Name: a high-throughput assay to assess and quantify neutrophil extracellular trap formation
Uploaded: 2019-01-29T15:00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation at JoVE.com

Il lavoro di Eline J. Arends e Y.K. Onno Teng è supportato dalla Fondazione olandese Rene (17OKG04), Clinical Fellowship da organizzazione olandese per la ricerca scientifica (90713460). Lavoro di Laura S. van Dam è sostenuto dalla Fondazione per la ricerca in reumatologia (FOREUM).

Tutti i pazienti ed i comandi sani ha acconsentito a partecipare la Biobanca LUMC. Entrambi gli studi di biobanking sono stati approvati dal comitato etico LUMC.
1. isolamento dei neutrofili sani
<ol><li>Ottenere 20 mL di sangue periferico da un donatore sano in due provette sensibilizzate con EDTA di 10 mL.</li>
	<li>Mettere 10 mL di sangue in una provetta sterile 50 mL e aggiungere tamponato fosfato salino (PBS) fino a 32,5 mL.</li>
	<li>
Aggiungere il gradiente di densità (ad esempio., Ficoll-amidotrizoaat) sotto le celle.
	<ol>
<li>Richiedere fino 14 mL di densità gradiente con una pipetta da 10 mL e dispensare controller.</li>
		<li>Inserire la pipetta sul fondo del tubo 50 mL.</li>
		<li>Prendere il controller di dispensare fuori la pipetta, permettendo il gradiente di densità di fluire fuori la pipetta dalla forza di gravità fino a quando il massimo è raggiunto dall'effetto capillare (1-2 mL sarà lasciato), senza utilizzare il motore.</li>
		<li>Rimuovere la pipetta mettendo un pollice sopra la pipetta, impedendo il gradiente di densità di fuoriuscire durante la rimozione della pipetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Girare i tubi per 20 min a 912 x g e a temperatura ambiente (RT) senza accelerazione o freno. Nota: Globuli rossi (RBC) e neutrofili hanno un'alta densità e sono nella parte inferiore del tubo 50 mL. Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) sono separati e sopra il gradiente di densità come un anello bianco. Al plasma diluito in PBS sarà sopra i PBMC. Se necessario, possono essere isolati PBMCs trasferendo l'anello bianco per un nuovo tubo da 50 mL con ulteriori lavaggi con PBS.</li>
	<li>Rimuovere con cautela l'anello bianco contenente PBMCs in primo luogo, seguito da rimozione del plasma diluito in PBS e, infine, il livello di sfumatura di densità per quanto possibile.</li>
	<li>
Per isolare i neutrofili dal mix dei neutrofili/eritrociti, lisare gli eritrociti di freddo di acqua distillata sterile.
	<ol>
<li>Prendere la bottiglia di acqua distillata sterile fredda e un 10x concentrato boccetta di PBS dal frigo.</li>
		<li>Lavorare velocemente per questo passaggio. Aggiungere 36 mL di acqua distillata sterile fredda direttamente sopra il pellet e mescolare una volta attentamente. Aggiungere 4 mL di PBS 1x 10 dopo 20 s per fare una soluzione isotonica. Mescolare una volta attentamente.</li>
		<li>Girare il tubo per 5 min a 739 x g e a 4 ° C (per la rimozione dei globuli rossi). Neutrofili sarà la pallina bianca.</li>
		<li>Attentamente e scartare il surnatante. Eseguire nuovamente il passaggio 1.6.2 e assicurarsi che il pellet è sospeso correttamente.</li>
		<li>Girare il tubo per 5 min a 328 x g e 4 ° C.</li>
		<li>Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di PBS. Contare i neutrofili e tenerli sul ghiaccio. Nota: Rendimento atteso da 1 provetta di sangue (10 mL) è di circa 15 milioni i neutrofili.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rosso fluorescente cella etichettatura dei neutrofili
<ol><li>Fare una sospensione del neutrofilo dei neutrofili 10 milioni in 2 mL di PBS in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Fare una soluzione di 2 mL di PBS con 4 µ l del linker di cella fluorescente rosso 2 µM (Vedi Tabella materiali) in un tubo diverso da 15 mL. Aggiungere questo delicatamente alla sospensione del neutrofilo e mescolate con cura.</li>
	<li>Incubare al buio per esattamente 25 min a 37 ° C per etichettare i neutrofili con il linker rosso fluorescente cella.</li>
	<li>Inattivare l'etichettatura con l'aggiunta di terreno RPMI 1640 contenente 10% calore inattivato siero bovino fetale (FCS) presso RT fino a 15 mL e mescolare una volta attentamente. Assicurarsi che il pellet è risospeso attentamente se si è formata una pallina.</li>
	<li>Girare il tubo per 5 min a 328 x g e RT.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di fenolo rosso privo RPMI 1640 Media contenente FCS 2% e 10% P/S a RT. contare i neutrofili. Nota: Una perdita di cellule del 50% può verificarsi dopo l'etichettatura fluorescente rosso cellulare.</li>
</ol>3. l'induzione della formazione di trappola extracellulari del neutrofilo
<ol><li>Fare una sospensione di cellule di 0,42 x 106 cellule/mL di fenolo rosso gratis RPMI 1640 Media contenente 2% FCS e 10% P/S.</li>
	<li>Aggiungere 37.500 neutrofili in 90 µ l per pozzetto in un piatto nero 96 pozzetti, fondo piatto.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l dello stimolo selezionato (ad es., sieri del paziente) in triplice copia per raggiungere una concentrazione del 10% nel pozzo. Includere sempre un controllo negativo (medio) in triplice copia.</li>
	<li>Incubare al buio a 37 ° C per il tempo desiderato, che vanno da 30 min a 2, 4 o 6 h. Incubare per 4 h è suggerito.</li>
	<li>Calcolare il volume necessario di aggiungere 25 µ l di 5 µM impermeabile DNA tingere (Vedi Tabella materiali), per raggiungere una concentrazione finale di 1 µM nel pozzo. Fare un pre-diluizione se necessario in RPMI 1640 Media contenente 2% FCS e 10% P/S per ottenere una concentrazione di 5 µM.</li>
	<li>Aggiungere 25 µ l di colorante di 5 µM impermeabile DNA 15 min prima della fine del tempo di incubazione. Continuare a incubazione per un altro 15 min a 37 ° C al buio.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante (~ 125 µ l) molto attentamente e conservarlo se necessario. Aggiungere 100 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA). Tenere all'oscuro e immediatamente continuare con il passaggio 4.</li>
</ol>4. netto visualizzazione con microscopia confocale immunofluorescenza ad alto contenuto, ad alta risoluzione 3D
<ol><li>
Configurare le impostazioni sul microscopio confocale immunofluorescenza cliccando sull'installazione di acquisizione.
	<ol>
<li>Fare clic sulla scheda Configura .</li>
		<li>Selezionare l'obiettivo e la fotocamera. Scegliere l'obiettivo 10 X Apo Lambda con una modalità di acquisizione di un foro stenopeico confocale 60 µm.</li>
		<li>Fare clic su e scegliere la piastra 96 pozzetti plastica. Selezionare i siti da visitare e scegliere un numero fisso di siti. Riempire a 3 colonne e 3 righe senza sovrapposizione (0 µm), che coprono un totale di 45% del pozzo.</li>
		<li>Fare clic su acquisizione. Selezionare Abilita basati su Laser messa a fuoco. Se necessario, selezionare Acquisire Z serie/Time Series .</li>
		<li>Fare clic sul sito Autofocus.<ol>
<li>Fare clic su Focus sulla piastra inferiore | Off-Set per spessore del fondo. Per il pozzo iniziale di trovare l'esempio, scegliere il primo bene acquisito. Per l'autofocus di sito, scegliere tutti i siti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fare clic su lunghezze d'onda.<ol>
<li>Per il numero di lunghezze d'onda, scegliere 2. Per il livello di raffinatezza di correzione ombreggiatura TL, scegliere 2.</li>
			<li>Per lunghezza d'onda 1, selezionare Texas Red.<ol>
<li>Per le opzioni di messa a fuoco automatica, laser selezionare con offset Z, post laser offset 1.1 µm. uso Z-stack con una gamma personalizzata di 200-10.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Per lunghezza d'onda 2, selezionare FITC.<ol>
<li>Per le opzioni di messa a fuoco automatica, selezionare laser con offset Z da w1 0 µm. uso Z-stack con una gamma personalizzata di 200-10.</li>
				<li>Per le opzioni di acquisizione, selezionare serie Z e proiezione 2D immagine massima. Per le opzioni di acquisizione, selezionare Correzione Shading | Fuori.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selezionare serie Z. Selezionare il numero di passi: 10. Selezionare la dimensione del passo: 3 mm (gamma totale sarà 27 µm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mettere la piastra nella microscopia di immunofluorescenza confocale.
	<ol>
<li>Fare clic sulla scheda esecuzione .<ol>
<li>Compila piastra nome e Descrizione e scegliere il percorso di archiviazione.</li>
			<li>Selezionare i pozzi che devono essere acquisite.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scegli tempo di esposizione per Texas Red e FITC.</li>
	<li>Fare clic su Piastra di acquisire per avviare l'acquisizione, che avrà circa 1h per piastra.</li>
</ol>5. analisi della formazione netta
<ol><li>Utilizzare un programma progettato per l'analisi di immagini multidimensionali scientifiche (Vedi Tabella materiali) per analizzare la formazione netta di elaborazione delle immagini.</li>
	<li>Trasferire i dati di immagine acquisiti a un disco rigido separato.</li>
	<li>
Selezionare il colore, l'aggiunta di strumento.
	<ol>
<li>Selezionare w1 e scegliere la cartella in cui sono archiviati i dati sul disco rigido.</li>
		<li>Selezionare w2 e scegliere la cartella in cui sono archiviati i dati sul disco rigido. Nota: Utilizzare una macro standard che utilizzi w1 nel nome del file per aggiungere il colore rosso per le immagini di Texas Red e w2 per aggiungere colore verde per le immagini FITC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selezionare Analisi Macro.
	<ol>
<li>Selezionare w1, scegliere il valore di soglia (soglia di intensità), che di solito è 10. Selezionare il valore di pixel desiderato (soglia di dimensioni, ad esempio, 100).</li>
		<li>Selezionare w2, scegliere il valore di soglia (soglia di intensità), che di solito è 10. Selezionare il valore di pixel desiderato (soglia di dimensioni, ad esempio, 500).</li>
		<li>Scegliere la destinazione per il file di foglio di calcolo, eseguire analisi e salvare i file di registro in seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare i dati in un foglio di calcolo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection.">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases?.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases?.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li><li>Garcia-Romo, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+are+major+inducers+of+type+I+IFN+production+in+pediatric+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus.</a> Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20 (2011).</li><li>Lande, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+activate+plasmacytoid+dendritic+cells+by+releasing+self-DNA-peptide+complexes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus.</a> Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19 (2011).</li><li>Meng, H., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Role+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Antiphospholipid+Antibody-Mediated+Venous+Thrombosis.">In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).</li><li>Desai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particles+of+different+sizes+and+shapes+induce+neutrophil+necroptosis+followed+by+the+release+of+neutrophil+extracellular+trap-like+chromatin.">Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin.</a> Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003 (2017).</li><li>Desai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PMA+and+crystal-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+involves+RIPK1-RIPK3-MLKL+signaling.">PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling.</a> European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).</li><li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases.">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. , (2018).</li><li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+detection+and+quantification+of+neutrophil+extracellular+traps+reveals+ROS-independent+NET+release+with+immune+complexes.">A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes.</a> Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Nakazawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+formation+and+disordered+regulation+of+NETs+in+myeloperoxidase-ANCA-associated+microscopic+polyangiitis.">Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis.</a> Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).</li><li>Konig, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>von K&#246;ckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+calf+serum+contains+heat-stable+nucleases+that+degrade+neutrophil+extracellular+traps.">Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps.</a> Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).</li><li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+ANCA-associated+vasculitis+is+independent+of+ANCA.">Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA.</a> Kidney International. , (2018).</li><li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NET-effect+of+combining+rituximab+with+belimumab+in+severe+systemic+lupus+erythematosus.">The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus.</a> Journal of Autoimmunity. , (2018).</li><li>Hahn, J., Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+resolve+inflammation+by+proteolysis+of+cytokines+and+chemokines+and+protection+from+antiproteases.">Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases.</a> The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La parte più critica di questo test è la necessità di utilizzare i neutrofili appena isolati per ogni esperimento perché i neutrofili sono di breve durati e morire quando congelati. Ciò richiede un donatore sano ogni volta, che potrebbe implicare alcune variazioni a causa di caratteristiche del donatore. Una di queste variazioni è lo stato di attivazione dei neutrofili. Neutrofili potrebbero essere attivati già in vivo prima dell'isolamento. Inoltre, i neutrofili possono essere attivati durante la procedura di isolamento in particolare durante la lisi degli eritrociti, pertanto un gestore con esperienza di neutrofili è necessaria per ridurre al minimo l'attivazione dei neutrofili. In generale, isolamento dei neutrofili dovrebbe essere effettuato appena possibile dopo il disegno del sangue e l'esperimento non dovrebbe essere messo in pausa per evitare eccessiva attivazione spontanea. In secondo luogo, dovrebbe essere evitato il trattamento approssimativo dei neutrofili. Come tale, il vantaggio notevole del protocollo descritto è i pipettaggio interventi minimi, una volta che i neutrofili sono seminati in una piastra a 96 pozzetti. D'importanza, lo stato di attivazione dei neutrofili è preferibile valutare nella condizione non stimolata, in cui questa analisi sensibile può rilevare i bassi livelli di formazione netta. Un altro fattore che potrebbe influenzare il test è l'uso di FCS nel mezzo. La percentuale di FCS è stato ridotto dal 10% al 2% per evitare la possibile soppressione di formazione netta da attività antiossidante19,20 o l'eventuale attivazione dei neutrofili nonostante inattivazione termica. Cultura senza FCS o con l'uso di diversi tipi di media non è stato provato. Un controllo non stimolato o medio è sempre portato quando si esegue il test per avere un'indicazione del segnale sfondo (ad esempio, stato di attivazione dei neutrofili). L'aumento di piega per ogni stimolo rispetto al campione non stimolato è visualizzato per ottenere risultati coerenti nel corso di diversi esperimenti utilizzando lo stesso stimolo.
Un fattore importante per un possibile fondo elevato sta macchiando di DNA extracellulare che è correlato al processo di formazione netta. Il presente saggio tenta di ridurre questo rimuovendo la macchiatura del DNA extracellulare immediatamente dopo il periodo di incubazione breve di 15 min e analizzando la piastra direttamente dopo la fissazione. Pertanto, è essenziale utilizzare un microscopio confocale avanzato che ha abbastanza velocità e potenza di analisi per catturare la piastra a 96 pozzetti entro 1 a 2 h. automatizzato impostazione del tempo di esposizione e messa a fuoco è consigliata. Come tale, l'impostazione di microscopio può variare tra ogni campione e sperimentare per quanto riguarda la soglia di intensità di colore che è necessaria per una qualità immagine ottimale nel complesso. Le influenze di quest'ultime la possibilità eventuale di quantificare correttamente i neutrofili e le reti e l'impostazione ottimale dovrebbe pertanto essere confermato utilizzando campioni di controllo multipli (per esempio, del siero di controlli sani). Durante l'analisi delle immagini catturate, l'uso di una soglia in pixel e la soglia di dimensioni nel programma di analisi permette una migliore selezione di formazione netta.
DNA extracellulare derivata dalla formazione netta può essere il risultato delle vie di morte distinte, tra cui NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis o anche non litico processo di formazione netta vitale1. Come tale, una limitazione del presente saggio è che dalla macchiatura solo per DNA extracellulare non c'è alcuna differenziazione possibile fra formazione netta ed altre vie di morte cellulare pertinenti. È possibile ottenere questo risultato utilizzando entrambi gli inibitori selettivi delle vie di morte distinti per discriminare tra le diverse forme che alla base della formazione netta o confermare di immunostainings separata la presenza di specifici marcatori di netto, come citH3 e NE, co-localizzati con DNA. La co-localizzazione di DNA extracellulare con citH3 e NE è stata recentemente confermata per questo dosaggio10. Il vantaggio di evitare netti marcatori specifici per questo test, permette di valutare tutte le forme di formazione netta che conduce all'estrusione di DNA dai neutrofili più completa e più obiettiva possibile con il potenziale di high throughput screening. L'applicabilità del presente protocollo è stato indicato nello studio di basso livello netto induzione mediata da immunocomplessi nella malattia autoimmune in cui la capacità di rilevare differenze qualitative e quantitative potrebbe essere più importante rispetto al tipo di processo coinvolti10,21,22. Dimostrazione del fatto che questo saggio romanzo quantificazione netto può essere di valore aggiunto per i diversi ricercatori a studiare vari aspetti della formazione netta. Piccoli aggiustamenti di dosaggio vengono facilmente implementate: regolazione del periodo di stimolazione, l'uso di un marcatore netto favorito di concentrarsi sulla via di una morte specifici che portano alla formazione di netto, l'uso di un ingrandimento diverso o l'uso di criteri diversi netti in la quantificazione e l'analisi.
In conclusione, il protocollo fornito è un saggio ampiamente applicabile altamente sensibile per la quantificazione semiautomatizzata di formazione netta per la valutazione dell'induzione ex vivo di reti su stimoli diversi.

La formazione di trappole extracellulari del neutrofilo (reti) è il processo in cui i neutrofili rilasciare il loro DNA in un web di (3D) tridimensionale extracellulare come struttura, complessato con una vasta gamma di molecole antimicrobiche e pericolosi, granulare e gli enzimi citoplasmatici, peptidi e proteine. Queste strutture immunogeniche e tossiche hanno un ruolo fisiologico importante nella difesa immunitaria innata di individui sani di cattura e uccisione patogeni infettivi1. Tuttavia, inoltre sono stati dimostrati per essere coinvolti nella trombosi2 e varie malattie autoimmuni sistemiche, tra cui gli anticorpi citoplasmici del anti-neutrofilo (ANCA)-associato vasculite (AAV)3, lupus eritematoso sistemico (SLE )4,5, sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS)2,6, artrite reumatoide (RA), psoriasi e gotta7,8,9.
Formazione in vitro di netto è stata ampiamente studiata con il composto chimico di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), che induce la massiccia formazione netta. Tuttavia più stimoli fisiologici inducono livelli molto più bassi di formazione netta10. Studio NET-trigger in, ad esempio, un'impostazione di malattia autoimmune, un dosaggio quantitativo standardizzato, sensibile, ad alta produttività è necessario per rilevare e quantificare la formazione netta. Quantificazione delle reti ha dimostrato di essere impegnativo e attualmente viene eseguita con metodi diversi, ognuno con i propri vantaggi e limitazioni11. Un metodo comunemente usato è la rilevazione di DNA nei surnatanti12, che è obiettivo ma non discrimina tra l'origine del DNA (apoptosi, necrosi, reti) e pertanto non è molto specifico per le reti. In secondo luogo, l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISAs) di DNA-complessato con proteine NET-specifico, ad esempio, mieloperossidasi (MPO) o elastasi del neutrofilo (NE), sono un approccio più specifico per rilevare reti e sono state dimostrate per correlano bene con citrullinato reti positivo istone-3 (CitH3)13. Tuttavia, non è noto se questo metodo è abbastanza sensibile per raccogliere tutte le reti (per esempio, MPO, NE e CitH3 negative reti). Un terzo approccio è microscopia di immunofluorescenza che viene utilizzata per rilevare co-localizzazione di molecole NET-associate (NE, MPO, CitH3) con il DNA extracellulare per quantificare le reti. Questo metodo è in genere specifico per le reti, ma non può essere applicato come un metodo di alto-rendimento e non è obiettivo a causa di pregiudizi di osservatore. Inoltre, questo metodo non prende in considerazione MPO-, NE-, le reti di CitH3-negativi che sono frequentemente presenti a seconda le usate NET-grilletto14,15. Approcci di flusso cytometry rilevano reti attraverso una dispersione avanti/lateralmente modificata (FSC/SSC) che indica il gonfiore del nucleo in NET-ting neutrofili16. Questo metodo non prende in considerazione le diverse forme di formazione netta che sono stati identificati, che non potrebbe comportare gonfiore del nucleo, come formazione netta vitale17. Infine, la microscopia di immunofluorescenza confocale è stata applicata per visualizzare e quantificare la formazione netta macchiando direttamente il DNA extracellulare con un colorante cellulare impermeabile che macchie extracellulare DNA12,18. In genere, 5 per 10 campi ad alta potenza sono manualmente selezionati e valutati, che copre 1-5% di ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti11,17. Selezione manuale delle immagini non è sempre obiettiva, incline a pregiudizi e non attraente per analisi di alto-rendimento. Un test automatizzato, alto-rendimento netto quantificazione è stato recentemente sviluppato, che imaged 11% del pozzo in modo 3D che copre 13 µm attraverso microscopia confocale immunofluorescenza Z-impilati, determinando così una tecnica altamente sensibile per valutare le reti rispetto ai metodi convenzionali10. Il rapporto corrente descrive il protocollo più recente per quantificare la formazione netta attraverso un'analisi automatizzata, altamente sensibile usando microscopia confocale 3D, che raggiunge una superficie totale di imaged del 45% di ciascun pozzetto e copre 27 µm attraverso Z-stack. Questo protocollo è adatto per quantificare, con una sensibilità elevata, bassi livelli di formazione netta in modo obiettivo e imparziale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aqua Sterile H2O</td>
			<td>B. Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>12604052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Bodinco, Alkmaar, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td>Used in high concentrations it could influcence NET formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 5,7% - amidotrizoaat 9% density 1,077 g / mL</td>
			<td>LUMC, Leiden, The Netherlands</td>
			<td>97902861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunofluorescence confocal microscope</td>
			<td>Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutralization PBS (10x)</td>
			<td>Gibco, Paisley, UK</td>
			<td>70011-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / streptomycin (p/s)</td>
			<td>Gibco, Paisley, UK</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free RPMI 1640 (1x)</td>
			<td>Gibco, Paisley, UK</td>
			<td>11835-063</td>
			<td>Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>B. Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>174628062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26 2 uM Red fluorescent cell linker</td>
			<td>Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA</td>
			<td>PKH26GL-1KT</td>
			<td>PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program for scientific multidimensional images analysis</td>
			<td>ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (1x)</td>
			<td>Gibco, Paisley, UK</td>
			<td>52400-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye</td>
			<td>Gibco, Paisley, UK</td>
			<td>57020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0,4%</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>17942E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate</td>
			<td>Falcon, NY, USA</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput assay to assess and quantify neutrophil extracellular trap formation

Trappole extracellulari del neutrofilo (reti) sono strutture di DNA extracellulare immunogenici che possono essere rilasciati dai neutrofili su una vasta gamma di trigger. Le reti sono state dimostrate per servire come un meccanismo di difesa importante ospite che intrappola e uccide i microrganismi. D'altra parte, sono stati implicati in varie malattie autoimmuni sistemiche. Le reti sono strutture immunogeniche e tossiche contenenti un pool di autoantigeni rilevanti, tra cui gli anticorpi citoplasmici del anti-neutrofilo (ANCA)-associated vasculitis (AAV) e lupus eritematoso sistemico (Les). Diverse forme di reti possono essere indotta a seconda dello stimolo. La quantità di reti può essere quantificata utilizzando diverse tecniche, compresa la misurazione del rilascio di DNA in surnatanti, misurazione del DNA-complessato con NET-molecole come mieloperossidasi (MPO) o elastasi del neutrofilo (NE), misurare la presenza di citrullinato istoni di microscopia a fluorescenza, o rilevamento di cytometric di flusso di NET-componenti che tutti hanno caratteristiche diverse per quanto riguarda la loro specificità, sensibilità, obiettività e quantità. Qui è un protocollo per quantificare ex vivo NET formazione in un modo altamente sensibili, ad alta velocità mediante microscopia confocale in immunofluorescenza tridimensionale. Questo protocollo può essere applicato per risolvere varie domande di ricerca sulla formazione netta e degrado nella salute e nella malattia.

Formazione del neutrofilo trappola extracellulare (NET) è quantificato in modo 3D quantificando macchiato DNA extracellulare sopra 10 Z-stack con 3 µm distanza partendo al piano focale in ciascun pozzetto. Misurando l'area cumulativo, la sensibilità degli aumenti di dosaggio (Figura 1A). I neutrofili isolati hanno una purezza media di 98,7% con deviazione standard (SD) di 1,10% misurata in 14 diversi campioni da diversi isolamenti. La percentuale media dei globuli rossi è 1,04% ± 1,1% SD e la percentuale media dei monociti è 0,085% ± 0,17% SD (dati non mostrati). La superficie totale dei neutrofili macchiati imaged sono quantificati solo nel piano focale in ciascun pozzetto, che correlano significativamente con il conteggio del neutrofilo totale in ciascun pozzetto con un coefficiente di correlazione di Pearson di 0,99 (95% intervallo di confidenza [CI] 0.985-0.997, p < 0,0001) (Figura 1B). Il risultato rappresentativo di quantificazione di formazione netta nei neutrofili stimolati con 10% siero dei pazienti AAV o media (MED) come controllo negativo, espresso come zona di DNA extracellulare macchiata cumulativo oltre 10 Z-stack per ogni immagine del neutrofilo (Figura 1 C). le istantanee delle immagini rappresentative dei neutrofili non stimolati (Figura 2A) e di reti AAV-stimolata dei neutrofili (Figura 2B) sono visualizzate.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig1.jpg"> Figura 1: quantificazione di formazione netta misurando DNA extracellulare e conteggio del neutrofilo. (A) zona è quantificata cumulativamente gli 10 Z-stack per ogni bene per i neutrofili non stimolati (MED) e per i neutrofili stimolati con 10% siero di vasculite ANCA-associata pazienti (AAV) (n = 4) quantificato con un programma di elaborazione delle immagini. Ogni stimolo è stato testato in triplice copia, ogni punto rappresenta il valore mediano. Conteggio di zona e cella cella etichettati fluorescente rosso (B) sono stati quantificati nel piano focale di ciascun pozzetto dal programma di elaborazione delle immagini (R2 = 0,99, p < 0,0001). Formazione netta (C) è espressa come superficie cumulativo per imaged del neutrofilo (area di cella). Media ± errore standard della media (SEM) di ogni triplice copia viene stampata a stimolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig2.jpg"> Figura 2: istantanee di dosaggio di quantificazione NET. Neutrofili coniugati fluorescenti sono mostrati in rosso e macchiato DNA extracellulare viene visualizzato in verde. 10x obiettivo Plan Apo Lambda. (A) neutrofili non stimolate. (B) neutrofili stimolati con siero AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Questo protocollo descrive un'analisi di trappola extracellulari del neutrofilo (NET) altamente sensibile e ad alto rendimento per la quantificazione semiautomatizzata di ex vivo NET formazione mediante microscopia confocale tridimensionale di immunofluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la formazione netta e degrado dopo stimoli diversi e può essere utilizzato per lo studio di potenziali terapie mirate al NET.

Un'analisi di High-throughput per valutare e quantificare la trappola extracellulari del neutrofilo formazione

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Abbiamo sviluppato un saggio ad alta produttività per misurare trappole extracellulari neutrofile, o NET. I NET sono strutture di DNA immunogeniche esposte dai neutrofili. I NET possono intrappolare e uccidere microrganismi e sono quindi un importante meccanismo anti-infettivo, ma svolgono anche un ruolo patogeno nelle malattie autoimmuni.Con questa tecnica, i NET sono quantificati mediante microscopia confocale ad immunofluorescenza tridimensionale che si traduce in un metodo altamente sensibile e ad alta produttività per studiare la formazione e la degradazione della RETE. Questa tecnica ci consente di quantificare la formazione di NET di pazienti con malattie autoimmuni. Con questo saggio potrebbe essere monitorata la formazione ex vivo NET di pazienti con vasculite associata all'ANCA o eritematosi del lupus sistemico.Inoltre, le potenziali terapie mirate alla formazione di NET potrebbero essere testate con questo saggio in vitro. L'isolamento dei neutrofili potrebbe essere una lotta per le persone che non hanno mai eseguito questa tecnica prima. Per iniziare questa procedura, ottenere 20 millilitri di sangue periferico da un donatore sano in due tubi codificati EDTA da 10 millilitri.Trasferire 10 millilitri di sangue in un tubo sterile da 50 millilitri e PBS in un volume totale finale di 32,5 millilitri. Utilizzando un controller di pipetta e pipetta da 10 millilitri, assumere 14 millilitri di gradiente di densità. Posizionare la pipetta sul fondo del tubo da 50 millilitri.Quindi, togliere il controller della pipetta dalla pipetta, consentendo al gradiente di densità di fluire per gravità fino a raggiungere il massimo per effetto capillare. Posizionare un pollice sopra la pipetta per evitare che il gradiente di densità rimanente perda, quindi rimuovere la pipetta dal tubo. Centrifugare il tubo a 912 volte g a temperatura ambiente per 20 minuti senza accelerazione o freno.Rimuovere con cura l'anello bianco contenente prima le cellule mononucleari del sangue periferico, seguito dal plasma diluito da PBS. Infine, rimuovere il più possibile il livello gradiente di densità. Quindi, recuperare una bottiglia di acqua distillata sterile fredda e un pallone di PBS concentrato 10x da un frigorifero.Lavorando rapidamente, aggiungere 36 millilitri dell'acqua direttamente sopra il pellet e mescolare con cura una volta. Dopo 20 secondi contati dall'inizio, aggiungere quattro millilitri di 10x PBS per creare una soluzione isotonica. E ancora, mescolare con attenzione.Centrifugare il tubo a 739 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante, assicurandosi di essere estremamente attenti in quanto il pellet non è solido, e ripetere rapidamente il processo di aggiunta dell'acqua distillata sterile fredda e del PBS concentrato come descritto in precedenza. Centrifuga a 328 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.Rimuovere con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di PBS. Conta i neutrofili e tienili sul ghiaccio. In primo luogo, effettuare una sospensione neutrofila contenente circa 10-20 milioni di neutrofili in due millilitri di PBS in un tubo da 15 millilitri.In un diverso tubo da 15 millilitri, mescolare due millilitri PBS con quattro microlitri di collegamento a celle fluorescenti rosse a due micromolari. Aggiungere delicatamente la soluzione di collegamento a celle fluorescenti rosse alla sospensione neutrofila e mescolare con attenzione. Avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggere la miscela dalla luce e incubare per esattamente 25 minuti a 37 gradi Celsius per etichettare i neutrofili con il linker a celle fluorescenti rosse.Disattivare l'etichettatura aggiungendo un mezzo RPMI 1640 contenente FCS inattivato al 10% a temperatura ambiente a un volume finale di 15 millilitri e mescolare una volta con attenzione. Se dopo di ciò si è formato un pellet, sospendere accuratamente la miscela. Centrifugare il tubo a 328 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti.Prima di rimuovere il supernatante, assicurarsi che si sia formato un pellet. Successivamente, sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di mezzo RPMI 1640 privo di rosso contenente il 2%FCS a temperatura ambiente. Quindi, conta i neutrofili.Effettuare una sospensione cellulare ad una densità di 420.000 cellule per millilitro in fenolo rosso-free RPMI 1640 mezzo contenente il 2%FCS. Aggiungere 37.500 neutrofili in 90 microlitri a ciascun pozzo di una piastra nera a 96 poggia-fondo. Successivamente, aggiungere 10 microlitri dello stimolo scelto in triplice copia per raggiungere una concentrazione del 10% in ogni pozzo.Includere sempre un controllo negativo in triplice copia. Incubare al buio a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato, che varia da 30 minuti a due, quattro o sei ore. Quindi, preparare il volume di colorante di DNA impermeabile necessario per aggiungere 25 microlitri di colorante di DNA impermeabile a cinque micromolari per raggiungere una concentrazione finale di un micromolare in ogni pozzo.15 minuti prima della fine del tempo di incubazione, aggiungere 25 microlitri di colorante di DNA impermeabile a cinque micromolari ad ogni pozzo. Continuare l'incubazione per gli ultimi 15 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Dopo questo, rimuovere il supernatante con molta attenzione e conservare se necessario.Aggiungere 100 microlitri di paraformaldeide al 4%. Tenere la piastra al buio e procedere immediatamente alla sezione successiva. Dopo aver configurato le impostazioni, selezionare Serie Z.Selezionare 10 come numero di passaggi. Selezionare tre micrometri come dimensione del passo. Caricare la piastra nel microscopio confocale ad immunofluorescenza.Fare clic sulla scheda Esegui. Compilare il nome e la descrizione della piastra e scegliere il luogo di archiviazione. Selezionare i pozzi che devono essere acquisiti.Scegli il tempo di esposizione per Texas Red e FITC. Quindi, fai clic su Acquire Plate e inizia l'acquisizione, che richiederà circa un'ora per piastra. Successivamente, selezionare Analysis Macro.Quindi selezionare w1 e scegliere il valore di soglia. Selezionare quindi il valore in pixel desiderato. Infine, in una seconda finestra Immagine J, selezionare w2 e scegliere il valore di soglia con il valore pixel desiderato.Selezionare una destinazione per il file del foglio di calcolo, eseguire l'analisi e salvare successivamente il file di registro. Presentato qui è un saggio ampiamente applicabile altamente sensibile per la quantificazione semi-automatizzata della formazione di trappole extracellulari neutrofile per la valutazione dell'induzione es vivo di trappole extracellulari neutrofile su diversi stimoli. La formazione di NET è quantificata in modo tridimensionale quantificando il DNA extracellulare macchiato su 10 Z-stack con distanza di tre micrometri partendo dal piano focale in ogni pozzo.Misurando l'area cumulativa, la sensibilità del saggio aumenta. L'area totale dei neutrofili macchiati imageati è quantificata solo nel piano focale in ogni pozzo che è significativamente correlato con il numero totale di neutrofili in ogni pozzo con un coefficiente di correlazione di Pearson di 0,99. Il risultato rappresentativo della quantificazione della formazione di NET nei neutrofili è espresso come area cumulativa di DNA extracellulare macchiato su 10 Z-stack per neutrofilo immagine.Vengono quindi scattate istantanee del saggio di quantificazione netto. Immagini rappresentative di neutrofili non stimolati e di NET nei neutrofili stimolati dall'AAV sono mostrate qui con i neutrofili etichettati fluorescenti in rosso e il DNA extracellulare macchiato in verde. I neutrofili devono essere maneggiati con cura e l'etichettatura PKH deve essere eseguita esattamente secondo il protocollo.Questo saggio può essere usato per studiare morfologia, cinetica e composizione dei NET. Questa tecnica è un altro metodo che offre la possibilità di studiare i NET in salute e malattia. Trypan blu, PKH e PFA devono essere maneggiati con guanti e non devono essere respirati direttamente.

Research

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