Name: preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00
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इस कार्य को नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा NSF OIA-१८३३०४० के माध्यम से समर्थन दिया गया । राष्ट्रीय उच्च चुंबकीय क्षेत्र प्रयोगशाला (NHMFL) DMR के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है-११५७४९० और फ्लोरिडा के राज्य । MAS-DNP प्रणाली NHMFL में NIH S10 OD018519 और NSF चे-१२२९१७० द्वारा भाग में वित्त पोषित है ।

1. 13सी की वृद्धि, 15एन-त्यसपछि Aspergillus fumigatus तरल माध्यम
<ol><li>अनलेबलिंग और 13सी, 15एन-लेबल ग्रोथ मीडियम की तैयारी नोट: दोनों खमीर निकालने Peptone डेक्सट्रोज मध्यम (YPD) और सुधार ंयूनतम मध्यम४३ ...

जैव रासायनिक तरीकों के साथ तुलना में, ठोस राज्य एनएमआर एक गैर विनाशकारी और उच्च संकल्प तकनीक के रूप में लाभ है । एनएमआर संरचना विश्लेषण में भी मात्रात्मक है, और सबसे अंय विश्लेषणात्मक तरीकों के विपरीत, ...

कार्बोहाइड्रेट ऊर्जा भंडारण, संरचनात्मक निर्माण, और सेलुलर मांयता और आसंजन के रूप में विभिंन जैविक प्रक्रियाओं में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । वे सेल की दीवार है, जो पौधों, कवक, शैवाल और बैक्टीरिया1,2,3में एक मौलिक घटक है में समृद्ध कर रहे हैं । सेल दीवार जैव ईंधन और सामग्री के उत्पादन के लिए एक केंद्रीय स्रोत के रूप में कार्य करता है, साथ ही रोगाणुरोधी उपचार के लिए एक होनहार लक्ष्य4,5,6,7,8 , 9.
इन जटिल सामग्री की समकालीन समझ काफी है कि चार प्रमुख जैव रासायनिक या आनुवंशिक तरीकों का उपयोग संरचनात्मक लक्षण वर्णन करने के लिए समर्पित किया गया प्रयासों के दशकों से उंनत किया गया है । पहला प्रमुख तरीका है अनुक्रमिक उपचार पर निर्भर करता है कठोर रसायनों या एंजाइमों का उपयोग करने के लिए नीचे अलग भागों, जो में शर्करा की संरचना और लिंकेज विश्लेषण के बाद है में सेल दीवारों को तोड़ने के प्रत्येक10अंश । यह विधि पॉलिमर के डोमेन वितरण पर प्रकाश डालता है, लेकिन व्याख्या जैव अणुओं के रासायनिक और भौतिक गुणों के कारण भ्रामक हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करना मुश्किल है कि क्षार निकालने वाला अंश कम संरचित अणुओं के एक एकल डोमेन से या तुलनात्मक घुलनशीलता के साथ स्थानिक रूप से अलग अणुओं से उत्पन्न होता है या नहीं. दूसरा, निकाले गए भागों या पूरे सेल दीवारों को भी आबंध लिंकेज निर्धारित करने के लिए समाधान एनएमआर का उपयोग कर मापा जा सकता है, भी crosslinking के रूप में उद्धृत, विभिन्न अणुओं के बीच11,12,13, 14,15. इस तरह, आबंध एंकरों की विस्तृत संरचना की जांच की जा सकती है, लेकिन सीमाएं polysaccharides के कम घुलनशीलता के कारण मौजूद हो सकती हैं, crosslinking साइटों की अपेक्षाकृत छोटी संख्या, और गैर-आबंध प्रभावों की अनभिज्ञता जो स्थिर होती है polysaccharide पैकिंग, जिसमें हाइड्रोजन-बॉन्डिंग, वान डेर Waals फोर्स, इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरेक्शन और पॉलिमर उलझाव शामिल हैं । तीसरा, बाध्यकारी समानता अलग polysaccharides16,17,18,19का उपयोग कर इन विट्रो में निर्धारित किया गया है, लेकिन शुद्धि प्रक्रिया काफी बदल सकता है संरचना और इन अणुओं के गुण । इस विधि भी अणुओं के परिष्कृत जमाव और विधानसभा के बाद से दोहराने के लिए विफल रहता है । अंत में, phenotype, सेल आकृति विज्ञान और कुछ कोशिका दीवार घटक के तनु उत्पादन के साथ आनुवंशिक म्यूटेंट के यांत्रिक गुणों polysaccharides के संरचनात्मक कार्यों पर रोशनी शेड, लेकिन अधिक आणविक सबूत के लिए इन पुल की जरूरत है प्रोटीन मशीनरी20के इंजीनियर समारोह के साथ macroscopic टिप्पणियों ।
विकास और बहुआयामी ठोस राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के आवेदन में हाल ही में अग्रिम इन संरचनात्मक पहेली को सुलझाने के लिए एक अनूठा अवसर पेश किया है । 2d/ठोस राज्य एनएमआर प्रयोगों देशी राज्य में कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री की संरचना और वास्तुकला की उच्च संकल्प की जांच को सक्षम प्रमुख गड़बड़ी के बिना । संरचनात्मक अध्ययन सफलतापूर्वक दोनों प्राथमिक और माध्यमिक संयंत्रों के सेल दीवारों पर आयोजित किया गया है, उत्प्रेरक का इलाज बायोमास, बैक्टीरियल फिल्म, कवक में वर्णक भूत और, हाल ही में लेखकों द्वारा, एक रोगजनक कवक में बरकरार सेल दीवारों Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण का विकास (DNP)३२,३३,३४,३५,३६,३७,३८ , ३९ , ४० , ४१ , ४२ काफी DNP द्वारा संवेदनशीलता बढ़ाने के रूप में एनएमआर संरचनात्मक elucidation की सुविधा स्पष्ट रूप से इन जटिल सामग्री पर प्रयोगात्मक समय छोटा । प्रोटोकॉल यहां वर्णन किया गया आइसोटोप के लिए प्रक्रियाओं का विवरण-fumigatus और ठोस-राज्य एनएमआर और DNP लक्षण वर्णन के लिए कवक और संयंत्र नमूने तैयार कर रहा है । इसी तरह की लेबलिंग प्रक्रियाओं को बदल माध्यम के साथ अन्य कवक के लिए लागू किया जाना चाहिए, और नमूना तैयारी प्रक्रियाओं आम तौर पर अन्य कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री के लिए लागू किया जाना चाहिए.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>12054-85-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical weighing balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>B730439218</td>
			<td>Model PA84C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioclave 16 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470230-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco corporation</td>
			<td>302319100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9222</td>
			<td>store at 15-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Honeywell|Fluka</td>
			<td>60820</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7202152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151874</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td>&#8805;99 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 3.2 kDa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2272</td>
			<td>132724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>750004271</td>
			<td>Maximum RCF 25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR-MAS Disposable Insert Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B4493</td>
			<td>Kel-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14498</td>
			<td>&#8805;99+ %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034998</td>
			<td>store at 18-26 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) Chloride Tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>11563</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-254</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>B706689216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>13235-36-9</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33399</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12C3, d8-glycerol</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratory</td>
			<td>CDLM-8660</td>
			<td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma Alrdrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;99 % (CP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-sodium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;98 % 15N, &#8805;99 (cp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire NMR rotor</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>B6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm Silicone plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm MAS Rotor Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>H14355</td>
			<td>Zirconia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr

इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे समान रूप से 13सी, 15N-लेबल कवक सामग्री का उत्पादन किया जा सकता है और कैसे इन नरम सामग्री ठोस राज्य एनएमआर और संवेदनशीलता-बढ़ाया DNP प्रयोगों के लिए रवाना किया जाना चाहिए । संयंत्र बायोमास के नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया भी विस्तृत है । इस विधि की एक श्रृंखला के माप की अनुमति देता है 1 डी और 2d 13c-13c/15N सहसंबंध्स स्पेक्ट्रा, जो उनके देशी राज्य में जटिल सामग्री के उच्च संकल्प संरचनात्मक elucidation सक्षम बनाता है, न्यूनतम गड़बड़ी के साथ. आइसोटोप-लेबलिंग 1 डी स्पेक्ट्रा में तीव्रता और 2d सहसंबंध स्पेक्ट्रा में ध्रुवीकरण हस्तांतरण दक्षता को बढ़ाता द्वारा जांच की जा सकती है । गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण की सफलता (DNP) नमूना तैयारी संवेदनशीलता बढ़ाने के कारक द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा polysaccharides और प्रोटीन के संरचनात्मक पहलुओं की जांच प्रयोगों तीन आयामी वास्तुकला का एक मॉडल के लिए नेतृत्व करेंगे । इन पद्धतियों को संशोधित और कार्बोहाइड्रेट युक्त सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, पौधों की प्राकृतिक कोशिका दीवारें, कवक, शैवाल और बैक्टीरिया, साथ ही साथ संश्लेषित या डिजाइन कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और अन्य के साथ उनके परिसर अणुओं.

लेबलिंग आइसोटोप काफी एनएमआर संवेदनशीलता को बढ़ाता है और यह 2 डी 13सी की एक श्रृंखला को मापने के लिए संभव बनाता है-13सी और 13सी-15N सहसंबंध स्पेक्ट्रा की संरचना, जलयोजन, गतिशीलता औ?...

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Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण ठोस राज्य एनएमआर का उपयोग कर संरचनात्मक Elucidation के लिए कवक और संयंत्र सामग्री की तैयारी

बहुआयामी ठोस-राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (DNP) जांच के लिए 13सी,15एन-लेबल कवक और संयंत्र के नमूनों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है ।

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग ठोस-राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद, या एनएमआर, और गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण, या डीएनपी, जटिल बायोसिस्टम लक्षण वर्णन के लिए प्रयोगों के लिए कवक और संयंत्र सामग्री तैयार करने के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक हमें अपने मूल वातावरण में एक परमाणु संकल्प स्तर तक बायोमैटेरियल्स की जांच करने की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, पूरी कोशिकाओं में। फंगल सामग्रियों के बारे में उच्च-संकल्प संरचनात्मक जानकारी के अधिग्रहण से एंटीफंगल दवाओं के विकास में सहायता मिलेगी।विधि कवक कोशिका दीवारों में जटिल कार्बोहाइड्रेट की संरचना और संरचना में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है और पौधों, कवक, शैवाल और बैक्टीरिया सहित कई कार्बोहाइड्रेट युक्त जीवों पर लागू की जा सकती है। कुछ जांचकर्ता अपनी सेलुलर संस्कृतियों में फंगल संदूषण के साथ संघर्ष कर सकते हैं। मेरी सलाह इस संदूषण को रोकने के लिए उपयोग से पहले मध्यम और उपकरणों को अच्छी तरह से निष्फल करना है।यह प्रदर्शन एनएमआर या सेल संस्कृति में थोड़ा अनुभव के साथ जांचकर्ताओं को फंगल और संयंत्र प्रणालियों में इन तकनीकों को लागू करने के तरीके सीखने में मदद करेगा। अवेलेबल लिक्विड ग्रोथ मीडियम तैयार करने के लिए, 100 मिलीलीटर आसुत पानी में 6.5 ग्राम खमीर निकालने पेप्टोन डेक्सट्रोज या वाईपीडी पाउडर को भंग करें, और फिर परिणामी समाधान को 134 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करें। अवेलेबल ठोस विकास माध्यम तैयार करने के लिए, 100 मिलीलीटर आसुत पानी में 6.5 ग्राम वाईपीडी एगर पाउडर जोड़ें, और माध्यम को लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने से पहले 121 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए स्वचालित रूप से।फिर, पिघले हुए ठोस विकास माध्यम के 13 से 15 मिलीलीटर को व्यक्तिगत बाँझ प्लास्टिक पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें, और तुरंत ढक्कन को व्यंजनों पर रखें। कार्बन-13, नाइट्रोजन-15-लेबल तरल विकास माध्यम तैयार करने के लिए, आइसोटोप युक्त न्यूनतम माध्यम की 100 मिलीलीटर मात्रा को आवश्यक के रूप में एसिड या आधार के साथ 6.6 के पीएच में समायोजित करें। इसके बाद, आसुत पानी के 100 मिलीलीटर में तालिका में सूचीबद्ध लवण को भंग करें, कार्बन-13, नाइट्रोजन-15-लेबल वाले तरल विकास माध्यम में जोड़ें, और परिणामस्वरूप समाधान को 121 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करें।जब समाधान कमरे के तापमान में ठंडा हो जाता है, तो कार्बन-13, नाइट्रोजन-15-लेबल वाले न्यूनतम माध्यम की पूरी मात्रा में ट्रेस तत्वों के समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। कवक सामग्री विकसित करने के लिए, एक YPD प्लेट पर भंडारण से कवक की एक छोटी राशि हस्तांतरण करने के लिए एक inoculating पाश का उपयोग करें, और एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में दो दिनों के लिए कवक संस्कृति । इनक्यूबेशन के अंत में, कार्बन-13, नाइट्रोजन-15-लेबल तरल विकास माध्यम में एक सक्रिय बढ़ती कवक बढ़ते हस्तांतरण के लिए एक नए इनोक्यूलेटिंग लूप का उपयोग करें, और संस्कृति को एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में तीन से पांच दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस और 220 घूर्णन प्रति मिनट रखें।जब बड़ी मात्रा में कवक फ्लास्क नीचे को कवर करते हैं और तरल में तैरते हैं, तो कवक को अपकेंद्री द्वारा इकट्ठा करें और सुपरनेट को त्याग दें। एक उपयुक्त समाधान के साथ गोली को हाइड्रेट करें, और एनएमआर और डीएनपी विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से हाइड्रेटेड गोली के बारे में 0.5 ग्राम इकट्ठा करने के लिए संदंश का उपयोग करें। फिर, शेष सामग्री को शंकु नली में 20% ग्लाइसरोल समाधान के साथ मिलाएं, और फंगल नमूना को दीर्घकालिक भंडारण के लिए शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।ठोस राज्य एनएमआर विश्लेषण के लिए A.fumigatus तैयार करने के लिए, पहले एक ३.५ किलोडलटन आणविक वजन कटऑफ के साथ एक डायलिसिस बैग का उपयोग करने के लिए ०.५ ग्राम कार्बन-13, नाइट्रोजन-15 लेबल फंगल नमूना के एक लीटर के खिलाफ 10-मिल्मोलर फॉस्फेट बफर के एक लीटर के खिलाफ तीन दिनों के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर विकास माध्यम से छोटे अणुओं को दूर करने के लिए । डायलिसिस के अंत में, नमूना को अपकेंद्रित्र के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और समान रूप से कार्बन-13-लेबल और अच्छी तरह से हाइड्रेटेड नमूना पेस्ट के 70 से 80 मिलीग्राम को चार मिलीमीटर जिरकोनियम डाइऑक्साइड रोटर में पैक करें। अतिरिक्त पानी को अवशोषित करने के लिए कागज का उपयोग करके, धीरे-धीरे और दोहराव से नमूना निचोड़ने के लिए धातु की छड़ का उपयोग करें।फिर, रोटर को कसकर कैप करें, और ठोस-राज्य एनएमआर लक्षण वर्णन के लिए नमूना को स्पेक्ट्रोमीटर में डालें। डीएनपी विश्लेषण के लिए ए.फ्यूमिगटस तैयार करने के लिए, डीएनपी मैट्रिक्स के 100 माइक्रोलीटर को कार्बन-13 प्रति कार्बन-13, कार्बन-15-लेबल वाले फंगल नमूने में 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में जोड़ें, और 10 मिलीमोलर कट्टरपंथी स्टॉक समाधान बनाने के लिए प्रत्येक ट्यूब में ध्रुवीकरण एजेंट के 0.7 मिलीग्राम को भंग करें। दो से तीन मिनट के लिए भंवर के बाद यह सुनिश्चित करने के लिए कि कट्टरपंथियों को पूरी तरह से समाधान में भंग कर रहे हैं, 10 मिलीग्राम का सेवन करें, 13, नाइट्रोजन-15-लेबल फंगल नमूना ध्रुवीकरण एजेंट समाधान के 50 माइक्रोलीटर में, और एक मूसल और एक मोर्टार का उपयोग करने के लिए हल्के से मिश्रण पीसने के लिए असुरक्षित कोशिका दीवारों में कणों की पैठ सुनिश्चित करने के लिए ।फंगल नमूने को और अधिक हाइड्रेट करने के लिए जमीन गोली के लिए कट्टरपंथी समाधान के एक और 30 माइक्रोलीटर जोड़ें, और एक ३.२ मिलीमीटर नीलम रोटर में गोली पैक । हल्का निचोड़ें और प्रदर्शन के रूप में अतिरिक्त डीएनपी सॉल्वेंट को हटा दें, और हाइड्रेशन के नुकसान को रोकने के लिए 3.2 मिलीमीटर सिलिकॉन प्लग जोड़ें। फिर, नियमित प्रयोग के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर या माइक्रोवेव विकिरण के तहत डीएनपी-संवर्धित स्पेक्ट्रम के माप के लिए डीएनपी स्पेक्ट्रोमीटर में रोटर जोड़ें।डीएनपी अध्ययन के लिए संयंत्र सामग्री तैयार करने के लिए, एक रेजर ब्लेड का उपयोग करने के लिए समान रूप से कार्बन-13 लेबल संयंत्र सामग्री एक से दो मिलीमीटर टुकड़ों में कटौती । टुकड़ों को छोटे कणों में पीसने के लिए मोर्टार और मूसल का उपयोग करें जब तक कि अंतिम पाउडर में समरूप उपस्थिति न हो। संयंत्र सामग्री के लिए 10-मिलीमोलर कट्टरपंथी स्टॉक समाधान के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कट्टरपंथी के साथ सजातीय मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त पांच मिनट के लिए नमूना को हल्के से पीसें।कट्टरपंथी स्टॉक समाधान के एक और 20 माइक्रोलीटर के साथ जमीन के नमूने को हाइड्रेट करें, और डीएनपी विश्लेषण के लिए 3.2 मिलीमीटर नीलम रोटर में समतुलित पौधे के नमूने को पैक करें। फिर, हाइड्रेशन के नुकसान से बचने के लिए एक सिलिकॉन प्लग डालें, और नमूना डीएनपी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर लोड करें। आइसोटोप लेबलिंग एनएमआर संवेदनशीलता को काफी हद तक बढ़ाता है और सेल वॉल आर्किटेक्चर के त्रि-आयामी मॉडल के निर्माण के लिए उनके एकीकरण के लिए पॉलीमर की संरचना, जलयोजन, गतिशीलता और पैकिंग का विश्लेषण करने के लिए दो आयामी कार्बन-13-कार्बन-13 और कार्बन-13-नाइट्रोजन-15 सहसंबंध स्पेक्ट्रा की एक श्रृंखला को मापने के लिए संभव बनाता है।यदि ऑफ-विकर्ण संकेतों को 2डी कार्बन-13-कार्बन-13 स्पेक्ट्रम में प्राप्त करना मुश्किल है, तो सांख्यिकीय लेबलिंग हो सकती है। 96 पर दो कार्बन-13 चोटियों और प्रति मिलियन 92 भागों में ग्लूकोज के हस्ताक्षर कार्बन-1 संकेत हैं। इसलिए, मात्रात्मक कार्बन-13 प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण स्पेक्ट्रा में उनकी मजबूत तीव्रता 35 सेकंड की लंबी रीसायकल देरी के साथ मापा आम तौर पर अधूरे डायलिसिस या धोने के कारण छोटे अणुओं के प्रभुत्व का संकेत देता है।अच्छी तरह से लेबल वाले नमूनों के साथ, जैव अणुओं की स्थानिक निकटता का पता लगाने और अक्षुण्ण कोशिका दीवारों के संरचनात्मक मॉडल का निर्माण करने के लिए लंबी दूरी के सहसंबंधों को और मापा जा सकता है। यह तकनीक कई प्राकृतिक-होने वाली और इंजीनियर सामग्रियों में संरचना कार्य की अनुमति देती है, जिससे कार्बोहाइड्रेट से भरपूर बायोमैटेरियल्स और कार्यात्मक पॉलिमर के भविष्य के अध्ययनों को सुविधाजनक बनाया जा सकता है। जैसा कि कुछ कवक मनुष्यों में संक्रमण या व्यवस्थित बीमारियों का कारण बन सकता है, सुरक्षा के लिए एक लैमिनार प्रवाह हुड में फंगल सामग्री को संभालना सुनिश्चित करें और जोखिम को कम करने के लिए।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

तैयारी और सीरियल गुजरने क्रि लिए lipídic घन चरण में प्रोटीन microcrystals की डिलिवरी

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

एक प्रोटीन प्रोटीन की उच्च throughput पहचान नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण का प्रयोग एक परमाणु cofactor साथ बातचीत के लिए तैयारी विधि

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

परमाणु पैमाने पर Macromolecular विधानसभाओं के संरचनात्मक अध्ययन ठोस राज्य परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

अलग आयामों के साथ बढ़ती प्रोटीन क्रिस्टल का उपयोग कर स्वचालित क्रिस्टलीकरण में सीटू गतिशील प्रकाश बिखरने के साथ युग्मित

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

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अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

संशोधित Baculovirus अभिव्यक्ति वैक्टर कीट कोशिकाओं में स्रावित संयंत्र प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) और अतिसूक्ष्म Thermophoresis (MST) द्वारा गोलाकार और रेशा प्रोटीन की बातचीत को मापने

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

एक समर्थन फ्लोटेशन ब्लॉक का उपयोग करके ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में नमूना समर्थन फिल्मों की तैयारी

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

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बड़े पैमाने पर मल्टी-ओमिक्स जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (एमओ-जीडब्ल्यूएएस): नमूना तैयारी और सामान्यीकरण के लिए दिशानिर्देश

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...