Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Richard Nowakowski och Florida State University laboratorium djur resurser för att tillhandahålla och ta hand om de djur som används för att utveckla detta protokoll, respektfullt. Vi tackar Xia Liu, Dr. Rakesh Singh och Florida State University translationell vetenskap laboratoriet för hjälp med masspektrometri arbetet används för nedströms vesikler karakterisering, liksom FSU biologisk vetenskap Imaging Resource anläggningen för användningen av transmissionselektronmikroskop i denna studie. Slutligen, vi tackar Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) för donation av tumör exemplar används i utvecklingen av denna metod. Denna studie stöddes av bidrag från de Florida Department of Health Ed och Ethel Moore Alzheimers sjukdom Research Program tilldelas D.G.M. och J.M.O (6AZ11) och National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health Award nummer R01CA204621 tilldelas D.G.M.

Hela hjärnor erhölls med godkännande från institutionella djur användning och hand kommittén (IACUC) av den Florida State University. Sammanlagt tolv mus hjärnor (3 hjärnor från varje åldersgrupp: 2, 4, 6 och 8 månader) från en C57BL/6 J bakgrund användes för EV utvinning, som tidigare beskrivits16. Lung tumör prover var generöst skänkts av Dr Mandip Sachdeva under godkännande av Florida jordbruks och mekaniska universitet IACUC. Lungtumörer härleddes från den mänskliga adeno...

<ol>
	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Mycket vetenskapligt intresse har genererats med avseende på de roller som små EVs spela i den tumör närmiljön samt i orgel utveckling, mognad och funktion. Denna studie ger sammantaget ett optimerat arbetsflöde för utvinning av intakt EVs från hela hjärnan eller tumör prover. Även här har vi helt enkelt demonstrera tillämpligheten av denna teknik till lung tumör-derived EVs, kunde denna metod enkelt anpassas för arbete på andra fasta vävnader, vilket ger möjligheter för ytterligare ex vivo karaktäris...

Lilla extracellulära vesicles (EVs) inkluderar endosomal-härledda exosomes och små membran-shed-microvesicles som är av bred biomedicinsk intresse. Liten EVs består av en heterogen population av 50-250 nm membran-bundna blåsor som innehåller biologiskt aktiva proteiner, lipider och nukleinsyror som kollektivt tros spela en viktig roll i en mängd olika sjukdomsprocesser. Främja forskning har särskilt inblandad dessa blåsor i neurodegenerativa och prion sjukdomar, smittsamma processer, autoimmuna eller inflammatoriska sjukdomar, och tumörtillväxt och metastas1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. snabbt växande biomedicinsk forskning om EVs betydelse i sjukdomspatogenes har genererat parallella intresse att utveckla reproducerbara och rigorösa metoder för isolering och rening av dessa blåsor.
En historisk och aktuell utmaning EV karakterisering har varit oförmågan att helt separera små EV subpopulations. Denna utmaning är till stor del på grund av vår begränsade förståelse av de olika molekylära mekanismer som styr biogenes av distinkta blåsor. Överlappande storlek, täthet och biologiska Last mellan subpopulationer ytterligare convolutes dessa distinktioner. En del av denna utmaning har också användningen av allmänt olika anrikning tekniker, ge inkonsekvens i efterföljande analys av enstaka blåsor över laboratorier och undergräver den globala ansträngningen att belysa kategoriska EV populationer.
Det är värt att notera att majoriteten av EV karakterisering har utförts från in vitro-samling av cellkultur supernatant, med nyare in vivo-studier som beskriver tekniker för att isolera blåsor från djurs eller människors kroppsvätskor, inklusive plasma, urin , och saliv. EVs finns i stora mängder i omlopp, erkänt det också att dessa blåsor spelar viktiga roller i cell-till-cell kommunikationshändelser och förekommer i interstitium av cellulära vävnader. I samband med cancer, kan interstitiell volontärerna vara särskilt viktigt i modulerande den tumör närmiljön för cancercell sådd och metastaserande tillväxt14,15. Följaktligen finns det värde i utveckling och optimering av metoder för att extrahera blåsor från solid vävnadsprover. Dessa metoder kommer att tillhandahålla ett sätt att direkt studera orgel - eller tumör - derived EVs skördas från kliniska prover, inklusive små biopsier och partiell eller fullständig orgel resektioner.
I denna studie, och i en tidigare rapport utgiven av vårt laboratorium16, vi strävar efter att ta flera stora aktuella problem i EV anrikning metodik: 1) att beskriva en reproducerbar teknik för att isolera och rena EVs till högsta standard för närvarande accepterat i fältet. (2) för att försöka isolera små EV subpopulations höganrikat i endosomal-derived exosomes; och 3) att ge ett protokoll för utvinning av dessa blåsor från solid vävnadsprover i syfte att ytterligare karakterisering.
Nyligen, Kowal och kollegor beskrivit en relativt småskalig iodixanol täthetlutning för att separera och rena EV subpopulationer med större effekt än jämförbara sackaros densitet övertoningar17. I den citerade studien var dendritiska cell-derived EVs fångas i en relativt ljus densitet bråkdel, konsekvent med en densitet 1,1 g/ml, höganrikat i endosomal proteiner tros vara mest förenligt med en hög andel av exosomes i detta fraktion. Enligt författarna ingår dessa ”bona fide” exosomal proteiner tumör känslighet genen 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 och flera annexin proteiner17. Vi anpassat senare denna teknik för att lyckas en metod av vävnad dissociation beskrivs av Perez-Gonzalez et al18 och ett efterföljande differentiell centrifugering protokoll att isolera hela brain-derived EVs16. Vi har också visat nyttan av denna metod i kännetecknar EV proteom genom att kombinera en sekventiell protokoll för nedströms kvantitativa och jämförande masspektrometri av vesikulär protein, tidigare beskrivits av vårt laboratorium19. Detta arbete parallellt som från Hill laboratoriet, där EVs berikades från främre hjärnbarken hjärnor20.
I denna studie vi utveckla denna teknik och utvidga tillämpningen av det protokoll som nyligen publicerade från vårt laboratorium på isoleringen av EVs från solid lungtumörer. Till vår kunskap är detta den första studien att beskriva ett protokoll för att berika EVs från ex vivo tumör prover. Ges det utbredda intresset för EVs som nya diagnostiska biomarkörer och deras roll i tumourigenesis, denna metod kommer sannolikt visa sig värdefullt att ett växande antal forskare. Ur ett kliniskt perspektiv, kunde interstitiell volontärerna hysa stort diagnostiskt värde, särskilt i exemplar där histologisk utvärdering är begränsad. Vår förhoppning är att den metod som anges här kommer att ge en grund för en reproducerbar teknik att skörda EVs från färska eller frysta djurs eller människors kirurgiska prover, banar väg för framtida arbete att avslöja betydande roller i sjukdomspatogenes dessa små blåsor kan spela.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Cirkulerande och interstitiell små membran-bundna extracellulära blåsor (EVs) representerar lovande mål för utvecklingen av nya diagnostiska eller prognostiska biomarkörer analyser, och sannolikt fungera som viktiga aktörer i utvecklingen av ett brett spektrum av sjukdomar. Nuvarande forskning är inriktad på karakterisering av vesikler utsöndras från flera cell och vävnadstyper för att bättre förstå EVs roll i patogenesen av villkor inklusive neurodegeneration, inflammation och cancer. Globalt konsekvent och reproducerbart tekniker att isolera och rena blåsor är dock fortfarande pågår. Dessutom beskrivs metoder för utvinning av EVs från solid vävnad ex vivo knappt. Här, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att extrahera små EVs sevärdheter från hela färska eller frysta vävnader, inklusive hjärnan och tumör prover, för ytterligare karakterisering. Vi visar denna metod för flera efterföljande analyser, inklusive elektronmikroskopi och immunophenotypic karakterisering av blåsor, samt kvantitativa masspektrometri av EV proteiner anpassningsförmåga.

En schematisk översikt av vävnad dissociation, differentiell centrifugering och gradient rening av blåsor visas i figur 1. Morphologic och immunophenotypic bekräftelse av toning-renat EVs är markerat i figur 2. Ett diagram av reproducerbara densiteter efter ultracentrifugering 10-30% iodixanol övertoningens visas, med två distinkta vesikler populationer flyttar uppåt till del 2 (ljus EVs) och del 5 (tät EVs), beroende av...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av extracellulära blåsor från hela vävnad

Här, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att isolera små extracellulära blåsor (EVs) från hela vävnader, inklusive hjärnan och tumör exemplar. Denna metod erbjuder en reproducerbar teknik för att extrahera EVs från solid vävnad för ytterligare nedströms analyser.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Detta protokoll ger en rigorös och reproducerbar teknik för extraktion och isolering av små extracellulära vesiklar från hela vävnad exemplar för nedströms ex-vivo analyser. Med bland de högsta nivåerna av renhet som för närvarande kan uppnås, underlättar denna metod direkt morphologic, immunophenotypic och djup karakterisering av interstitiell vesiklar utsöndras i olika vävnad exemplar, inklusive tumörer. Här visar vi isolering av vävnad EVs från hjärnan och lungtumör exemplar.Emellertid, denna teknik kan tillämpas på studier med hjälp av olika, godartade, eller andra tumör exemplar samt. Till att börja, förbereda 10 milliliter av dissociation buffert i Hibernate-E medium för varje 0,4 till 1,0 gram vävnad. Tillsätt hela färsk eller fryst vävnad till bufferten i en 50 milliliter rör, och inkubera i ett varmt vattenbad vid 37 grader celsius i 20 minuter.Efter detta, tillsätt proteas och fosfatashämmare för en slutlig 1x koncentration i dissociation bufferten. Häll lösningen med vävnaden i en lös passform downs homogenisator. Använd ungefär 30 långsamma slag per prov för att försiktigt dissociera vävnaden.Sedan överför du den dissocierade vävnaden och buffertlösningen till ett 50 milliliter koniskt rör. Centrifugera vid 500x g och vid fyra grader celsius i fem minuter för att pelleta cellerna och de återstående fibrerna eller sammanhängande vävnad fragment. Överför supernatanten till ett rent koniskt rör på 50 milliliter, och centrifug vid 2, 000x g och vid fyra grader celsius i 10 minuter till pelleten och kassera det stora cellulära skräpet.Överför denna supernatant till en ren 50 milliliter konisk rör, och centrifug vid 10, 000x g och vid fyra grader celsius i 40 minuter för att pelleta några oönskade större vesicles eller små apoptotiska kroppar. Dekantera supernatanten genom ett 0,45 mikrometerfilter till ett rent 12 milliliter ultracentrifugationsrör. Därefter ultracentrifug provet vid 100, 000x g och vid fyra grader celsius i två timmar, till pellet små EVs.Dekantera supernatanten och låt ultracentrifugeringsrören inverteras i fem till tio minuter och knackar ofta för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska på rörens sidor. Sedan, resuspend EV pelleten i 1,5 milliliter av 0,25 molar sackaros buffert. Täck rören med Parafilm, och sedan virvel eVs till lösning.Rock ultracentrifugrören i 10 till 15 minuter i rumstemperatur. Och sedan virvel en gång till. Kortfattat centrifugera rören med en hastighet som är mindre än 1, 000x g för att återvinna vätskefjädringen i botten av röret.Om det behövs, förvara fjädringen vid fyra grader varmt över natten. Lägg först till 1,5 milliliter 60 %iodixanol till 1,5 milliliter av sackarostriffertbufferten som innehåller elbilarna för att skapa en slutlig lösning som innehåller 30%iodixanol. Pipett upp och ner flera gånger för att blanda lösningen noggrant.Överför denna lösning till botten av ett 5,5 milliliter ultracentrifugationsrör. Blanda därefter 60%iodixanol-lagret med ultrarent vatten för att förbereda minst 1,5 milliliter av både en 20%och en 10%iodixanollösning. Med hjälp av en spruta och en 18 gauge nål, mäta 1,3 milliliter av 20%iodixanol lösning och försiktigt lager den ovanpå bottengradienten.Håll avfasning av nålen i kontakt med insidan av röret, strax ovanför menisken och tillsätt lösningen droppe klokt för att undvika att blanda lagren vid densitetsgränssnittet. Sedan, lager 1,2 milliliter av 10%iodixanol lösningen ovanpå 20%layer, med samma teknik. Noggrant balansera och belasta ultracentrifugeringsrören i rotorskopor.Ställ in accelerations- och decelerationshastigheterna för en svänghinksrotor till minimihastigheterna, och centrifug på 268, 000x g och vid fyra grader celsius i 50 minuter. Medan provet håller på att centrifugeras, etikett 10 1,5 milliliter mikrocentrifugrör för varje prov som kommer att motsvara fraktioner ett till 10 av densitetsgradienten. När centrifugeringen är klar tar du försiktigt bort rören från rotorskoporna och placerar dem i en stabil hållare.Pipett 10 seriefraktioner på 490 mikroliter från överkanten av lutningen till motsvarande rör. Med hjälp av en refraktometer, mät brytningsindexen för fraktionerna. Sedan, överför varje fraktion till en ren 12 milliliter ultracentrifugation röret.Tillsätt fem milliliter 1x PBS till varje rör och pipetten upp och ner långsamt för att blanda. Tillsätt ytterligare sex milliliter på 1x PBS till toppen av röret, och blanda försiktigt igen. Ultracentrifug rören på 100, 000x g och vid fyra grader celsius för att åter pellets de små vesiklar.Dekantera supernatanten och knacka rören torra innan du lyser vesiklarna för proteinanalys eller reresuspending eVs för morphologic analys. För att lysa EVs för proteinanalys, tillsätt 40 mikroliter av stark lysbuffert som innehåller proteashämmare till EV-pelletsen. Placera Parafilm över varje rör, och virvel kraftigt.Därefter rockar du rören i 20 minuter i rumstemperatur och virvel igen. Kortfattat centrifugera provet vid 1, 000x g i 30 till 60 sekunder för att återvinna hela provvolymen. Överför varje prov till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör, och förvara det vid en temperatur mellan 20 och 80 grader celsius tills det är klart för vidare bearbetning.För att förbereda de renade lysaterna för immunoblotanalys, tillsätt 5x Laemmli provbuffert till proverna för en slutkoncentration på 1x. Koka provet vid 95 grader varmt i fem till 10 minuter. Sedan, ladda en lika volym av fraktioner en till 10 i en 10%SDS sida gel.Ladda en lika stor massa av vävnads homogenat. Utför elektrofores och Western blot analys för att bekräfta EV proteiner i de renade lysates och jämföra relativa EV överflöd i fraktioner. I denna studie extraheras extracellulära vesiklar och renas från hela vävnaden.Efter ultracentrifugeringen av 10 till 30%iodixanolgradienten kan en population av lätta elbilar ses migrera upp till bråkdel två, medan en population av täta elbilar kan ses migrera upp till bråkdel fem, beroende på vävnadstyp. Representativa immunoblots av gradient fraktioner uppvisar effektiv separation och rening av små tumör härledda EVs i bråkdel fem. Noterbart, lungtumör exemplar visas berikas i tät EVs jämfört med lätta EVs som tidigare skördats från hela hjärnvävnaden.Representativ nano partikel spårning analys och elektronmikroskopi av vävnad-härledda vesiklar i den dominerande vesikel som innehåller fraktion visar anrikning och bevarande av hela vesiklar. Överensstämmer med den kända storleken och strukturen hos små EVs. Interstitiell EVs representerar lovande mål för utveckling av nya diagnostiska eller prognostiska biomarkör analyser.Denna teknik ger forskare med verktyg för utvinning och rening av vesicles för nedströms nytta. Efter extraktion av hel eller lyst vävnad EVs, bred karakterisering av vesikel inklusive proteomic, genomisk och lipidomic analyser kan utföras. Dessutom kan prover användas för mer riktade metoder.Vesiklar isolerade direkt från vävnad exemplar kan ge ytterligare insikt i sjukdomar mekanismer, inklusive tumör genesis, och kan ge viktiga diagnostiska eller prognostiska verktyg i framtiden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrofila extracellulära fällor som genereras av låg densitet neutrofiler erhållits från Peritoneal Lavage vätska medla tumör celltillväxt och fastsättning

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studera normal vävnad strålningseffekter med hjälp av extracellulära matrix hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade anhängare celler för Metabolomic analys av capillary Electrophoresis-masspektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering av exosomberikade extracellulära vesiklar som bär granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor från embryonala stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicitet Screening av tumör-härledda extracellulära vesicles av flöde cytometri av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Generera och avbilda mus- och humana epitelorganoider från normal och tumörbröstvävnad utan att passera

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

En anrikningsmetod för små extracellulära vesiklar härrörande från levercancervävnad

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Etablering av tumörorganoider och fibroblaster från bukspottkörtelcancer från färsk vävnad

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Cellfri DNA-extraktion av glaskropps- och kammarvattenprover för diagnos och övervakning av vitreoretinalt lymfom

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...