Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Richard Nowakowski og Florida State University laboratorium dyr ressurser gir og omsorg for dyr som brukes til å utvikle denne protokollen, ærbødig. Vi takker Xia Liu, Dr. Rakesh Singh og Florida State University translasjonsforskning Science laboratorium for hjelp med massespektrometri arbeidet brukes for nedstrøms vesicle karakterisering, samt FSU biologisk vitenskap tenkelig ressurs anlegg for bruken av elektronmikroskop overføring i denne studien. Til slutt, vi takker Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) for donasjon av svulst prøver brukes i utviklingen av denne metoden. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Florida Department of Health Ed og Ethel Moore Alzheimers sykdom Research Program til D.G.M. og J.M.O (6AZ11) og National Cancer Institute av National Institutes of Health Award nummer R01CA204621 til D.G.M.

Hele hjernen ble innhentet med godkjenning fra institusjonelle dyr bruk og omsorg Committee (IACUC) i Florida State University. Totalt tolv musen hjerner (3 hjernen fra hver aldersgruppe: 2, 4, 6 og 8 måneder) fra en C57BL/6 J bakgrunnen ble brukt for EV utvinning, som beskrevet tidligere16. Lunge svulst eksemplarer ble sjenerøst donert av Dr. Mandip Sachdeva under godkjenning av Florida landbruket og mekanisk University IACUC. Lunge svulst var avledet fra menneskelige adenocarcinoma cellen linj...

<ol>
	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Mye vitenskapelig interesse er generert med hensyn til rollene liten EVs spiller i svulst microenvironment og orgel utvikling, modning og funksjon. Total, denne studien gir en optimalisert arbeidsflyt for utvinning av intakt EVs fra hele hjernen eller svulst prøver. Mens her viser vi bare anvendelse av denne teknikken til lunge svulst-avledet EVs, kan denne metoden lett tilpasses for arbeid på andre solid vev, gir muligheter for ytterligere ex vivo karakteristikk av små utskilles blemmer av bred biomedisinsk interesse...

Små ekstracellulære blemmer (EVs) inkluderer endosomal-avledet exosomes og små membran-skur microvesicles av bred biomedisinsk interesse. Liten EVs består av en heterogen befolkning av 50-250 nm membran-bundet blemmer som inneholder biologisk aktive proteiner og lipider nukleinsyrer som kollektivt spille en viktig rolle i et mangfold av sykdom prosesser. Fremme forskning har spesielt innblandet disse vesikler i nevrodegenerative og prion sykdommer, smittsomme prosesser, autoimmune eller inflammatorisk forhold, og tumor vekst og metastasering1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. raskt voksende biomedisinsk forskning inn i betydningen av EVs i sykdom patogenesen har generert parallelle interesse i å utvikle reproduserbare og strenge metoder for isolasjon og rensing av disse vesikler.
Historiske og dagens utfordring i EV karakterisering har vært manglende evne å fullt skille små EV subpopulasjoner. Denne utfordringen er vår begrensede forståelse av de ulike molekylære mekanismene som styrer biogenesis av forskjellige blemmer. Overlappende størrelse, tetthet og biologiske Last mellom subpopulasjoner ytterligere convolutes disse forskjellene. En del av denne utfordringen har også vært bruken av mye forskjellig berikelse teknikker, gir inkonsekvens i nedstrøms analyse av isolerte blemmer over laboratorier og undergrave global innsats for å belyse kategoriske EV populasjoner.
Det er verdt å merke seg at fleste EV karakteristikk er utført fra i vitro samling av cellekultur supernatant, med nyere i vivo studier som beskriver teknikker for å isolere blemmer fra dyr eller human kroppsvæsker, inkludert plasma, urin , og spytt. Mens EVs finnes i store mengder i omløp, anerkjent det også at disse vesikler spille en viktig rolle i celle til celle kommunikasjon arrangementer og i interstitium av mobilnettet vev. I forbindelse med kreft være interstitiell EVs spesielt viktig i modulerende svulst microenvironment for kreftcelle såing og metastatisk vekst14,15. Derfor er det verdi i utvikling og optimalisering av teknikker for å trekke ut blemmer fra solid vevsprøver. Disse metodene vil gi et middel til å direkte studere orgel - eller svulst - avledet EVs høstet fra klinisk eksemplarer, inkludert små biopsier og delvis eller full organ resections.
I denne studien, og i en tidligere rapport utgitt av vårt laboratorium16, vi rettet mot flere store gjeldende bekymringer i EV berikelse metodikk: 1) å beskrive en reproduserbar teknikk for å isolere og rense EVs til de høyeste standardene for øyeblikket akseptert i feltet. 2) å forsøke å isolere liten EV subpopulasjoner høyanriket i endosomal-avledet exosomes; og 3) å gi en protokoll for utvinning av disse vesikler fra solid vevsprøver for ytterligere karakterisering.
Nylig beskrevet Kowal og kolleger en relativt mindre iodixanol tetthet gradert å skille og rense EV subpopulasjoner med større effekt enn sammenlignbare sukrose tetthet forløpninger17. I den siterte studien, var dendrittiske celle-avledet EVs fanget i en relativt lett tetthet brøk, samsvarer med en tetthet på 1,1 g/mL, svært beriket i endosomal proteiner antas å være mest konsistente med en høy andel exosomes i dette brøk. Ifølge forfatterne inkludert disse "bona fide" exosomal proteiner svulst mottakelighet genet 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 og flere annexin proteiner17. Vi tilpasset senere denne teknikken for å lykkes en metode for vev dissosiasjon beskrevet av Perez-Gonzalez et al18 og en påfølgende differensial sentrifugering protokoll isolere hele hjerne-avledet EVs16. Vi viste også nytten av denne metoden i karakteriserer EV proteomes ved å kombinere en sekvensiell protokoll for nedstrøms kvantitative og komparativ massespektrometri vesicula protein, tidligere beskrevet av vårt laboratorium19. Dette arbeidet paralleller som fra Hill laboratoriet, der EVs ble beriket fra frontal cortex av hjernen20.
I denne studien vi utdype denne teknikken og utvide bruken av protokollen nylig publisert fra vårt laboratorium i isolasjon av EVs fra solid lunge svulst. Vi vet er dette den første studien å beskrive en protokoll for å berike EVs fra ex vivo svulst prøver. Gitt den utbredte interessen EVs som roman diagnostiske biomarkers og deres rolle i tumorigenesis, vil denne metoden trolig være verdifulle for et økende antall forskere. Fra en klinisk perspektiv, kan interstitiell EVs havn stor diagnostiske verdi, spesielt i prøver der histologic evaluering er begrenset. Vårt håp er at metoden skissert her vil gi grunnlag for en reproduserbar metode å høste EVs fra friske eller frosne dyr eller human kirurgisk prøver, banet vei for fremtiden å avdekke den betydelige roller i sykdom patogenesen disse små blemmer kan spille.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Sirkulerende og interstitiell små membran-bundet ekstracellulære blemmer (EVs) representerer lovende mål for utviklingen av romanen diagnostiske eller prognostiske biomarkør analyser, og trolig tjene som viktige spillere i utviklingen av et stort spekter av sykdommer. Nåværende forskning fokuserer på karakterisering av blemmer skilles ut fra flere celle og vev typer for å bedre forstå EVs rolle i patogenesen av inkludert neurodegeneration, betennelse og kreft. Imidlertid fortsatt globalt konsistent og reproduserbar teknikker å isolere og rense blemmer pågår. Videre beskrives metoder for utvinning av EVs fra solid vev ex vivo knapt. Her gir vi en detaljert protokoll for å trekke ut små EVs rundt fra helt friske eller frosne vev, inkludert hjernen og tumor eksemplarer, for ytterligere karakterisering. Viser vi tilpasningsevne denne metoden for flere nedstrøms analyser, inkludert elektronmikroskop og immunophenotypic karakteristikk av blemmer og kvantitative massespektrometri EV proteiner.

En skjematisk oversikt av vev dissosiasjon, differensial sentrifugering og gradient rensing av blemmer vises i figur 1. Morfologiske og immunophenotypic bekreftelse av forløpning-renset EVs utheves i figur 2. Et diagram av reproduserbar tettheter etter ultracentrifugation på 10-30% iodixanol graderingen vises, med to forskjellige vesicle bestander migrere oppover til del 2 (lett EVs) og del 5 (tett EVs), avhengig av vev type. R...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av ekstracellulære blemmer fra hele vev

Her gir vi en detaljert protokoll for å isolere små ekstracellulære blemmer (EVs) fra hele vev, inkludert hjernen og tumor prøver. Denne metoden gir en reproduserbar teknikk for å trekke ut EVs fra solid vev for videre nedstrøms analyser.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Denne protokollen gir en streng og reproduserbar teknikk for ekstraksjon og isolering av små ekstracellulære vesikler fra hele vevsprøver for nedstrøms ex-vivo analyser. Med blant de høyeste nivåene av renhet som for tiden er oppnåelig, letter denne metoden direkte morfologisk, immunofenotypisk og dyp karakterisering av interstitielle vesikler utskilles i ulike vevsprøver, inkludert svulster. Her demonstrerer vi isolering av vev-EV-er fra hjerne- og lungesvulstprøver.Denne teknikken kan imidlertid brukes på studier ved hjelp av ulike, godartede eller andre tumorprøver også. Til å begynne, forberede 10 milliliter dissosiasjon buffer i dvale-E medium for hver 0,4 til 1,0 gram vev. Tilsett hele ferskt eller frosset vev til bufferen i et 50 milliliter rør, og inkuber i et varmt vannbad ved 37 grader celsius i 20 minutter.Etter dette legger protease og fosfatasehemmere for en endelig 1x konsentrasjon i dissosiasjonsbufferen. Hell løsningen med vevet i en løs passform downs homogenisator. Bruk ca 30 langsomme slag per prøve for å forsiktig dissosiere vevet.Deretter overfører du det dissosierte vevet og bufferløsningen til et 50 milliliter konisk rør. Sentrifuge ved 500x g og ved fire grader celsius i fem minutter for å pellet cellene og de resterende fibrene eller sammenhengende vevfragmenter. Overfør supernatanten til et rent konisk rør på 50 milliliter, og sentrifuge ved 2, 000x g og ved fire grader celsius i 10 minutter for å pellet og kaste de store cellulære ruskene.Overfør denne supernatanten til et rent 50 milliliter konisk rør, og sentrifuge ved 10, 000x g og ved fire grader celsius i 40 minutter for å pellet noen uønskede større vesikler eller små apoptotiske legemer. Dekanter supernatanten gjennom et 0,45 mikrometerfilter til et rent 12 milliliter ultracentrifugation tube. Deretter ultracentrifuge prøven på 100, 000x g og ved fire grader celsius i to timer, til pellet små EV.Dekanter det overnaturlige og la ultracentrifugation rørene invertert i fem til 10 minutter, tappe ofte for å fjerne eventuelle gjenværende væske på sidene av rørene. Deretter bruker ev pellet i 1,5 milliliter med 0,25 molar sukrose buffer. Dekk rørene med Parafilm, og virvle deretter EV-ene i løsningen.Rock ultracentrifuge rørene i 10 til 15 minutter ved romtemperatur. Og så vortex igjen. Sentrifuger rørene med en hastighet på mindre enn 1 000 x g for å gjenopprette væskefjæringen nederst på røret.Oppbevar om nødvendig suspensjonen ved fire grader celsius over natten. Først legger du til 1,5 milliliter med 60 % iodixanol til 1,5 milliliter av sukrosetribufferen som inneholder EV-ene for å lage en endelig løsning som inneholder 30 % iodixanol. Pipetten opp og ned flere ganger for å blande oppløsningen grundig.Overfør denne løsningen til bunnen av et 5,5 milliliter ultracentrifugation tube. Bland deretter 60% iodixanol lager med ultra rent vann for å forberede minst 1,5 milliliter av både en 20%og en 10% iodixanol løsning. Bruk en sprøyte og en 18 gauge nål, måle 1,3 milliliter av 20% iodixanol løsning og forsiktig lag den på toppen av den nederste gradienten.Hold nålens skråkant i kontakt med innsiden av røret, like over menisken og legg til løsningsdråpen klokt for å unngå å blande lagene på tetthetsgrensesnittet. Deretter lag 1,2 milliliter av 10% iodixanol-løsningen på toppen av 20%-laget, ved hjelp av samme teknikk. Balanser forsiktig og last ultracentrifugation rørene i rotorbøtter.Sett akselerasjons- og retardasjonshastighetene til en svingbøtterotor til minimumshastighetene, og sentrifuge ved 268, 000x g og ved fire grader celsius i 50 minutter. Mens prøven blir sentrifugert, etikett 10 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør for hver prøve som vil korrespondere med fraksjoner en til 10 av tetthet gradient. Når sentrifugeringen er fullført, fjern forsiktig rørene fra rotorbøttene og legg dem i en stabil holder.Pipette 10 seriefraksjoner på 490 mikroliter fra toppen av gradienten til de tilsvarende rørene. Ved hjelp av et refraktometer, mål brytningsindeksene til brøkene. Deretter overfører du hver brøkdel til et rent 12 milliliter ultracentrifugation tube.Tilsett fem milliliter 1x PBS til hvert rør og pipette opp og ned sakte for å blande. Tilsett ytterligere seks milliliter 1x PBS til toppen av røret, og bland forsiktig igjen. Ultracentrifuge rørene på 100, 000x g og ved fire grader celsius å re-pellet de små vesikler.Dekanter de overnaturante og bank rørene tørre før lysing vesikler for proteinanalyse eller reresuspending EVs for morfologisk analyse. For å lyse EV-ene for proteinanalyse, tilsett 40 mikroliter med sterk lysisbuffer som inneholder proteasehemmer til EV pellets. Plasser Parafilm over hvert rør, og vortex kraftig.Deretter rocke rørene i 20 minutter ved romtemperatur og virvel igjen. Sentrifuger prøven med 1, 000 x g i 30 til 60 sekunder for å gjenopprette hele prøvevolumet. Overfør hver prøve til et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og oppbevar den ved en temperatur mellom 20 og 80 grader celsius til den er klar for videre behandling.For å forberede rensede lysater for immunoblotanalyse, tilsett 5x Laemmli prøvebuffer til prøvene for en endelig konsentrasjon på 1x. Kok prøven ved 95 grader celsius i fem til 10 minutter. Deretter legger du inn et likt volum av brøker en til 10 i en 10% SDS sidegel.Last en lik masse vev homogenate. Utfør elektroforese og western blot analyse for å bekrefte EV proteiner i renset lysates og sammenligne relativ EV overflod i fraksjoner. I denne studien ekstracellulære vesikler ekstraheres og renses fra hele vevet.Etter ultracentrifugation av 10 til 30% iodixanol gradient, en populasjon av lys EV kan sees migrere opp til brøkdel to, mens en populasjon av tette EV kan sees migrere opp til brøkdel fem, avhengig av vevstype. Representative immunoblots av gradientfraksjonene viser effektiv separasjon og rensing av små tumoravledede EV-er i brøkdel fem. Spesielt, lungesvulstprøver vises beriket i tette EV-er sammenlignet med lette EV-er som tidligere ble høstet fra hele hjernevevet.Representativ nanopartikkelsporingsanalyse og elektronmikroskopi av vevsavledede vesikler i den dominerende vesikkelen som inneholder fraksjon, viser berikelse og bevaring av hele vesikler. I samsvar med den kjente størrelsen og strukturen til små EV-er. Interstitielle EV-er representerer lovende mål for utvikling av nye diagnostiske eller prognostiske biomarkøranalyser.Denne teknikken gir forskere verktøy for utvinning og rensing av vesikler for nedstrøms nytte. Etter ekstraksjon av hele eller lysed vev EVs, bred karakterisering av vesikler inkludert proteomiske, genomiske, og lipidomiske analyser kan utføres. I tillegg kan prøver brukes til mer målrettede tilnærminger.Vesikler isolert direkte fra vevsprøver kan gi ytterligere innsikt i sykdomsmekanismer, inkludert tumorgenese, og kan gi viktige diagnostiske eller prognostiske verktøy i fremtiden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Nøytrofile ekstracellulære feller generert av lav tetthet nøytrofile innhentet fra Peritoneal Lavage væske megle svulst cellevekst og vedlegg

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studere normal tissue stråling virkninger benytter ekstracellulære matrise Hydrogeler

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Ekstraksjon av vandig metabolitter fra kultivert tilhenger Cells for Metabolomic analyse av kapillær elektroforese-Mass massespektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering av exosome-beriket ekstracellulære vesikler som bærer granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor fra embryonale stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funksjonell vurdering av humane brystkreftstamceller fra celle- og vevsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenisitet Screening av tumor-avledede ekstracellulære vesicles av Flow Cytometry av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generering og avbildning av mus og humane epitelorganoider fra normalt og tumorbrystvev uten å passere

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

En anrikningsmetode for små ekstracellulære vesikler avledet fra leverkreftvev

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Etablering av kreftavledede tumororganoider og fibroblaster fra friskt vev

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Cellefri DNA-ekstraksjon av glassaktige og vandige humorprøver for diagnostisering og overvåking av vitreoretinalt lymfom

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...