Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
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Los autores agradecen el Dr. Richard Nowakowski y Florida estado Universidad laboratorio de los recursos para proveer y cuidar de los animales utilizados para desarrollar este protocolo, respetuosamente. Agradecemos a Liu Xia, Dr. Rakesh Singh y la Florida Universidad traslacional ciencia Laboratorio Estatal de asistencia con el trabajo de espectrometría de masas utilizado para la caracterización de aguas abajo de la vesícula, así como la posibilidad de recurso de la proyección de imagen de ciencia biológico CEI de el uso del microscopio electrónico de transmisión en este estudio. Finalmente, agradecemos a Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) para la donación de las muestras de tumor en el desarrollo de este método. Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Florida Departamento de la salud Ed Ethel Moore Alzheimer Enfermedad programa de investigación y concedió a D.G.M. y J.M.O (6AZ11) y el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud premio con el número R01CA204621 otorgado a la D.G.M.

Cerebro entero se obtuvieron con la aprobación del uso Animal institucional y Comité de cuidado (IACUC) de la Universidad Estatal de Florida. Un total de doce cerebros de ratón (3 cerebros de cada grupo de edad: 2, 4, 6 y 8 meses) de un J C57BL/6 fondo fueron utilizados para la extracción de EV, como se describió anteriormente16. Especímenes de tumor de pulmón fueron generosamente donados por Dr. Mandip Sachdeva bajo aprobación de Florida agrícola y mecánica de la Universidad de IACUC. T...

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	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Interés tanto científico se ha generado con respecto a los roles que EVS pequeño jugar en el microambiente del tumor, así como en función, maduración y desarrollo del órgano. En general, este estudio proporciona un flujo de trabajo optimizado para la extracción de EVs intactos de todo el cerebro o las muestras de tumor. Mientras que aquí simplemente se demuestra la aplicabilidad de esta técnica a pulmón tumor derivado de EVs, este método podría ser adaptado para el trabajo en otros tejidos sólidos, proporci...

Pequeñas vesículas extracelulares (EVs) incluyen exosomas derivados de endosomal y microvesículas de membrana-arrojan pequeñas que son de amplio interés biomédico. EVs pequeño están compuestos por una heterogénea población de vesículas de membrana-limite 50-250 nm que contiene las proteínas biológicamente activas, lípidos y ácidos nucleicos que colectivamente se cree que desempeñan un papel importante en multitud de procesos de la enfermedad. Avance de la investigación ha implicado especialmente estas vesículas en neurodegenerativas y trastornos del prión, procesos infecciosos, condiciones autoinmunes o inflamatorias y el crecimiento del tumor y metástasis1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Investigación Biomédica de rápido crecimiento en la importancia de los vehículos eléctricos en la patogénesis de la enfermedad ha generado un interés paralelo en el desarrollo de métodos reproducibles y riguroso para el aislamiento y purificación de estas vesículas.
Un desafío histórico y actual en EV caracterización ha sido la imposibilidad de separar totalmente pequeñas subpoblaciones de EV. Este reto es en gran parte debido a nuestra limitada comprensión de los diferentes mecanismos moleculares que rigen la biogénesis de diferentes vesículas. Superposición de tamaño, densidad y carga biológica entre subpoblaciones más convolutes estas distinciones. Parte de este reto ha sido también el uso de ampliamente diferentes técnicas de enriquecimiento, proporciona inconsistencia en posteriores análisis de vesículas aisladas en laboratorios y socavando los esfuerzos mundiales para iluminar poblaciones EV categóricas.
Cabe destacar que la mayoría de los EV caracterización se ha realizado de la colección in vitro de cultivo celular sobrenadante, con estudios in vivo más recientes que describen técnicas para aislar las vesículas de fluidos corporales de animales o humanos, incluyendo plasma, orina y la saliva. Mientras que EVs están presente en grandes cantidades en circulación, también reconoció que estas vesículas desempeñan papeles importantes en eventos de comunicación célula a célula y están presentes en el intersticio de los tejidos celulares. En el contexto de cáncer, EVs intersticiales pueden ser particularmente importantes en la modulación del microambiente tumoral para el cáncer siembra y crecimiento metastático14,15. Por lo tanto, es valor en el desarrollo y optimización de técnicas para extraer las vesículas de muestras de tejidos sólidos. Estos métodos proporcionarán un medio directamente estudiar órgano - o tumor derivado de EVs de muestras clínicas, incluyendo pequeñas biopsias y resecciones parcial o total del órgano.
En este estudio y en un informe anterior publicado por nuestro laboratorio16, apuntamos a las preocupaciones de varios principales actuales en la metodología del enriquecimiento de EV: 1) para describir una técnica reproducible para aislar y purificar EVs a los más altos estándares en la actualidad aceptado en el campo; 2) para intentar aislar pequeñas subpoblaciones EV altamente enriquecidas en exosomas derivados de endosomal; y 3) para proporcionar un protocolo para la extracción de estas vesículas de muestras de tejido sólido con el fin de más caracterización.
Recientemente, Kowal y colegas describieron un gradiente de densidad de iodixanol relativamente pequeños para separar y purificar EV subpoblaciones con mayor eficacia que el de gradientes de densidad de sacarosa comparable17. En el estudio citado, EVs derivados de células dendríticas capturadas en una fracción de densidad relativamente constante con una densidad de 1,1 g/mL, fueron altamente enriquecidos en proteínas endosomal creídas que es más consistente con una alta proporción de exosomas presente en este fracción. Según los autores, estas proteínas de "buena fe" exosomal incluyen el gen de susceptibilidad tumoral 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 y varias de las proteínas anexina17. Hemos adaptado más adelante esta técnica para tener éxito un método de la disociación del tejido descrito por Perez-Gonzalez et al18 y un protocolo posterior centrifugación diferencial para aislar todo derivado del cerebro EVs16. También hemos demostrado la utilidad de este método en la caracterización de proteomas EV combinando un protocolo secuencial descendente espectrometría cuantitativa y comparativa de proteína vesicular, descrita previamente por nuestro laboratorio19. Este trabajo en paralelo desde el laboratorio de Hill, en el cual se enriquecieron EVs de la corteza frontal del cerebro20.
En este estudio, elaborar sobre esta técnica y ampliar la aplicación del protocolo recientemente publicado de nuestro laboratorio para el aislamiento de EVs de tumores sólidos de pulmón. A nuestro conocimiento, éste es el primer estudio que describe un protocolo para enriquecer EVs de ex vivo especímenes de tumor. Dado el interés generalizado en EVs como nuevos biomarcadores diagnóstico y su papel en la tumorigénesis, este método probablemente resultará valioso para un número creciente de investigadores científicos. Desde una perspectiva clínica, EVs intersticiales podrían albergar gran valor diagnóstico, especialmente en muestras donde se limita la evaluación histologic. Nuestra esperanza es que el método descrito aquí proporcionará una base para una técnica reproducible cosecha EVs de frescos o congelados animales o humanos especímenes quirúrgicos, allanando el camino para el trabajo futuro a descubrir el importante papel en la patogénesis de la enfermedad estos pequeños las vesículas pueden jugar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Intersticiales y circulantes unida a la membrana extracelulares vesículas pequeñas (EVs) representan un objetivo prometedor para el desarrollo de ensayos de nuevos biomarcadores diagnóstico o pronóstico y probablemente servir como actores importantes en la progresión de un vasto espectro de enfermedades. La investigación actual se centra en la caracterización de las vesículas segregadas de múltiples células y tipos de tejidos con el fin de mejor comprender el papel de EVs en la patogenia de condiciones incluyendo neurodegeneración, inflamación y cáncer. Sin embargo, globalmente consistente y reproducibles técnicas para aislar y purificar las vesículas permanecen en progreso. Por otra parte, apenas se describen los métodos de extracción de EVs de tejidos sólidos ex vivo . Presentamos un protocolo detallado para extraer pequeños EVs de interés de tejidos entero frescos o congelados, incluyendo a muestras de cerebro y tumor, para mayor caracterización. Demostramos la capacidad de adaptación de este método para múltiples análisis aguas abajo, incluyendo microscopía electrónica y caracterización de immunophenotypic de vesículas, así como cuantitativo spectrometry total de proteínas de EV.

Un Resumen esquemático de la disociación del tejido, centrifugación diferencial y gradiente purificación de vesículas se muestra en la figura 1. La confirmación morfológica e immunophenotypic de EVs purificada de gradiente se destaca en la figura 2. Muestra un diagrama de densidades reproducibles después de ultracentrifugación de la gradiente de iodixanol 10-30%, con dos poblaciones distintas vesículas migran hacia arri...

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Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

Presentamos un protocolo detallado para aislar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) de tejidos todo, incluyendo a muestras de cerebro y del tumor. Este método ofrece una técnica reproducible para extraer EVs de tejido sólido para mayores análisis aguas abajo.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Este protocolo proporciona una técnica rigurosa y reproducible para la extracción y aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares de muestras de tejido entero para análisis ex-vivo aguas abajo. Con los niveles más altos de pureza actualmente alcanzables, este método facilita la caracterización directa morfológica, inmunofenotípica y profunda de vesículas intersticiales secretadas en varios especímenes de tejido, incluyendo tumores. Aquí, demostramos el aislamiento de vehículos eléctricos de tejido de muestras de tumores cerebrales y pulmonares.Sin embargo, esta técnica se puede aplicar a estudios que utilizan muestras de tumores diversos, benignos u otros. Para comenzar, prepare 10 mililitros de tampón de disociación en el medio Hibernate-E por cada 0,4 a 1,0 gramos de tejido. Agregue tejido fresco o congelado entero al tampón en un tubo de 50 mililitros e incubar en un baño de agua tibia a 37 grados centígrados durante 20 minutos.Después de esto, añadir inhibidores de la proteasa y fosfatasa para una concentración final de 1x en el tampón de disociación. Vierta la solución con el tejido en un homogeneizador de ajustes sueltos. Utilice aproximadamente 30 golpes lentos por muestra para disociar suavemente el tejido.A continuación, transfiera el tejido disociado y la solución tampón a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar a 500x g y a cuatro grados celsius durante cinco minutos para peletizar las células y las fibras restantes o fragmentos de tejido cohesivo. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico limpio de 50 mililitros, y centrifugar a 2.000 g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos para peletizar y desechar los desechos celulares grandes.Transfiera este sobrenadante a un tubo cónico limpio de 50 mililitros, y centrífuga a 10.000x g y a cuatro grados centígrados durante 40 minutos para peletizar cualquier vesícula más grande no deseada o pequeños cuerpos apoptóticos. Decantar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micrómetros en un tubo de ultracentrifugación limpio de 12 mililitros. A continuación, ultracentrifríe la muestra a 100.000x g y a cuatro grados centígrados durante dos horas, para peletizar pequeños vehículos eléctricos.Decantar el sobrenadante y dejar los tubos de ultracentrifugación invertidos durante cinco a 10 minutos, tocando con frecuencia para eliminar cualquier líquido residual en los lados de los tubos. A continuación, resuspender el pellet EV en 1,5 mililitros de 0,25 tampón de sacarosa molar. Cubra los tubos con Parafilm y, a continuación, vórtice los vehículos eléctricos en solución.Mece los tubos ultracentrífugos durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Y luego vórtice una vez más. Centrifugar brevemente los tubos a una velocidad inferior a 1.000x g para recuperar la suspensión líquida en la parte inferior del tubo.Si es necesario, guarde la suspensión a cuatro grados centígrados durante la noche. En primer lugar, agregue 1,5 mililitros de 60%yoodixanol a los 1,5 mililitros del búfer de tris de sacarosa que contiene los vehículos eléctricos para crear una solución final que contenga 30%yodoxanol. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar la solución a fondo.Transfiera esta solución a la parte inferior de un tubo de ultracentrifugación de 5,5 mililitros. A continuación, mezcle el stock de 60%iodixanol con agua ultra pura para preparar al menos 1,5 mililitros de una solución de 20% y 10% de yodoxanol. Usando una jeringa y una aguja de calibre 18, mida 1,3 mililitros de la solución de 20% de yodoxanol y capa cuidadosamente en la parte superior del gradiente inferior.Mantenga el bisel de la aguja en contacto con el interior del tubo, justo encima del menisco y agregue la gota de solución sabia para evitar mezclar las capas en la interfaz de densidad. Luego, capa 1.2 mililitros de la solución 10%iodixanol en la parte superior de la capa 20%, utilizando la misma técnica. Equilibre y cargue cuidadosamente los tubos de ultracentrifugación en cubos de rotor.Establezca las velocidades de aceleración y desaceleración de un rotor de cucharón oscilante a las tasas mínimas, y centrifugar a 268.000 g y a cuatro grados centígrados durante 50 minutos. Mientras la muestra está siendo centrifugada, etiquete 10 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para cada muestra que se corresponda con las fracciones del uno al 10 del gradiente de densidad. Una vez completada la centrifugación, retire suavemente los tubos de los cubos del rotor y colóquelos en un soporte estable.Pipeta 10 fracciones seriales de 490 microlitros desde la parte superior del gradiente hasta los tubos correspondientes. Usando un refractómetro, mida los índices de refracción de las fracciones. A continuación, transfiera cada fracción a un tubo de ultracentrifugación limpio de 12 mililitros.Agregue cinco mililitros de 1x PBS a cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo lentamente para mezclar. Agregue seis mililitros adicionales de 1x PBS a la parte superior del tubo, y mezcle cuidadosamente de nuevo. Ultracentrífaza los tubos a 100.000 g y a cuatro grados centígrados para re-pellet las vesículas pequeñas.Decantar el sobrenadante y tocar los tubos secos antes de la lesión de las vesículas para el análisis de proteínas o reresuspending los EV para el análisis morfológico. Para anlicer los VEHÍCULOs eléctricos para el análisis de proteínas, agregue 40 microlitros de tampón de lelisis fuerte que contenga inhibidor de la proteasa a los pellets EV. Coloque Parafilm sobre cada tubo y vórtice vigorosamente.A continuación, mece los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente y vórtice de nuevo. Centrifugar brevemente la muestra a 1.000x g durante 30 a 60 segundos para recuperar todo el volumen de la muestra. Transfiera cada muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y guárdela a una temperatura de entre 20 y 80 grados centígrados hasta que esté lista para su posterior procesamiento.Para preparar los lysates purificados para el análisis de inmunoblot, añada 5x tampón de muestra De Laemmli a las muestras para una concentración final de 1x. Hervir la muestra a 95 grados centígrados durante cinco a 10 minutos. A continuación, cargue un volumen igual de fracciones de una a 10 en un gel de página 10%SDS.Cargue una masa igual de homogeneización de tejido. Realizar análisis de electroforesis y manchas occidentales para confirmar las proteínas EV en los lysates purificados y comparar la abundancia relativa de EV en fracciones. En este estudio, las vesículas extracelulares se extraen y purifican de todo el tejido.Después de la ultracentrifugación del gradiente de 10 a 30%iodixanol, se puede ver una población de vehículos eléctricos ligeros migrando hasta la fracción dos, mientras que una población de vehículos eléctricos densos se puede ver migrando hasta la fracción cinco, dependiendo del tipo de tejido. Los inmunoblots representativos de las fracciones de gradiente exhiben la separación y purificación eficientes de pequeños vehículos eléctricos derivados de tumores en la fracción cinco. En particular, las muestras de tumores pulmonares parecen enriquecidas en vehículos eléctricos densos en comparación con los vehículos eléctricos ligeros que previamente se cosechaban de todo el tejido cerebral.El análisis representativo de nanopartículas y la microscopía electrónica de vesículas derivadas de tejidos en la fracción predominante de vesículas demuestran el enriquecimiento y la preservación de vesículas enteras. Consistente con el tamaño y la estructura conocidos de los vehículos eléctricos pequeños. Los vehículos eléctricos intersticiales representan objetivos prometedores para el desarrollo de nuevos ensayos de biomarcadores diagnósticos o de pronóstico.Esta técnica proporciona a los investigadores herramientas para la extracción y purificación de vesículas para la utilidad aguas abajo. Después de la extracción de vehículos eléctricos de tejido entero o lisiado, se puede realizar una caracterización amplia de las vesículas, incluidos los análisis proteómicos, genómicos y lipidómicos. Además, las muestras se pueden utilizar para enfoques más específicos.Las vesículas aisladas directamente de muestras de tejido pueden proporcionar más información sobre los mecanismos de la enfermedad, incluida la génesis tumoral, y pueden proporcionar importantes herramientas de diagnóstico o pronóstico en el futuro.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrófilos trampas extracelulares generadas por los neutrófilos de baja densidad obtienen de líquido de lavado Peritoneal mediato accesorio y el crecimiento de células tumorales

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Estudio de los efectos de radiación de tejido normal con hidrogeles de matriz extracelular

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para análisis metabolómicos por electroforesis capilar-espectrometría de masas

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generación y obtención de imágenes de organoides epiteliales humanos y de ratón a partir de tejido mamario normal y tumoral sin pasar

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Establecimiento de organoides tumorales derivados del cáncer de páncreas y fibroblastos a partir de tejido fresco

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Extracción de ADN libre de células de muestras de humor vítreo y acuoso para el diagnóstico y seguimiento del linfoma vitreorretiniano

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...