Name: preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00
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这项工作得到了国家科学基金会通过 nsf oia-1833040 提供的支持。国家高磁场实验室 (nhmfl) 由国家科学基金会通过 dmr-117490 和佛罗里达州提供支助。nhmfl 的 mas-dnp 系统部分由 nih s10 od018519 和 nsf che-1229170 供资。

1.生长13c, 15n 标记的富米达斯下酯类液体培养基
<ol><li>未标记和13c、 15n 标记生长介质的制备 注: 酵母提取物丙酮葡萄糖培养基 (ypd) 和改进的最小培养基43均用于维持真菌培养。高压灭菌后的所有步骤都是在层流罩中执行的, 以最大限度地减少污染。<ol>
<li>无标记液体介质的制备: 在100毫升蒸馏水中溶解6.5 克 ypd 粉末, 在134°c 下高压灭菌2...

与生化方法相比, 固态核磁共振作为一种无损、高分辨率的技术具有优势。核磁共振在成分分析中也是定量的, 与大多数其他分析方法不同的是, 不存在生物聚合物溶解度有限所带来的不确定性。目前协议的建立有助于今后对富含碳水化合物的生物材料和功能化聚合物的研究。然而, 应当指出, 共振分配和数据分析可能很耗时, 通常需要系统的培训。作者目前正在开发工具和数据库, 以帮助没有经验?...

碳水化合物在各种生物过程中发挥着核心作用, 如储能、结构建筑、细胞识别和粘附。它们在细胞壁中被丰富, 细胞壁是植物、真菌、藻类和细菌的基本成分 1,2,3.细胞壁是生产生物燃料和生物材料的核心来源, 也是抗菌疗法4、5、6、7、8的一个有希望的目标,9个。
几十年来, 人们一直在努力利用四种主要的生化或遗传方法进行结构表征, 从而大大促进了对这些复杂材料的当代理解。第一种主要方法依靠顺序处理使用苛刻的化学物质或酶将细胞壁分解成不同的部分, 然后对每 10分的糖进行成分和连锁分析。这种方法揭示了聚合物的域分布, 但由于生物分子的化学和物理性质, 解释可能具有误导性。例如, 很难确定碱萃取分数是来自结构较少的分子的单个域, 还是来自具有可比溶解性的空间分离分子。其次, 提取的部分或整个细胞壁也可以测量使用溶液核磁共振, 以确定共价键, 也称为交联, 不同分子之间的 11,12,13, 14,15。通过这种方法, 可以探讨共价锚杆的详细结构, 但由于多糖的溶解度较低、交联位点数量相对较少以及对稳定的非共价效应的无知, 可能会存在局限性。多糖填料, 包括氢键、范德华力、静电相互作用和聚合物纠缠。第三, 利用分离的多糖16、17、18、19 在体外测定了结合亲和力, 但纯化过程可能会发生重大变化。这些生物分子的结构和性质。这种方法也不能复制复杂的沉积和组装的大分子后的生物合成。最后, 某些细胞壁成分减毒产生的遗传突变体的表型、细胞形态和力学性质揭示了多糖的结构功能, 但需要更多的分子证据来弥补这些因素的联系。宏观观测与蛋白质机械的工程功能 20。
近年来在多维固态核磁共振光谱的发展和应用方面取得的进展为解决这些结构难题提供了一个独特的机会。通过2d/3d 固态核磁共振实验, 可以在不产生重大扰动的情况下, 对富含碳水化合物材料的成分和结构进行高分辨率研究。对植物的原生和二级细胞壁、经过催化处理的生物量、细菌生物膜、真菌中的色素鬼以及最近作者在病原真菌中的完整细胞壁进行了结构研究。熏蒸曲霉21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. 动态核两极分化的发展 32 、33、34、35、36、37、38,39,40,41,42极大地促进了核磁共振结构的阐明, 因为 dnp 的灵敏度增强明显缩短了这些复杂生物材料的实验时间。这里描述的协议详细介绍了同位素标记真菌a. 熏蒸剂的程序, 以及为固态核磁共振和 dnp 表征准备真菌和植物样品的程序。类似的标签程序应适用于其他培养基改变的真菌, 样品制备程序应普遍适用于其他富含碳水化合物的生物材料。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>12054-85-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical weighing balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>B730439218</td>
			<td>Model PA84C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioclave 16 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470230-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco corporation</td>
			<td>302319100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9222</td>
			<td>store at 15-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Honeywell|Fluka</td>
			<td>60820</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7202152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151874</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td>&#8805;99 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 3.2 kDa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2272</td>
			<td>132724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>750004271</td>
			<td>Maximum RCF 25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR-MAS Disposable Insert Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B4493</td>
			<td>Kel-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14498</td>
			<td>&#8805;99+ %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034998</td>
			<td>store at 18-26 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) Chloride Tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>11563</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-254</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>B706689216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>13235-36-9</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33399</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12C3, d8-glycerol</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratory</td>
			<td>CDLM-8660</td>
			<td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma Alrdrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;99 % (CP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-sodium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;98 % 15N, &#8805;99 (cp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire NMR rotor</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>B6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm Silicone plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm MAS Rotor Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>H14355</td>
			<td>Zirconia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr

该协议显示了如何均匀地生产13c, 15n 标记的真菌材料, 以及如何进行这些软材料的固态核磁共振和敏感增强的 dnp 实验。并对植物生物质的样品处理工艺进行了详细的介绍。这种方法允许测量一系列的一维和 2d 13c-13 cp-15 n相关光谱, 从而能够以最小的扰动对其原生状态下的复杂生物材料进行高分辨率结构描述.通过量化一维光谱中的强度和二维相关谱中的偏振传递效率, 可以检测同位素标记。动态核极化 (dnp) 样品制备的成功与否可以用灵敏度增强因子来评价。进一步的实验, 研究多糖和蛋白质的结构方面将导致一个三维架构模型。这些方法可以进行修改和调整, 以研究广泛的富含碳水化合物的材料, 包括植物、真菌、藻类和细菌的天然细胞壁, 以及合成或设计的碳水化合物聚合物及其与其他物质的复合物。分子。

同位素标记大大提高了核磁共振灵敏度, 并使测量一系列 2d 13c-13 c 和13c-15n 相关光谱的可能性成为可能, 以分析其组成、水化、流动性和包装。聚合物, 它将被集成来构建细胞壁结构的三维模型 (图 1)。如果统一的标签成功, 可以在1小时内收集一套完整的 1d13c和 15n 光谱, 每个标准的2d 光谱测量时间不应?...

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Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

动态核极化固态核磁共振法制备结构澄清用真菌和植物材料

提出了一种用于多维固态核磁共振光谱和动态核极化 (dnp) 研究的 13 c、15个n 标记真菌和植物样品的制备方案。

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

该协议可用于为固态核磁共振（NMR）和动态核极化（DNP）准备用于复杂生物系统表征的真菌和植物材料。这种技术使我们能够研究生物材料在原生环境中的原子分辨率水平，例如，在全细胞中。获得有关真菌材料的高分辨率结构信息将有助于抗真菌药物的发展。该方法提供了真菌细胞壁中复合碳水化合物的组成和结构的洞察，可应用于许多富含碳水化合物的生物体，包括植物、真菌、藻类和细菌。一些研究人员可能难以与真菌污染在他们的细胞培养。我的建议是在使用前彻底消毒介质和设备，以防止这种污染。此演示将帮助在 NMR 或细胞培养方面经验很少的调查人员学习如何在真菌和植物系统中实施这些技术。要准备未标记的液体生长介质，在100毫升蒸馏水中溶解6.5克酵母提取物肽葡萄糖或YPD粉末，然后在134摄氏度下将所得溶液溶解25分钟。要准备未标记的固体生长介质，在 100 毫升蒸馏水中加入 6.5 克 YPD 阿加粉，并在 121 摄氏度下将介质冷却至约 50 摄氏度，然后自动清洁介质 25 分钟。然后，将13至15毫升的熔化固体生长介质转移到单独的无菌塑料培养皿中，并立即将盖子放在盘子上。要准备碳-13、氮-15标记的液体生长介质，根据需要将含同位素最小介质的100毫升体积调整为6.6的pH值，并含有酸或碱。接下来，将表中列出的盐溶解在100毫升蒸馏水中，加入碳-13、氮-15标记的液体生长介质，并在121摄氏度下将所得溶液冷却25分钟。当溶液冷却至室温时，将100微升微量元素溶液加入到碳-13、氮-15标签的最小介质中。要种植真菌材料，请使用接种循环将少量真菌从储存转移到 YPD 板上，并在 30 摄氏度的培养箱中培养真菌两天。在孵育结束时，使用新的接种回路将活性生长的真菌边缘转移到碳-13、氮-15标记的液体生长介质中，并在摇动的培养箱中将培养物以每分钟30摄氏度和220次旋转，在震动的培养箱中旋转3至5天。当大量的真菌覆盖烧瓶底部并漂浮在液体中时，通过离心收集真菌并丢弃上清液。用适当的溶液水合颗粒，并使用钳子收集约0.5克的水分良好的颗粒，用于 NMR 和 DNP 分析。然后，将剩余材料与20%甘油溶液混合在锥形管中，将真菌样品放在零下80摄氏度，进行长期储存。为了准备用于固态核磁共振分析的 A.fumigatus，首先使用具有 3.5 千代顿分子量截止的透析袋，将 0.5 克碳-13、氮-15 标记的真菌样品对一升 10 毫米磷酸盐缓冲液进行三天，以去除生长介质中的小分子。透析结束时，将样品转移到15毫升管中进行离心，将70至80毫克均匀的碳-13标签和水分充足的样品糊包装成4毫米二氧化硅转子。使用金属棒轻轻和重复挤压样品，用纸吸收多余的水。然后，紧密盖住转子，并将样品插入光谱仪，进行固态 NMR 表征。为了准备用于DNP分析的 A.fumigatus，将100微升DNP基质加入一个1.5毫升微离心管中，每碳-13，碳-15标记真菌样品，并将0.7毫克偏振剂溶解到每个管中，形成10毫摩尔基液溶液。在涡旋2至3分钟后，确保基体完全溶解在溶液中，将10毫克的透析碳-13、氮-15标记真菌样品浸泡在50微升的偏振剂溶液中，并使用害虫和砂浆对混合物进行轻度研磨，确保基体渗透到多孔细胞壁中。在地面颗粒中再加入30微升的激进溶液，以进一步滋润真菌样品，并将颗粒包装成3.2毫米蓝宝石转子。温和挤压并去除多余的DNP溶剂，如证明，并添加一个3.2毫米的硅胶塞，以防止水化损失。然后，将转子添加到用于常规实验的 NMR 光谱仪或用于微波辐照下 DNP 增强光谱的 DNP 光谱仪中。要为 DNP 研究准备植物材料，请使用剃须刀刀片将均匀的碳-13 标记的植物材料切割成 1 到 2 毫米的碎片。使用砂浆和害虫将碎片磨成更小的颗粒，直到最终粉末具有均匀的外观。在植物材料中加入40微升10毫摩尔基材溶液，轻轻研磨样品5分钟，确保与基体均匀混合。用另外 20 微升的激进库存溶液水合地面样品，将平衡的植物样品包装成 3.2 毫米蓝宝石转子，用于 DNP 分析。然后，插入硅胶塞以避免水化损失，并将样品加载到 DNP 分光光度计上。同位素标记大大提高了 NMR 灵敏度，并可测量一系列二维碳-13-碳-13和碳-13-氮-15相关光谱，以分析聚合物的组成、水化、移动性和包装，以整合聚合物，构建细胞壁结构的三维模型。如果在二D碳-13-碳-13光谱中很难获得对角线信号，则可能发生统计标记。两个碳-13峰值为96和92百万分之一是葡萄糖的特征碳-1信号。因此，在定量碳-13直接极化光谱中，其强度强，回收延迟长达35秒，通常表明小分子由于透析或洗涤不完整而占据主导地位。使用贴有良好标签的样品，可以进一步测量远距离相关性，以检测生物分子的空间接近性，并构建完整细胞壁的结构模型。该技术允许探索许多天然材料和工程材料的结构功能，促进未来对富含碳水化合物的生物材料和功能化聚合物的研究。由于一些真菌可能导致人类感染或系统疾病，请务必在层流罩中处理真菌材料，以进行保护并尽量减少接触。

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