Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
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Os autores Obrigado Dr. Richard Nowakowski e os recursos da Flórida estado Universidade laboratório Animal para fornecer e cuidando de animais utilizados para desenvolver este protocolo, respeitosamente. Agradecemos a Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e o Florida estado Universidade translacional Science Laboratory para assistência com o trabalho de espectrometria de massa utilizado para caracterização de vesículas a jusante, bem como a facilidade de FSU biológica ciência Imaging Resource para o uso do microscópio eletrônico de transmissão neste estudo. Finalmente, agradecemos o Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pela doação dos espécimes tumor utilizada no desenvolvimento deste método. Este estudo foi suportado por concessões do departamento de Florida de saúde Ed e Ethel Moore Alzheimer programa de pesquisa de doença atribuído a D.G.M. e J.M.O (6AZ11) e o National Cancer Institute dos National Institutes of Health, sob número de prêmio R01CA204621 atribuído a D.G.M.

Todo cérebro foram obtido com a aprovação do uso institucional do Animal e cuidados Comissão (IACUC) da Universidade do estado da Flórida. Um total de doze cérebro de rato (3 cérebros de cada grupo de idade: 2, 4, 6 e 8 meses) de um J C57BL/6 fundo foram usadas para a extração de EV, como descrito anteriormente,16. Amostras de tumor de pulmão foram generosamente doadas pelo Dr. Mandip Sachdeva sob aprovação da Flórida agrícola e mecânica IACUC Universidade. Tumores de pulmão foram ...

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	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Gerou-se interesse muito científico com relação os papéis que pequenos EVs jogar o microambiente do tumor, bem como na função, maturação e desenvolvimento do órgão. Em geral, este estudo fornece um fluxo de trabalho otimizado para a extração de EVs intactas de todo o cérebro ou espécimes do tumor. Enquanto aqui estamos simplesmente demonstrar a aplicabilidade desta técnica para EVs derivado de tumor de pulmão, esse método poderia facilmente ser adaptado para trabalhar em outros tecidos sólidos, proporci...

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) incluem CDDP-derivado exosomes e pequenas aumentada de membrana-galpão de amplo interesse biomédico. EVs pequenas são compostas por uma população heterogénea das vesículas de membrana-limite nm 50-250 contendo proteínas biologicamente activas, lípidos e ácidos nucleicos que coletivamente são acreditados para desempenhar um papel importante em uma infinidade de processos da doença. Fazer avançar a pesquisa implicou particularmente essas vesículas em neurodegenerativas e doenças de príon, processos infecciosos, condições auto-imunes ou inflamatórias e crescimento do tumor e metástases1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. crescendo rapidamente a investigação biomédica para a importância do EVs na patogênese da doença gerou interesse paralelo no desenvolvimento de métodos reprodutíveis e rigorosos para o isolamento e purificação dessas vesículas.
Um desafio histórico e atual na caracterização de EV tem sido a incapacidade de se separar totalmente pequenas subpopulações de EV. Este desafio é em grande parte devido à nossa compreensão limitada dos diferentes mecanismos moleculares que regem a biogênese de vesículas distintas. Sobreposição de tamanho, densidade e carga biológica entre subpopulações mais convolutes essas distinções. Parte desse desafio também tem sido a utilização de diferentes técnicas de enriquecimento, fornecendo inconsistência na análise a jusante das vesículas isoladas em laboratórios e minar o esforço global para iluminar categórica EV populações amplamente.
É interessante notar que a maioria dos EV caracterização foi realizada de coleção in vitro de cultura celular sobrenadante, com os mais recentes estudos in vivo, descrevendo técnicas para isolar vesículas de fluidos do corpo humanos ou animais, incluindo plasma, urina e saliva. Enquanto EVs estão presentes em grandes quantidades em circulação, é também reconhecer que essas vesículas desempenham um papel importante em eventos de comunicação célula a célula e estão presentes no interstício dos tecidos celulares. No contexto do câncer, EVs intersticiais podem ser particularmente importantes na modulação do microambiente do tumor para a célula cancerosa semeadura e crescimento metastático14,15. Consequentemente, há valor no desenvolvimento e otimização de técnicas para extrair vesículas de amostras sólidas. Estes métodos irão fornecer um meio para estudar diretamente órgão - ou tumor derivado de EVs colhidas amostras clínicas, incluindo pequenas biópsias e ressecções parciais ou totais do órgão.
Neste estudo e em um relatório anterior, publicado pelo nosso laboratório16, pretendemos abordar vários grandes preocupações atuais na metodologia de enriquecimento de EV: 1) para descrever uma técnica reprodutível para isolar e purificar EVs para os mais altos padrões atualmente aceitos no campo; 2) a tentativa de isolar pequenas subpopulações de EV altamente enriquecidas em CDDP-derivado exosomes; e 3) para fornecer um protocolo para a extração destas vesículas de espécimes de tecido sólido com a finalidade de caracterização mais.
Recentemente, Kowal e colegas descreveram um gradiente de densidade relativamente pequena escala iodixanol para separar e purificar EV subpopulações com maior eficácia do que a sacarose comparáveis de gradientes de densidade17. No estudo citado, EVs derivado de células dendríticas, capturados em uma fração de densidade relativamente leve, consistente com uma densidade de 1,1 g/mL, foram altamente enriquecidos em proteínas CDDP, acreditadas-se ser mais consistente com uma alta proporção de exosomes presentes neste fração. De acordo com os autores, estas proteínas "bona fide" exosomal incluíam gene de susceptibilidade de tumor 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 e várias annexin proteínas17. Mais tarde, adaptamos essa técnica para conseguir um método de dissociação de tecido descrito por Perez-Gonzalez et al18 e um protocolo de centrifugação diferencial subsequente para isolar todo derivado do cérebro EVs16. Nós também demonstrou a utilidade desse método em caracterizando EV proteomes combinando um protocolo sequencial para jusante quantitativa e comparativa espectrometria de massa de proteína vesicular, anteriormente descrita por nosso laboratório19. Este trabalho que paralelo do laboratório da colina, em que EVs foram enriquecidos do córtex frontal do cérebro de20.
Neste estudo, podemos elaborar sobre esta técnica e alargar a aplicação do protocolo recentemente publicado de nosso laboratório ao isolamento de EVs de tumores de pulmão sólido. A nosso conhecimento, este é o primeiro estudo para descrever um protocolo para enriquecer EVs de ex vivo espécimes de tumor. Dado o interesse generalizado em EVs como novos biomarcadores de diagnósticos e seu papel na tumorigênese, esse método provavelmente irá ser valioso para um número crescente de pesquisadores científicos. Do ponto de vista clínica, EVs intersticiais poderiam abrigar grande valor diagnóstico, particularmente em espécimes onde a avaliação histológica é limitada. Nossa esperança é que o método descrito aqui irá fornecer uma base para uma técnica reprodutível a colheita EVs de frescos ou congelados humanas ou animais cirúrgicos espécimes, pavimentando o caminho para o futuro trabalho descobrir os papéis importantes na patogênese da doença estes pequenos vesículas podem jogar.

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	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Circulantes e intersticiais pequenas membrana-limite extracelulares vesículas (EVs) representam alvos promissores para o desenvolvimento de ensaios de romance biomarcador de diagnóstico ou prognóstico e provavelmente servem como jogadores importantes na progressão de um vasto espectro de doenças. A pesquisa atual está focada na caracterização das vesículas secretada de várias células e tipos de tecido para melhor entendem o papel do EVs na patogênese das condições incluindo neurodegeneração, inflamação e câncer. No entanto, técnicas globalmente consistentes e reproduzíveis para isolar e purificar vesículas permanecem em andamento. Além disso, métodos para extração de EVs de tecido sólido ex vivo são raramente descritos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para extrair pequenas EVs de interesse de tecidos inteiros frescos ou congelados, incluindo amostras de cérebro e tumor, para caracterização mais. Vamos demonstrar a capacidade de adaptação desse método para múltiplas análises a jusante, incluindo microscopia eletrônica e caracterização imunofenotípica das vesículas, bem como, a espectrometria de massa quantitativa de proteínas EV.

Uma visão esquemática da dissociação de tecido, centrifugação diferencial e gradiente purificação das vesículas é exibida na Figura 1. Morfológica e imunofenotípica confirmação da gradiente-purificado EVs é destacada na Figura 2. Um diagrama de densidades pode ser reproduzidos após ultracentrifugação do gradiente iodixanol 10-30% é mostrado, com duas populações distintas de vesículas migrando para cima a fra...

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Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extração de vesículas extracelulares de todo tecido

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para isolar pequenas vesículas extracelulares (EVs) de tecidos, incluindo amostras de cérebro e tumor. Este método oferece uma técnica reprodutível para extrair EVs do tecido sólido para mais análises a jusante.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Este protocolo fornece uma técnica rigorosa e reprodutível para extração e isolamento de pequenas vesículas extracelulares de amostras de tecido inteiro para análises ex-vivo a jusante. Com entre os mais altos níveis de pureza atualmente alcançáveis, este método facilita a morfológica direta, imunofenópica e caracterização profunda de vesículas intersticiais secretadas em vários espécimes teciduais, incluindo tumores. Aqui, demonstramos o isolamento de EVs teciduais de amostras de tumores cerebrais e pulmonares.No entanto, essa técnica também pode ser aplicada a estudos utilizando amostras de tumores diversos, benignos ou outros tumores. Para começar, prepare 10 mililitros de tampão de dissociação no meio Hibernar-E para cada 0,4 a 1,0 grama de tecido. Adicione tecido fresco ou congelado inteiro ao tampão em um tubo de 50 mililitros e incubar em um banho de água morna a 37 graus celsius por 20 minutos.Depois disso, adicione inibidores de protease e fosfatase para uma concentração final de 1x no tampão de dissociação. Despeje a solução com o tecido em um homogeneizador de encaixe solto. Use aproximadamente 30 golpes lentos por amostra para dissociar suavemente o tecido.Em seguida, transfira o tecido dissociado e a solução tampão para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a 500x g e a quatro graus celsius por cinco minutos para pelotar as células e as fibras restantes ou fragmentos de tecido coeso. Transfira o supernante para um tubo cônico limpo de 50 mililitros, e centrífuga a 2.000x g e a quatro graus celsius por 10 minutos para pelotas e descarte os grandes detritos celulares.Transfira este supernante para um tubo cônico limpo de 50 mililitros, e centrífuga a 10.000x g e a quatro graus celsius por 40 minutos para cápsular quaisquer vesículas maiores indesejadas ou pequenos corpos apoptóticos. Decante o supernatante através de um filtro de 0,45 micrômetros em um tubo de ultracentrifugação de 12 mililitros limpo. Em seguida, ultracentrifuuge a amostra a 100.000x g e a quatro graus celsius por duas horas, para pelotar pequenos EVs.Decante o supernasce e deixe os tubos de ultracentrifugação invertidos por cinco a 10 minutos, tocando frequentemente para remover qualquer líquido residual nas laterais dos tubos. Em seguida, resuspense a pelota EV em 1,5 mililitros de 0,25 tampão de sacarose molar. Cubra os tubos com Parafilm e, em seguida, vórtice dos EVs em solução.Balance os tubos de ultracentrifuagem por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. E então vórtice mais uma vez. Centrifufique brevemente os tubos a uma velocidade inferior a 1.000x g para recuperar a suspensão líquida na parte inferior do tubo.Se necessário, armazene a suspensão a 4 graus celsius durante a noite. Primeiro, adicione 1,5 mililitros de 60% iodixanol aos 1,5 mililitros do tampão tris de sacarose que contém os EVs para criar uma solução final contendo 30% de iodixanol. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar a solução completamente.Transfira esta solução para a parte inferior de um tubo de ultracentrifugação de 5,5 mililitros. Em seguida, misture o estoque de 60% iodixanol com água ultra pura para preparar pelo menos 1,5 mililitros de uma solução de 20% e 10% iodixanol. Usando uma seringa e uma agulha de calibre 18, meça 1,3 mililitros da solução de 20% iodixanol e coloque-a cuidadosamente em camadas em cima do gradiente inferior.Mantenha o chanfrado da agulha em contato com o interior do tubo, logo acima do menisco e adicione a solução de gota sábia para evitar misturar as camadas na interface de densidade. Em seguida, camada 1.2 mililitros da solução 10% iodixanol em cima da camada de 20%, usando a mesma técnica. Equilibre cuidadosamente e carregue os tubos de ultracentrifugação em baldes de rotor.Defina as velocidades de aceleração e desaceleração de um rotor de balde de balanço para as taxas mínimas, e centrífuga em 268,000x g e a quatro graus celsius por 50 minutos. Enquanto a amostra está sendo centrifugada, rotule 10 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada amostra que corresponderá com frações de um a 10 do gradiente de densidade. Uma vez que a centrifugação esteja completa, remova suavemente os tubos dos baldes do rotor e coloque-os em um suporte estável.Pipeta 10 frações seriais de 490 microliters do topo do gradiente para os tubos correspondentes. Utilizando um refratômetro, meça os índices refrativos das frações. Em seguida, transfira cada fração para um tubo de ultracentrifugação de 12 mililitros limpo.Adicione cinco mililitros de 1x PBS a cada tubo e pipeta para cima e para baixo lentamente para misturar. Adicione mais seis mililitros de 1x PBS na parte superior do tubo, e misture cuidadosamente novamente. Ultracentrificar os tubos a 100.000x g e a quatro graus celsius para re-pelotar as pequenas vesículas.Decante o supernaspe e bata os tubos secos antes de lise as vesículas para análise de proteínas ou reresusundo os EVs para análise morfológica. Para lise os EVs para análise de proteínas, adicione 40 microliters de forte tampão de lise contendo inibidor de protease às pelotas EV. Coloque Parafilm sobre cada tubo e vórtice vigorosamente.Em seguida, balance os tubos por 20 minutos em temperatura ambiente e vórtice novamente. Centrifufique brevemente a amostra a 1.000x g por 30 a 60 segundos para recuperar todo o volume da amostra. Transfira cada amostra para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e armazene-a a uma temperatura entre 20 e 80 graus celsius até estar pronta para processamento posterior.Para preparar os lises purificados para análise de imunoblot, adicione 5x tampão de amostra de Laemmli às amostras para uma concentração final de 1x. Ferva a amostra a 95 graus celsius por cinco a 10 minutos. Em seguida, carregue um volume igual de frações de uma a 10 em um gel de página SDS de 10%.Carregue uma massa igual de homogeneizar o tecido. Realize a eletroforese e a análise de manchas ocidentais para confirmar as proteínas EV nos lises purificados e comparar a abundância relativa de EV em frações. Neste estudo, vesículas extracelulares são extraídas e purificadas de tecido inteiro.Após a ultracentrifugação do gradiente de 10 a 30%, uma população de EVs leves pode ser vista migrando até a fração dois, enquanto uma população de EVs densa pode ser vista migrando até a fração cinco, dependendo do tipo de tecido. Os imunoblots representativos das frações gradientes exibem a separação eficiente e purificação de pequenos EVs derivados de tumores na fração cinco. Notavelmente, os espécimes de tumores pulmonares aparecem enriquecidos em EVs densos em comparação com EVs leves que foram previamente colhidos de tecido cerebral inteiro.A análise representativa do rastreamento de nano partículas e a microscopia eletrônica de vesículas derivadas de tecido na vesícula predominante contendo fração demonstram o enriquecimento e preservação de vesículas inteiras. Consistente com o tamanho e estrutura conhecidos de pequenos EVs. Os EVs intersticiais representam alvos promissores para o desenvolvimento de novos ensaios biomarcadores diagnósticos ou prognósticos.Esta técnica fornece aos pesquisadores ferramentas para a extração e purificação de vesículas para utilidade a jusante. Após a extração de EVs de tecido inteiro ou lised, pode ser realizada uma caracterização ampla de vesículas, incluindo análises proteômicas, genômicas e lipidômicas. Além disso, as amostras podem ser usadas para abordagens mais direcionadas.Vesículas isoladas diretamente de amostras de tecidos podem fornecer mais informações sobre mecanismos de doença, incluindo gênese tumoral, e podem fornecer importantes ferramentas diagnósticas ou prognósticos no futuro.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Pesquisa do câncer

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Estudando efeitos de radiação tecidual normais usando Hydrogels de matriz extracelular

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Gerando e Imageando Organoides Epitéliares de Camundongos e Humanos a partir de Tecido Mamário Normal e Tumoral Sem Passagem

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Estabelecimento de organoides tumorais derivados do câncer de pâncreas e fibroblastos a partir de tecido fresco

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Extração de DNA livre de células de espécimes de humor vítreo e aquoso para diagnóstico e monitoramento de linfoma vitreorretiniano

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...