Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Авторы благодарят д-р Ричард Новаковский и Флорида государственного университета лабораторных животных ресурсов для предоставления и заботы о животных, используемых для разработки этого протокола, с уважением. Мы благодарим Лю ся, доктор Ракеш Сингх и Флорида государственного университета трансляционная научная лаборатория для помощи с работой масс-спектрометрии для вниз по течению везикул характеристик, а также БСС биологических наук Imaging ресурсов Фонда для Использование просвечивающий электронный микроскоп в этом исследовании. Наконец мы благодарим д-р Mandip Сачдева (Флорида A & M университет) за пожертвование в размере опухоли образцов, используемых в разработке этого метода. Это исследование было поддержано грантов от Флорида Департамента здравоохранения Эд и Этель Мур Альцгеймера болезнь исследовательской программы награждены D.G.M. и J.M.O (6AZ11) и национального института рака национальных институтов здоровья под номером премии Вручена D.G.M. R01CA204621

Весь мозг были получены с согласия от правомерного использования животных и уход Комитет (IACUC) государственного университета Флориды. В общей сложности двенадцать мозг мыши (3 мозги из каждой возрастной группы: 2, 4, 6 и 8 месяцев) от C57BL/6 J фона использовались для извлечения EV, как описано вы...

<ol>
	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Гораздо научный интерес был создан относительно роли, которую малые EVs играть микроокружения опухоли, а также в орган развития, созревания и функции. В целом это исследование обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для извлечения нетронутыми EVs от весь мозг или образцы опухоли. Х...

Малые внеклеточного везикулы (EVs) включают в себя от англ производные exosomes и малых мембраны сарай микровезикулы, которые представляют широкий интерес биомедицинских. Небольшие EVs состоят из гетерогенных населения 50-250 Нм мембраны прыгните везикулы, содержащие биологически активные белки, липиды и нуклеиновых кислот, которые коллективно считается играть важную роль в множество процессов болезни. Продвижение исследований особенно причастны эти пузырьки в нейродегенеративных и прионы расстройств, инфекционные процессы, аутоиммунных или воспалительные условий и роста опухоли и метастазов1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. быстро растущих биомедицинских исследований в значении EVs в патогенезе заболевания параллельных интерес в развитии воспроизводимость и строгие методы для очистки этих пузырьков и изоляции.
Исторической и текущей задачей в EV характеристика была неспособность полностью отделить малых субпопуляций EV. Эта задача во многом из-за нашего ограниченного понимания различных молекулярных механизмов, регулирующих биогенеза отдельных пузырьков. Перекрывающиеся размер, плотность и биологические грузов между субпопуляциями далее convolutes эти различия. Частью этой задачи был также использование широко различные методы обогащения, предоставляя непоследовательность в течению анализе изолированных везикулы лаборатории и подрывает глобальные усилия для освещения категориальной EV населения.
Стоит отметить, что большинство EV характеристика была выполнена в пробирке коллекции клеточной культуры супернатанта, с более недавние исследования в естественных условиях, описывающих методы, чтобы изолировать везикулы из животных или человека жидкости организма, включая плазмы, мочи и слюна. В то время как EVs присутствуют в больших количествах в обращении, она также признала, что эти пузырьки играют важную роль в событиях в ячейке коммуникации и присутствуют в интерстиции клеточных тканей. В контексте рака интерстициальный EVs могут быть особенно важную роль в модуляции микроокружения опухоли раковых клеток посева и метастатический рост14,15. Следовательно есть значение в разработке и оптимизации методов для извлечения пузырьки из прочной ткани образцов. Эти методы будут предоставлять средства непосредственно изучать орган - или опухоль - производные EVs, добываемых из клинических образцов, включая небольшие биопсии и орган полной или частичной резекции.
В этом исследовании и в предыдущем докладе, опубликованном в нашей лаборатории16, мы стремимся решить несколько основных текущих проблем в EV обогащения методологии: 1) для описания воспроизводимый технику, чтобы изолировать и очищают EVs по самым высоким стандартам в настоящее время принятые в этой области; 2) для попытки изолировать малых субпопуляций EV, высоко обогащенный от англ производные exosomes; и 3) представить протокол для извлечения этих везикулы от твердых тканей образцов с целью дальнейшего характеристика.
Недавно Ковал и коллегами описал градиент плотности относительно небольших iodixanol для разделения и очистки EV субпопуляции более эффективно, чем сопоставимые сахарозы плотности градиенты17. В исследовании, цитируется в дендритных клеток, полученных EVs, захвачен в сравнительно малая плотность фракции, в соответствии с плотностью 1,1 г/мл, были высокообогащенного в белки от англ, считается наиболее последовательно с высокой долей exosomes в этом фракция. По мнению авторов эти «bona fide» exosomal белки включены опухоли восприимчивость ген 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 и несколько annexin белков17. Позже мы адаптировали эту технику для достижения успеха метода ткани диссоциации описал Перес Гонсалес et al18 и последующих дифференциального центрифугирования протокол изолировать весь мозг производные EVs16. Мы также продемонстрировали полезность этого метода в характеристике EV протеомов, объединяя последовательный протокол по течению количественное и сравнительного масс-спектрометрии везикулярного белка, ранее описанных в нашей лаборатории19. Эта работа параллельно, что от холма лаборатории, в которой EVs обогатились от лобной коры мозга20.
В этом исследовании мы подробно останавливаться на эту технику и расширить сферу применения протокола, недавно опубликовала от нашей лаборатории для изоляции EVs от опухоли легких твердых. Насколько нам известно это первое исследование, чтобы описать протокол обогатить EVs от ex vivo опухоли образцов. С учетом широкого интереса к EVs как Роман диагностических биомаркеров и их роль в tumorigenesis, этот метод скорее всего окажется ценным для растущего числа научных исследователей. С клинической точки зрения интерстициальный EVs могут гавани диагностики большое значение, особенно в образцах, где ограничена гистологических оценки. Мы надеемся, что метод конспектированный здесь обеспечит основу для воспроизводимых технику урожай EVs из свежих или замороженных животных или человека хирургической образцов, в почву для будущей работы раскрыть существенную роль в патогенезе заболеваний этих малых пузырьки могут играть.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Циркулирующего и интерстициальный малых мембраны прыгните внеклеточного пузырьков (EVs) представляют собой перспективные "мишени" для разработки новых диагностических и прогностических биомаркер анализов и скорее всего служат важными игроками в прогрессировании широкий спектр заболевания. Текущие исследования уделяется характеристике везикулы, выделяется из нескольких клеток и типы тканей для того, чтобы лучше понять роль EVs в патогенезе условий, включая нейродегенеративные, воспаление и рак. Однако глобально последовательную и воспроизводимые методы, чтобы изолировать и очистить везикулы остаются в прогресс. Кроме того едва описаны методы извлечения EVs из прочной ткани ex vivo . Здесь мы предоставляем подробный протокол для извлечения мелких EVs интереса от совершенно свежие или замороженные тканей, в том числе мозга и опухоли образцов, для дальнейшей характеризации. Мы продемонстрировать технологичность этого метода для несколько ниже по течению анализов, включая электронной микроскопии и иммунофенотипических характеристика везикулы, а также количественного масс-спектрометрии белков EV.

Схематический обзор ткани диссоциации, дифференциального центрифугирования и градиента очистки везикулы отображается на рисунке 1. Морфологическая и иммунофенотипических подтверждения градиент очищенная EVs выделяется на рисунке 2. Д...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Извлечение внеклеточного Vesicles из цельной ткани

Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции малых внеклеточного везикулы (EVs) от всего тканей, в том числе мозга и опухоли образцов. Этот метод предлагает воспроизводимый метод для извлечения EVs из прочной ткани для дополнительного анализа, ниже по течению.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Этот протокол обеспечивает строгую и воспроизводимую технику для извлечения и изоляции небольших внеклеточных пузырьков из образцов целых тканей для анализа экс-виво ниже по течению. С одним из самых высоких уровней чистоты в настоящее время достижимы, этот метод облегчает прямой морфологический, иммунофенотипический, и глубокая характеристика интерстициальных пузырьков выделяется в различных образцах тканей, в том числе опухолей. Здесь мы демонстрируем изоляцию тканей EVs от образцов опухоли мозга и легких.Тем не менее, этот метод может быть применен к исследованиям с использованием различных, доброкачественных или других образцов опухоли, а также. Для начала приготовьте 10 миллилитров буфера диссоциации в среде Hibernate-E на каждые 0,4-1,0 грамма ткани. Добавить целые свежие или замороженные ткани в буфер в 50 миллилитров трубки, и инкубировать в теплой водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение 20 минут.После этого добавьте ингибиторы протеазы и фосфатазы для окончательной концентрации 1x в буфере диссоциации. Налейте раствор с тканью в свободные подходят падения гомогенизатора. Используйте приблизительно 30 медленных ударов на образец, чтобы мягко разобщить ткани.Затем перенесите диссоциированную ткань и буферный раствор в 50 миллилитровую коническую трубку. Центрифуга на 500x g и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки и оставшиеся волокна или сплоченные фрагменты тканей. Перенесите супернатант в чистую 50-миллилитровую коническую трубку и центрифугу при 2000 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать и выбросить большой клеточный мусор.Перенесите этот супернатант в чистую коническую трубку 50 миллилитров и центрифугу при 10 000 г и при четырех градусах по Цельсию в течение 40 минут, чтобы гранулировать любые нежелательные большие пузырьки или маленькие апоптотические тела. Декант супернатант через 0,45 микрометровый фильтр в чистую 12 миллилитровую ультрацентрифугированную трубку. Далее, ультрацентрифуг образца на 100,000x g и при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы гранулировать небольшие EVs.Декант supernatant и оставить ультрацентрифугации трубки перевернутый в течение пяти до 10 минут, нажав часто, чтобы удалить остатки жидкости по бокам труб. Затем, повторное производство гранул EV в 1,5 миллилитров 0,25 молярной сахарозы буфера. Обложка труб с Parafilm, а затем вихрь EVs в раствор.Рок ультрацентрифуг трубки в течение 10 до 15 минут при комнатной температуре. А потом вихрь еще раз. Кратко центрифуга труб со скоростью менее 1000x г, чтобы восстановить жидкую подвеску в нижней части трубки.При необходимости храните подвеску при четырех градусах по Цельсию на ночь. Во-первых, добавить 1,5 миллилитров 60%йодиксанола к 1,5 миллилитров буфера сахарозы tris, который содержит EVs для создания окончательного решения, содержащего 30%iodixanol. Pipette вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать раствор тщательно.Перенесите этот раствор на дно 5,5 миллилитров ультрацентрифугации трубки. Далее, смешать 60%iodixanol запас с ультра чистой водой, чтобы подготовить по крайней мере 1,5 миллилитров как 20%и 10%iodixanol раствор. Используя шприц и 18 калибровочных игл, измерьте 1,3 миллилитров раствора 20%йодиксанола и тщательно наслоьте его поверх нижнего градиента.Держите скошень иглы в контакте с внутренней частью трубки, чуть выше мениска и добавить раствор падение мудрым, чтобы избежать смешивания слоев на интерфейс плотности. Затем слой 1.2 миллилитров 10%iodixanol раствора на вершине 20%слой, используя ту же технику. Тщательно баланс и загрузить ультрацентрифугации труб в ротор ведра.Установите скорость ускорения и замедления ротора ведра качели до минимальных ставок, и центрифуги на 268,000x g и при четырех градусах по Цельсию в течение 50 минут. В то время как образец в настоящее время центрифугирован, этикетка 10 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки для каждого образца, который будет соответствовать фракций от одного до 10 градиента плотности. Как только центрифуга будет завершена, аккуратно снимите трубки с ведер ротора и поместите их в стабильный держатель.Pipette 10 серийных фракций из 490 микролитров из верхней части градиента в соответствующие трубки. Используя рефрактометр, измеряйте рефракционные индексы фракций. Затем перенесите каждую фракцию в чистую 12-миллилитровую ультрацентрифугированную трубку.Добавить пять миллилитров 1x PBS к каждой трубке и пипетки вверх и вниз медленно смешивать. Добавить еще шесть миллилитров 1x PBS в верхней части трубки, и тщательно перемешать еще раз. Ультрацентрифуг трубки на 100 000x г и при четырех градусах по Цельсию, чтобы повторно гранулировать небольшие пузырьки.Декант supernatant и нажмите трубки сухой перед лизикулы для анализа белка или reresuspending EVs для морфологического анализа. Чтобы подлизать EVs для анализа белка, добавьте 40 микролитров сильного буфера лиза, содержащего ингибитор протеазы, к гранулам EV. Поместите Parafilm над каждой трубкой, и вихрь энергично.Далее, рок трубки в течение 20 минут при комнатной температуре и вихрь снова. Кратко центрифуга образца на 1000x г в течение 30 до 60 секунд, чтобы восстановить весь объем образца. Перенесите каждый образец в новую микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 миллилитра и храните ее при температуре от 20 до 80 градусов по Цельсию до готовности к дальнейшей обработке.Чтобы подготовить очищенные лизаты для иммуноблотного анализа, добавьте 5x буфер образца Laemmli к образцам для окончательной концентрации 1x. Отварить образец при 95 градусах по Цельсию в течение пяти-десяти минут. Затем загрузите равный объем фракций от одного до 10 в 10%SDS страницу геля.Загрузите равную массу гомогената тканей. Выполните электрофорез и западный анализ помарки, чтобы подтвердить белки EV в очищенных лизатах и сравнить относительное изобилие EV в фракциях. В этом исследовании, внеклеточные пузырьки извлекаются и очищаются от целых тканей.После ультрацентрифугации градиента от 10 до 30%йодиксанола можно увидеть популяцию легких ЭВ, мигрирующих до второй фракции, в то время как популяция плотных ЭВ может быть замечена мигрирующей до пяти фракций, в зависимости от типа ткани. Представительные иммуноблотации градиентных фракций демонстрируют эффективное разделение и очищение мелкой опухоли, полученной ЭВ во фракции 5. Примечательно, что образцы опухоли легких, как представляется, обогащены в плотных EVs по сравнению со светом EVs, которые ранее были собраны из всей ткани мозга.Репрезентативный анализ слежения за наночастицами и электронная микроскопия тканевых пузырьков в преобладающей везикуле, содержащей фракцию, демонстрируют обогащение и сохранение целых пузырьков. В соответствии с известным размером и структурой малых EVs. Интерстициальные EVs представляют собой перспективные цели для разработки новых диагностических или прогностических анализов биомаркеров.Этот метод предоставляет исследователям инструменты для извлечения и очистки пузырьков для вниз по течению полезности. После извлечения целых или лизированная ткань EVs, широкая характеристика пузырьков, включая протеомные, геномные и липидомные анализы могут быть выполнены. Кроме того, образцы могут использоваться для более целенаправленных подходов.Vesicles изолированы непосредственно от образцов тканей может обеспечить дальнейшее понимание механизмов заболевания, в том числе генезиса опухоли, и может обеспечить важные диагностические или прогностические инструменты в будущем.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Нейтрофильные внеклеточного ловушки, порожденных низкой плотности нейтрофилов получены перитонеальный лаваж жидкости посредником рост опухолевых клеток и вложения

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Изучение нормальных эффектов радиации тканей с помощью внеклеточных гидрогелей матрицы

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Извлечение aqueous Метаболитов из культовых клеток присоединения для метаболомического анализа капиллярной электрофорез-масс-спектрометрии

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Выделение экзосомных внеклеточных везикул, несущих гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, из эмбриональных стволовых клеток

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Выделение и функциональная оценка стволовых клеток рака молочной железы человека из образцов клеток и тканей

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

В городе Виво Скрининг иммуногенности внеклеточных везикул опухолевого происхождения методом проточной цитометрии селезеночных Т-клеток

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Генерация и визуализация эпителиальных органоидов мыши и человека из нормальной и опухолевой ткани молочной железы без пассажа

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Метод обогащения небольших внеклеточных везикул, полученных из ткани рака печени

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Получение опухолевых органоидов и фибробластов рака поджелудочной железы из свежих тканей

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Экстракция внеклеточной ДНК образцов стекловидного тела и водянистой влаги для диагностики и мониторинга витреоретинальной лимфомы

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...