Name: extraction of extracellular vesicles from whole tissue
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Yazarlar Dr Richard Nowakowski ve sağlayan ve bu iletişim kuralı, saygıyla geliştirmek için kullanılan hayvanlar için bakım için Florida Devlet Üniversitesi laboratuvar hayvan kaynakları teşekkür ederiz. Biz aşağı akım vezikül karakterizasyonu yanı sıra FSU biyolojik bilim görüntüleme kaynak tesis için kullanılan kütle spektrometresi çalışma ile Xia Liu, Dr Rakesh Singh ve Florida Devlet Üniversitesi translasyonel bilim laboratuvarı yardım için teşekkür Transmisyon Elektron mikroskobu bu çalışmanın kullanımı. Son olarak, Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M Üniversitesi) Bu yöntem geliştirmede kullanılan tümör örneklerin bağış için teşekkürler. Bu çalışmada Florida Bölümü Sağlık Ed ve Ethel Moore Alzheimer hastalığı araştırma D.G.M. ve J.M.O (6AZ11) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası altında Ulusal Kanser Enstitüsü için ödül programı gelen hibe tarafından desteklenmiştir D.G.M. için verilen R01CA204621

Bütün beyin bakım Komitesi (IACUC) Florida State University ve kurumsal hayvan kullanım onayı ile elde edilmiştir. On iki fare beyni toplam (her yaş grubundan 3 beyin: 2, 4, 6 ve 8 ay) C57BL/6 J arka plan için EV çekimi, yukarıda açıklanan16olarak kullanılmıştır. Akciğer tümörü numuneler cömertçe Florida tarım ve mekanik Üniversitesi IACUC onay altında Dr Mandip Sachdeva tarafından bağışlandı. Akciğer tümörleri insan adenokarsinom hücre kültürünü immünyetmezl...

<ol>
	<li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+secretion:+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses.">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li><li>Th&#233;ry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis+and+function.">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases.">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers.">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li><li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+communication+goes+viral.">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer:+small+particle,+big+player.">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).</li><li>Janas, A. M., Sapo&#324;, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases.">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li><li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses.">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li><li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain.">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity.">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li><li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver.">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space.">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li><li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles.">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging,+Enhancement+of+Vesicle+Production,+and+Noncanonical+NF-.&#954;B+Signaling.">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.&#954;B Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li><li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis.">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy.">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li><li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions.">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li><li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExtraPEG:+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles.">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978 (2016).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180 (2011).</li><li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation.">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li><li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters+in+nanoscale+communication.">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li><li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncosomes+-+large+and+small:+what+are+they,+where+they+came+from.">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).</li></ol>

Çok bilimsel ilgi küçük EVs tümör microenvironment yanı sıra organ gelişimi, olgunlaşma ve işlev oynamak rolleri açısından oluşturuldu. Genel olarak, bu çalışmada olduğu gibi EVs çekme--dan tüm beyin veya tümör numuneler için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı sağlar. Burada biz sadece tümör kaynaklı akciğer EVs bu tekniğe uygulanabilirliği göstermek iken, bu yöntem kolayca daha fazla ex vivo karakterizasyonu olan küçük salgılanan veziküller dinleyicilere diğer sağlam dokul...

Küçük hücre dışı veziküller (EVs) endosomal elde edilen exosomes ve geniş Biyomedikal ilgi vardır küçük membran-döken microvesicles içerir. Küçük EVs 50-250 nm membran bağlı veziküller biyolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve topluca hastalığı işlemleri çok sayıda önemli rol oynarlar inanılıyor nükleik asitler içeren türdeş olmayan nüfusu oluşur. Araştırma ilerleyen özellikle bu veziküller nörodejeneratif ve prion hastalıkları, bulaşıcı süreçleri, otoimmün veya enflamatuar ve tümör büyümesini ve metastaz1,2,3 karıştığı , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Biyomedikal araştırma EVs önemini hastalık patogenezinde içine hızla yalıtım ve bu veziküller arınma için tekrarlanabilir ve titiz yöntemleri gelişmekte olan paralel faiz oluşturulan.
EV karakterizasyonu tarihsel ve güncel mücadelesine küçük EV altgrupları tamamen ayırmak için yetersizlik olmuştur. Bu büyük ölçüde farklı veziküller Biyogenez yöneten farklı moleküler mekanizmaları bizim sınırlı anlayış nedeniyle mücadeledir. Boyutu, yoğunluk ve biyolojik kargo daha fazla altgrupları arasında örtüşen bu farklılıklar convolutes. Bu sınama bir parçası da yaygın olarak zenginleştirme teknikleri farklı laboratuvarlar arasında tutarsızlık izole veziküller aşağı akım analizi sağlayan ve kategorik EV nüfus aydınlatmak için küresel çaba zayıflatmayı kullanımı olmuştur.
Bu EV karakterizasyonu çoğunluğu veziküller hayvan veya insan vücut sıvıları, plazma, idrar da dahil olmak üzere gelen yalıtmak için teknikleri açıklayan daha yeni içinde vivo çalışmalar ile hücre kültürü süpernatant, tüp bebek koleksiyonundan gerçekleştirildikten dikkati çekiyor ve tükürük. EVs büyük miktarlarda dolaşımda iken, aynı zamanda bu veziküller hücre hücre iletişim olaylarda önemli rol oynarlar ve hücresel doku interstitium içinde bulunan tanıdı. Kanser bağlamında, interstisyel EVs tümör microenvironment tohum kanser hücresi ve metastatik büyüme14,15için modüle özellikle önemli olabilir. Sonuç olarak, geliştirme ve optimizasyon teknikleri veziküller sağlam doku örnekleri ayıklamak için değeri vardır. Bu yöntemleri doğrudan organ - okumak için bir yol sağlar veya tümör küçük biyopsi ve kısmi veya tam organ rezeksiyonu da dahil olmak üzere Klinik numune--dan hasat EVs türetilmiş.
Bu çalışmada ve bizim laboratuvar16tarafından yayımlanan bir önceki rapor, biz birkaç önemli Şu anki endişelerini EV zenginleştirme yöntembilim amacı: 1) yalıtmak ve şu anda en yüksek standartlarda EVs arındırmak için bir tekrarlanabilir tekniğini tanımlamak için alanını kabul; 2) son derece endosomal elde edilen exosomes zenginleştirilmiş küçük EV altgrupları yalıtmak girişimi için; ve 3) bir iletişim kuralı üzerinden sağlam doku örnekleri daha fazla karakterizasyonu amacıyla bu veziküller çıkarma için sağlamak için.
Son zamanlarda, Kowal ve meslektaşları ayırmak ve EV altgrupları karşılaştırılabilir sükroz yoğunluk gradyanlar17daha büyük etkinlik ile arındırmak için nispeten küçük ölçekli iodixanol yoğunluğu degrade nitelendirdi. Atıf çalışmada, dendritik hücre kaynaklı EVs esir nispeten hafif yoğunluk kesir, 1.1 g/mL, bir yoğunluk ile tutarlı olarak son derece exosomes bu mevcut yüksek bir oran ile en tutarlı olduğuna inanılan endosomal proteinler zenginleştirilmiş kesir. Yazarlara göre bu "iyi niyetli" exosomal proteinler tümör duyarlılık gen 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 ve birkaç annexin proteinler17dahil. Daha sonra doku ayrılma Perez-Gonzalez ve ark18 ve bütün beyin kaynaklı EVs16izole etmek için bir sonraki fark Santrifüjü protokol tarafından açıklanan yöntemin başarılı olması için bu tekniği uyarlanmış. Biz de bu yöntemin aşağı akım nicel ve karşılaştırmalı kütle spektrometresi veziküler protein, daha önce bizim laboratuvar19tarafından açıklanan için sıralı bir protokol birleştirerek EV proteomes karakterize içinde gösterdi. Bu eser bu hangi beyin20frontal korteks EVs zenginleştirilmiş Hill laboratuvarından paralellik.
Bu çalışmada bu tekniği ayrıntılı ve son zamanlarda EVs izolasyonu sağlam akciğer tümörleri için bizim laboratuardan yayınlanan Protokolü uygulamayı genişletebilir. Bilgimizi, bu EVs üzerinden ex vivo tümör numuneler zenginleştirmek için iletişim kuralı tanımlamak için ilk çalışmadır. Yeni tanı Biyomarkörler ve tumorigenesis içindeki rollerine EVs yaygın ilgi göz önüne alındığında, bu yöntem büyük olasılıkla bilimsel araştırmacılar, giderek artan sayıda için değerli olacağını. Klinik bir bakış açısından, interstisyel EVs büyük tanı değeri, özellikle numuneler histolojik değerlendirme sınırlı nerede liman. Burada özetlenen Yöntem hastalığın patogenezinde önemli roller bunlar küçük ortaya çıkarmak yapılacak çalışmalar için önünü taze veya dondurulmuş hayvan veya insan cerrahi numuneler, üzerinden EVs hasat tekrarlanabilir bir tekniği için bir temel sağlayacaktır bizim umudumuz veziküller oynayabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1017px;" width="1017">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.45 &#181;m filter</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:176px;">28145-505</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">12 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5.5 mL ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">344057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Alix antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Calnexin antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-11397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD63 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Abcam</td>
			<td style="width:176px;">ab59479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-CD81 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Flotillin 2 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-25507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-HSC70 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-Syntenin-1 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-100336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">anti-TSG101 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:176px;">sc-7964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">DWK Life Sciences</td>
			<td style="width:176px;">885300-0015</td>
			<td>Loose-fit pestle (clearance of 0.889&#8211;0.165&#8239;mm) used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">EZQ protein quantification kit</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FA-45-6-30 rotor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820715006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">FEI CM120 Electron Microscope</td>
			<td style="width:183px;">TSS Microscopy</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">27171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HALT protease inhibitor (100x solution)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">78438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Hibernate E medium</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;">A1247601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">MLS-50 swinging-bucket rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">367280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NanoSight LM10</td>
			<td style="width:183px;">Malvern</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optima XE-100 ultracentrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Optiprep</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:176px;">D1556</td>
			<td>60% iodixanol in sterile water solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-goat IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">rabbit anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:183px;">Genetex</td>
			<td style="width:176px;">26728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Refracto 30PX (refractometer)</td>
			<td style="width:183px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:176px;">51324650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">S-4-104 rotor</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">5820759003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:176px;">333790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Tabletop 5804R centrifuge</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:176px;">22623508</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of extracellular vesicles from whole tissue

Dolaşımdaki ve interstisyel küçük membran bağlı hücre dışı veziküller (EVs) roman tanılama ya da prognostik biyomarker deneyleri geliştirilmesi için umut verici hedefleri temsil ve büyük olasılıkla a geniş tayf-in ilerleme önemli oyuncular olarak hizmet hastalıklar. EVs rolünü ateş, inflamasyon ve kanser gibi koşullardan patogenezinde daha iyi doku türlerini anlamak ve mevcut araştırma birden çok hücreden salgılanan veziküller karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır. Ancak, genel olarak tutarlı ve tekrarlanabilir teknikleri yalıtmak ve veziküller arındırmak için devam eden kalır. Ayrıca, sağlam doku ex vivo EVs, çıkarılması için yöntem pek açıklanmıştır. Burada, biz daha fazla karakterizasyonu için beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere bütün taze veya dondurulmuş dokular, ilgi küçük EVs çıkarma için detaylı bir protokol sağlar. Elektron mikroskobu ve veziküller immunophenotypic karakterizasyonu, hem de nicel kütle spektrometresi EV proteinlerin de dahil olmak üzere birden çok aşağı akım analizleri için bu yöntemin uyum göstermektedir.

Doku ayrılma, farklı aralıklarla ve veziküller degrade arıtma şematik bir bakış Şekil 1' de görüntülenir. Degrade saf EVs morfolojik ve immunophenotypic onay Şekil 2' de vurgulanır. Tekrarlanabilir yoğunlukları ultrasantrifüj % 10-30 iodixanol geçişin aşağıdaki diyagram, yukarı doğru kesir 2 (açık EVs) ve kesir 5 (yoğun EVs), geçiş iki ayrı vezikül nüfus ile doku türü bağımlı gösterilir. Degr...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue at JoVE.com

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Bu protokol, alt akım ex-vivo analizleri için tüm doku örneklerinden küçük hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve izolasyonu için titiz ve tekrarlanabilir bir teknik sağlar. Şu anda ulaşılabilir saflık en yüksek düzeyleri arasında, Bu yöntem tümörler de dahil olmak üzere çeşitli doku örnekleri içine salgılanan interstisyel veziküller doğrudan morfolojik, immünohenotipic ve derin karakterizasyon kolaylaştırır. Burada, doku EVs beyin ve akciğer tümör örneklerinden izolasyon göstermek.Ancak, bu teknik çeşitli kullanarak çalışmalara uygulanabilir, iyi huylu, veya diğer tümör örnekleri de. Başlamak için, her 0,4 ila 1,0 gram doku için Hazırda Bekletme-E ortamda 10 mililitre ayrışma tamponu hazırlayın. 50 mililitrelik bir tüp tampon için tüm taze veya dondurulmuş doku ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 derece santigrat sıcak su banyosunda kuluçka.Bundan sonra, dissosiasyon tampon son 1x konsantrasyonu için proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin. Gevşek bir uyum homogenizer içine doku ile çözelti dökün. Dokuyu hafifçe ayrıştırmak için numune başına yaklaşık 30 yavaş vuruş kullanın.Daha sonra, 50 mililitrelik konik tüp için ayrışmış doku ve tampon çözeltisi aktarın. 500x g ve dört derece santigrat beş dakika hücre ve kalan lifler veya uyumlu doku parçaları pelet için santrifüj. Süpernatant'ı temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve 2, 000x g'de ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca büyük hücresel enkazı atın.Temiz bir 50 mililitre konik tüp bu supernatant aktarın, ve santrifüj 10, 000x g ve dört derece santigrat 40 dakika herhangi bir istenmeyen büyük veziküller veya küçük apoptotik organları pelet. Süpernatant'ı 0,45 mikrometrelik bir filtreden temiz 12 mililitrelik ultrasantrifüj tüpüne boşaltın. Daha sonra, ultracentrifuge örnek 100, 000x g ve dört derece santigrat iki saat boyunca, küçük EVs pelet.Supernatant decant ve ultracentrifugation tüpleri beş ila 10 dakika ters bırakın, tüplerin yanlarında herhangi bir kalıntı sıvı kaldırmak için sık sık dokunarak. Daha sonra, 0,25 molar sakaroz tampon 1,5 mililitre EV pelet resuspend. Tüpleri Parafilm ile kapatın ve evs'i çözeltiye sokun.Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika ultracentrifuge tüpleri sallayın. Ve sonra girdap bir kez daha. Kısaca tüpleri 1,000x g'den daha düşük bir hızda santrifüj edin ve tüpün altındaki sıvı süspansiyonu geri edin.Gerekirse, süspansiyonu bir gecede dört derece saklayın. İlk olarak, % 30 iodixanol içeren nihai bir çözüm oluşturmak için EVs içeren sakaroz tris tampon 1.5 mililitre% 60 iodixanol 1.5 mililitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı birkaç kez iyice çözelti karıştırmak için.Bu çözeltiyi 5,5 mililitrelik ultrasantrifüj tüpünün dibine aktarın. Daha sonra, ultra saf su ile % 60 iodixanol stok karıştırın hem% 20 ve% 10 iodixanol çözeltisi en az 1,5 mililitre hazırlamak için. Bir şırınga ve 18 gauge iğne kullanarak, ölçü 1.3 mililitre 20%iodixanol çözeltisi ve dikkatle alt degrade üstüne katman.İğnenin yamacını tüpün içiyle temas halinde tutun, menisküsün hemen üzerinde ve yoğunluk arabirimindeki katmanları karıştırmamak için çözelti yitirme yi ekleyin. Daha sonra, katman 1.2 mililitre 10% iodixanol çözeltisi% 20 tabaka üstüne, aynı tekniği kullanarak. Ultracentrifugation tüplerini rotor kovalarına dikkatlice dengeleyin ve yükleyin.Bir salıncak kovarotorunun hızlanma ve yavaşlama hızlarını minimum hızlara ayarlayın ve santrifüjü 268, 000x g ve 4 derece santigrat derecede 50 dakika ayarlayın. Örnek santrifüj edilirken, yoğunluk degradesinin 1'den 10'una kadar kesirlerle karşılık gelecek her numune için 10 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri etiketle. Santrifüj tamamlandıktan sonra, tüpleri rotor kovalarından hafifçe çıkarın ve sabit bir tutucuya yerleştirin.Pipet 10 seri fraksiyonları 490 mikrolitre degrade nin üstünden ilgili tüplere. Bir refraktometre kullanarak, kesirlerin kırılma indekslerini ölçün. Sonra, temiz bir 12 mililitre ultracentrifugation tüp her kesir aktarın.Her tüp ve pipet yukarı ve aşağı yavaş yavaş karıştırmak için beş mililitre 1x PBS ekleyin. Tüpün üst kısmında 1x PBS ek altı mililitre ekleyin ve dikkatlice tekrar karıştırın. Ultracentrifuge tüpler 100, 000x g ve dört derece santigrat küçük veziküller yeniden pelet.Protein analizi için vezikülleri eritmeden veya morfolojik analiz için EVs'leri yeniden sumadan önce süpernatantı dekantın ve tüpleri kurutun. EVs protein analizi için lyse için, EV peletproteaz inhibitörü içeren güçlü lysis tampon 40 mikrolitre ekleyin. Parafilm'i her tüpün üzerine yerleştirin ve girdap ları şiddetle yerleştirin.Sonra, tekrar oda sıcaklığında ve girdap 20 dakika tüpleri sallayın. Numunenin tamamını kurtarmak için numuneyi 30 ila 60 saniye boyunca 1,000x g'de kısaca santrifüj edin. Her numuneyi yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve daha fazla işleme hazır olana kadar 20 ila 80 santigrat derece arasında bir sıcaklıkta saklayın.İmmünoblot analizi için saflaştırılmış lysates hazırlamak için, 1x son konsantrasyon için numunelere 5x Laemmli örnek tampon ekleyin. Numuneyi 95 derecede 5-10 dakika kaynatın. Daha sonra, 10% SDS sayfa jel içine kesirler 1 ile 10 eşit hacimli yükleyin.Eşit miktarda doku homojenate yükleyin. Saflaştırılmış lizatlarda EV proteinlerini doğrulamak ve kesirlerde göreceli EV bolluğunu karşılaştırmak için elektroforez ve Batı leke analizi yapın. Bu çalışmada, ekstrasellüler ayıklanır ve tüm dokudan saflaştırılır.%10-30 iodixanol degradesinin ultrasantrifüjünün ardından, ışık lı EV popülasyonunun ikinci kesire kadar göç etmesi görülürken, doku tipine bağlı olarak yoğun EV popülasyonunun beş kesire kadar göç yaptığı görülebilir. Degrade fraksiyonlarının temsili immünoblots fraksiyonu 5 küçük tümör türemiş EVs verimli ayırma ve saflaştırma sergiler. Özellikle, akciğer tümörü örnekleri daha önce tüm beyin dokusundan hasat edildi ışık EVs ile karşılaştırıldığında yoğun EVs zenginleştirilmiş görünür.Temsili nano partikül izleme analizi ve fraksiyon içeren baskın vezikül doku kaynaklı veziküllerin elektron mikroskobu tüm veziküllerin zenginleşmesini ve korunmasını göstermektedir. Küçük EV'lerin bilinen boyutu ve yapısıyla tutarlıdır. Interstisyel EVs yeni tanı veya prognostik biyomarker tahlilleri gelişimi için umut verici hedefleri temsil eder.Bu teknik, araştırmacılara veziküllerin aşağı akım için çıkarılması ve saflaştırılması için araçlar sağlar. Tüm veya lysed doku EVs çıkarılmasından sonra, proteomik dahil veziküllerin geniş karakterizasyonu, genomik, ve lipidomik analizler yapılabilir. Ayrıca, örnekler daha hedefli yaklaşımlar için kullanılabilir.Doğrudan doku örneklerinden izole edilen veziküller, tümör oluşumu da dahil olmak üzere hastalık mekanizmaları hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir ve gelecekte önemli tanısal veya prognostik araçlar sağlayabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Ekstrasellüler matris Hidrogeller kullanarak normal doku radyasyon etkileri eğitim

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücrelerden Granülosit-Makrofaj Kolonisi Uyarıcı Faktör Taşıyan EkzozomLa Zenginleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts from Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue (Video) | JoVE 

Taze dokudan pankreas kanseri kaynaklı tümör organoidlerinin ve fibroblastların oluşturulması

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Diagnosis of Vitreoretinal Lymphoma Using Cell-Free DNA

Cell-Free DNA Extraction of Vitreous and Aqueous Humor Specimens for Diagnosis and Monitoring of Vitreoretinal Lymphoma

Advancing VRL Diagnosis Using Cell-Free DNA Extraction from Vitreous Humor (Video) | JoVE

Vitreoretinal Lenfoma Tanı ve İzlemi için Vitreus ve Sulu Mizah Örneklerinin Hücresiz DNA Ekstraksiyonu

Vitreoretinal lymphoma (VRL) represents an aggressive lymphoma, often categorized as primary central nervous system diffuse large B-cell lymphoma. To ...