 immunophenotypic 특성 EV 단백질의 양이 많은 질량 분석을 포함 하 여이 방법의 적응성을 설명 합니다.

조직 분리, 차등 원심 분리 및 소포의 그라데이션 정화의 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그라데이션 정화 EVs의 형태 론 적과 immunophenotypic 확인은 그림 2에 강조 표시 됩니다. 재현할 수 밀도의 10-30 %iodixanol 그라데이션 ultracentrifugation 다음 다이어그램 표시 됩니다, 분수 2 (빛 EVs) 및 분수 5 (밀도 EVs), 위쪽으로 마이그레이션 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

이 프로토콜은 다운스트림 전 생체 분석용 전체 조직 표본에서 작은 세포 외 소포를 추출하고 격리하기 위한 엄격하고 재현 가능한 기술을 제공합니다. 현재 달성 가능한 가장 높은 수준의 순도 를 통해,이 방법은 종양을 포함한 다양한 조직 표본으로 분비된 간질 소포의 직접적인 형태, 면역 페노티픽 및 깊은 특성화를 용이하게합니다. 여기에서, 우리는 두뇌와 폐 종양 견본에서 조직 전기의 격리를 보여줍니다.그러나, 이 기술은 다양한, 양성, 또는 그밖 종양 견본을 이용한 연구 결과에또한 적용될 수 있습니다. 시작하려면, 조직의 모든 0.4 ~ 1.0 그램에 대한 최대 절전 모드 -E 배지에서 해리 버퍼의 10 밀리리터를 준비합니다. 50 밀리리터 튜브의 완충제에 전체 신선하거나 냉동 된 조직을 추가하고 20 분 동안 섭씨 37도에서 따뜻한 수조에 배양하십시오.그 후, 해리 버퍼에서 최종 1배 농도에 대한 프로테아제 및 인산 억제제를 추가한다. 티슈로 용액을 느슨한 핏 다운균제로 붓습니다. 시료당 약 30개의 느린 스트로크를 사용하여 조직을 부드럽게 해리시합니다.그런 다음 해리된 조직 및 완충액을 50밀리리터 원판 튜브로 이송합니다. 500x g의 원심분리기와 5분간 섭씨 4도에서 세포와 나머지 섬유 또는 응집력 있는 조직 단편을 펠릿합니다. 상체를 깨끗한 50 밀리리터 원전 튜브로 옮기고 원심분리기를 2, 000x g, 섭씨 4도에서 10분 동안 펠릿과 큰 셀룰러 파편을 폐기합니다.이 상체를 깨끗한 50 밀리리터 원전 튜브로 옮기고 원심분리기를 10, 000x g, 섭씨 40도에서 40분간 전달하여 원치 않는 큰 소포 나 작은 세포 사멸 체를 펠렛합니다. 0.45 마이크로미터 필터를 통해 깨끗한 12 밀리리터 초원심 분리 튜브에 초신수를 증정한다. 다음으로, 초원심분리기 샘플을 100, 000x g및 섭씨 4도에서 2시간 동안, 작은 전기 를 펠릿합니다.상체를 데수제하고 5~10분 동안 반전된 초원심분리관을 두드리고, 튜브 측면에 잔류액체를 제거합니다. 이어서, EV 펠릿을 0.25 의 1.5 밀리리터에서 0.25 어금니 자당 버퍼로 재연한다. 파라필름으로 튜브를 덮은 다음 EV를 용액으로 소용돌이시다.실온에서 10~15분 동안 초원심분리기 튜브를 흔들어 보냅니다. 그리고 다시 한 번 소용돌이. 튜브 의 바닥에 액체 현탁액을 복구하기 위해 1, 000x g 미만의 속도로 튜브를 간략하게 원심 분리합니다.필요한 경우, 하룻밤 4섭씨에 서스펜션을 보관하십시오. 먼저, 전기자동차를 함유한 자당 트리스 버퍼의 1.5 밀리리터에 60%의 iodixanol의 1.5 밀리리터를 추가하여 30%iodixanol을 포함하는 최종 솔루션을 만듭니다. 용액을 완전히 혼합하기 위해 여러 번 파이펫을 위아래로 합니다.이 솔루션을 5.5 밀리리터 초원심분리 튜브의 바닥으로 옮긴다. 다음으로 60%의 iodixanol 스톡을 초순수 수분과 혼합하여 20%와 10%의 iodixanol 용액의 최소 1.5밀리리터를 준비합니다. 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하여 20%의 iodixanol 용액의 1.3 밀리리터를 측정하고 바닥 그라데이션 위에 조심스럽게 레이어링합니다.바늘의 벨이 관 내부와 접촉하여 반월상 연골 바로 위에 있고 밀도 인터페이스에서 층을 혼합하지 않도록 현명하게 해결책을 추가하십시오. 이어서, 동일한 기술을 사용하여 20%층 위에 10%의 iodixanol 용액의 1.2 밀리리터를 층. 극심분리튜브를 로터 버킷에 신중하게 균형있게 조정합니다.스윙 버킷 로터의 가속 및 감속 속도를 최소 속도로 설정하고 원심분리기는 268, 000x g, 섭씨 4도에서 50분 동안 설정합니다. 시료가 원심분리되는 동안, 밀도 그라데이션의 1-10분획에 해당하는 각 샘플에 대해 10 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에 라벨을 부착하십시오. 원심분리가 완료되면 로터 버킷에서 튜브를 부드럽게 제거하고 안정된 홀더에 넣습니다.파이펫 10 해당 튜브로 그라데이션의 상단에서 490 마이크로 리터의 직렬 분수. 굴절계를 사용하여 분수의 굴절률을 측정합니다. 그런 다음 각 분획을 깨끗한 12 밀리리터 초원심분리 튜브로 옮긴다.각 튜브에 1x PBS의 5밀리리터를 넣고 천천히 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 튜브 상단에 1x PBS의 6 밀리리터를 추가하고 조심스럽게 다시 섞습니다. 초원심분리기튜브는 100, 000x g, 섭씨 4도에서 작은 소포를 다시 펠릿합니다.상체를 데칭하고 단백질 분석을 위해 소포를 용해하거나 변성 분석을 위해 전기를 다시 중단하기 전에 튜브를 건조하게 누릅니다. 단백질 분석을 위해 EV를 lyse하려면 EV 펠릿에 프로테아제 억제제가 함유된 강력한 용해 완충제 40마이크로리터를 추가합니다. 각 튜브 위에 파라필름을 놓고 소용돌이를 적극적으로 배치합니다.다음으로, 실내 온도와 소용돌이에서 20 분 동안 튜브를 다시 흔들어. 샘플을 1, 000x g에서 30~60초 동안 간략하게 원심분리하여 전체 샘플 부피를 회수합니다. 각 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 추가 처리를 위해 준비될 때까지 섭씨 20~80도 사이의 온도에 보관하십시오.면역블롯 분석을 위해 정제된 용액을 준비하려면 5x Laemmli 샘플 버퍼를 샘플에 추가하여 최종 농도를 1배 나늘게 합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 5~10분간 끓입니다. 그런 다음 10% SDS 페이지 젤에 1-10의 동일한 분획을 로드합니다.동일한 양의 조직 동종을 로드합니다. 전기 전도 및 서양 얼룩 분석을 수행하여 정제 된 용해에서 EV 단백질을 확인하고 상대 적인 EV 풍부를 분수로 비교합니다. 이 연구에서는 세포 외 소포를 추출하고 전체 조직에서 정제됩니다.10~30%의 극심분리에 이어, 광전기자동차의 인구가 2분까지 이동하는 것을 볼 수 있으며, 조밀한 전기자동차의 집단은 조직 유형에 따라 최대 5개로 이동하는 것을 볼 수 있다. 그라데이션 분획의 대표적인 면역블롯은 작은 종양 유래 EV의 효율적인 분리 및 정제를 5분5로 나타낸다. 특히, 폐 종양 표본은 이전에 전체 뇌 조직에서 수확 한 빛 전기에 비해 조밀 한 전기 에 풍부 나타납니다.분획을 함유하는 우세한 소포에서 조직 유래 소포의 대표적인 나노 입자 추적 분석 및 전자 현미경 검사는 전체 소포의 농축 및 보존을 입증한다. 작은 EV의 알려진 크기와 구조와 일치합니다. 간질 전기 는 새로운 진단 또는 예후 바이오 마커 분석의 개발을위한 유망한 목표를 나타냅니다.이 기술은 연구원에게 다운스트림 유틸리티용 소포의 추출 및 정제를 위한 도구를 제공합니다. 전체 또는 lysed 조직 전기 의 추출 에 따라, 프로 테오믹을 포함 하 여 소포의 광범위 한 특성화, 유 전체, 그리고 lipidomic 분석 수행 될 수 있습니다. 또한 샘플은 더 많은 표적 접근 에 사용될 수 있습니다.조직 견본에서 직접 분리된 소포는 종양 창세기를 포함하여 질병 기계장치에 추가 통찰력을 제공할 수 있고, 미래에 중요한 진단 또는 예후 공구를 제공할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

연구

암 연구학

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

유리체 망막 림프종의 진단 및 모니터링을 위한 유리체 및 수성 체액 검체의 Cell-Free DNA 추출

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...