Name: preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation attraverso NSF OIA-1833040. Il laboratorio nazionale di campo magnetico alta (NHMFL) è supportata dalla National Science Foundation attraverso DMR-1157490 e dello stato della Florida. Il sistema di MAS-DNP presso NHMFL è in parte finanziato dal NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.

1. crescita di 13C, 15N-labeled fumigatus dell'aspergillo mezzo liquido
<ol><li>Preparazione di adenoide e 13C, 15N-labeled crescita medio Nota: Entrambi mezzo lievito estrarre Peptone destrosio (YPD) e il miglioramento medio minimo43 sono stati utilizzati per il mantenimento della coltura fungosa. Tutti i passaggi dopo la sterilizzazione in autoclave sono eseguiti in una cappa a flusso laminare per minimizzare la contaminazione.<ol>
<li>Pr...

Confrontato con i metodi biochimici, NMR allo stato solido ha vantaggi come una tecnica non distruttiva e ad alta risoluzione. NMR è anche in analisi della composizione quantitativa, e a differenza di molti altri metodi analitici, fa non sono le incertezze introdotte dalla solubilità limitata dei biopolimeri. Istituzione dell'attuale protocollo facilita gli studi futuri su biomateriali ricchi di carboidrati e polimeri funzionalizzati. Tuttavia, dovrebbe essere notato che l'analisi di dati e di assegnazione di risonanza...

Carboidrati svolgono un ruolo centrale in vari processi biologici come stoccaggio di energia, costruzione strutturale e riconoscimento cellulare e adesione. Sono arricchiti nella parete delle cellule, che è un componente fondamentale in piante, funghi, alghe e batteri1,2,3. La parete cellulare funge da una fonte centrale per la produzione di biocombustibili e biomateriali, come pure un bersaglio promettente per terapie antimicrobiche4,5,6,7,8 , 9.
La moderna comprensione di questi materiali complessi è stato sostanzialmente avanzata da decenni di sforzi che sono stati dedicati alla caratterizzazione strutturale utilizzando quattro principali metodi biochimici o genetici. Il primo metodo principale si basa su trattamenti sequenziali utilizzando sostanze chimiche aggressive o enzimi per abbattere i muri della cella in diverse porzioni, che è seguita da compositivo e analisi di linkage di zuccheri in ogni frazione10. Questo metodo mette in luce la distribuzione di dominio dei polimeri, ma l'interpretazione può essere fuorviante a causa delle proprietà chimiche e fisiche di biomolecole. Ad esempio, è difficile determinare se la frazione di alcali-estraibile ha origine da un singolo dominio di molecole meno strutturati o da molecole nello spazio separate con solubilità paragonabile. In secondo luogo, le porzioni estratte o intere pareti della cellula può anche essere misurate utilizzando soluzione NMR per determinare i legami covalenti, anche definiti come reticolazione, tra molecole diverse11,12,13, 14,15. In questo modo, potrebbe essere sondata la struttura dettagliata delle ancore covalente, ma possono esistere limitazioni a causa della bassa solubilità di polisaccaridi, il numero relativamente piccolo di reticolazione siti e l'ignoranza degli effetti non-covalente che stabilizza imballaggio di polisaccaride, inclusi legami a idrogeno, forza di van der Waals, interazione elettrostatica e dell'intrico di polimero. In terzo luogo, l'affinità di legame è stata determinata in vitro utilizzando polisaccaridi isolato16,17,18,19, ma la purificazione delle procedure possono alterare sostanzialmente la struttura e le proprietà di queste biomolecole. Questo metodo inoltre non riesce a replicare la deposizione sofisticato e l'assemblaggio di macromolecole dopo biosintesi. Infine, il fenotipo, morfologia delle cellule e proprietà meccaniche dei mutanti genetici con produzione attenuato di certo componente della parete cellulare capannone luci sulle funzioni strutturali di polisaccaridi, ma prova più molecolare è necessaria per colmare questi osservazioni macroscopiche con la funzione ingegnerizzata di proteina macchinari20.
Recenti progressi nello sviluppo e applicazione della spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale hanno introdotto un'occasione unica per risolvere questi enigmi strutturali. Indagini ad alta risoluzione della composizione e architettura di materiali ricchi di carboidrati nello stato nativo senza perturbazione principali abilitare esperimenti NMR allo stato solido 2D/3D. Studi strutturali sono stati condotti con successo sia primaria e pareti di cella secondaria delle piante, la biomassa cataliticamente trattata, biofilm batterico, il pigmento fantasmi in funghi e, di recente dagli autori, le pareti della cellula intatte in un fungo patogeno Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. lo sviluppo di polarizzazione nucleare dinamica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 facilita sostanzialmente delucidazione strutturale NMR in quanto l'aumento di sensibilità di DNP contrassegnato riduce il tempo sperimentale su questi biomateriali complessi. Il protocollo descritto qui i dettagli le procedure per la marcatura a isotopi del fungo a. fumigatus e preparando fungine e campioni di piante per la caratterizzazione NMR e DNP a stato solido. Procedure di etichettatura simili dovrebbero essere applicabile ad altri funghi con alterato medio, e le procedure di preparazione del campione dovrebbero essere generalmente applicabile ad altri biomateriali ricchi di carboidrati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>12054-85-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical weighing balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>B730439218</td>
			<td>Model PA84C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioclave 16 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470230-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco corporation</td>
			<td>302319100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9222</td>
			<td>store at 15-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Honeywell|Fluka</td>
			<td>60820</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7202152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151874</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td>&#8805;99 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 3.2 kDa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2272</td>
			<td>132724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>750004271</td>
			<td>Maximum RCF 25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR-MAS Disposable Insert Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B4493</td>
			<td>Kel-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14498</td>
			<td>&#8805;99+ %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034998</td>
			<td>store at 18-26 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) Chloride Tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>11563</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-254</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>B706689216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>13235-36-9</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33399</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12C3, d8-glycerol</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratory</td>
			<td>CDLM-8660</td>
			<td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma Alrdrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;99 % (CP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-sodium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;98 % 15N, &#8805;99 (cp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire NMR rotor</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>B6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm Silicone plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm MAS Rotor Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>H14355</td>
			<td>Zirconia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr

Questo protocollo viene illustrato come uniformemente 13C, 15N-labeled fungine materiali possono essere prodotta e come questi materiali morbidi dovrebbero essere proceduti per NMR allo stato solido e sensibilità avanzata DNP esperimenti. La procedura di elaborazione del campione di biomassa vegetale è anche dettagliata. Questo metodo consente la misurazione di una serie di 1D e 2D 13C -13C / gli spettri di correlazioni15N, che consente ad alta risoluzione delucidazione strutturale dei complessi biomateriali nel loro stato nativo, con minima perturbazione. L'isotopo-etichettatura può essere esaminato da quantificare l'intensità negli spettri di 1D e l'efficienza del trasferimento di polarizzazione negli spettri di correlazione 2D. Il successo della preparazione del campione di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) possa essere valutato per il fattore di aumento di sensibilità. Ulteriori esperimenti esaminando gli aspetti strutturali del polisaccaridi e proteine porterà ad un modello dell'architettura tridimensionale. Questi metodi possono essere modificati e adattati per studiare una vasta gamma di materiali ricchi di carboidrati, tra cui le pareti della cellula naturale di piante, funghi, alghe e batteri, così come sintetizzato o progettato carboidrati polimeri e il loro complesso con altri molecole.

La marcatura a isotopi sostanzialmente aumenta la sensibilità di NMR e rende possibile per una serie di 13C -15N correlazione spettri per analizzare la composizione, l'idratazione, la mobilità e 2D 13C -13C di misura e l'imballaggio di polimeri, che saranno integrati per costruire un modello tridimensionale dell'architettura della parete cellulare (Figura 1). Se l'etichettatura uniforme ha esito positivo, un set c...

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Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

Un protocollo per la preparazione 13C,15campioni fungini e vegetali N-etichettati per spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale e indagini di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) è presentato.

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Questo protocollo può essere utilizzato per preparare materiali fungini e vegetali per la risonanza magnetica nucleare allo stato solido, o NMR, e la polarizzazione nucleare dinamica, o DNP, esperimenti per la caratterizzazione di biosistemi complessi. Questa tecnica ci permette di studiare i biomateriali a un livello di risoluzione atomica nel loro ambiente nativo, ad esempio, in intere cellule. L'acquisizione di informazioni strutturali ad alta risoluzione sui materiali fungini contribuirà allo sviluppo di farmaci antifungini.Il metodo fornisce informazioni sulla composizione e la struttura dei carboidrati complessi nelle pareti cellulari fungine e può essere applicato a molti organismi ricchi di carboidrati, tra cui piante, funghi, alghe e batteri. Alcuni investigatori possono lottare con la contaminazione fungina nelle loro colture cellulari. Il mio consiglio è di sterilizzare accuratamente il mezzo e le attrezzature prima dell'uso per prevenire questa contaminazione.Questa dimostrazione aiuterà gli investigatori con poca esperienza nella coltura NMR o cellulare a imparare come implementare queste tecniche nei sistemi fungini e vegetali. Per preparare un mezzo di crescita liquido non etichettato, sciogliere 6,5 grammi di estratto di lievito peptone destrosio o polvere YPD in 100 millilitri di acqua distillata, quindi autoclavare la soluzione risultante per 25 minuti a 134 gradi Celsius. Per preparare un mezzo di crescita solido senza etichetta, aggiungere 6,5 grammi di polvere di agar YPD a 100 millilitri di acqua distillata e autoclavare il mezzo per 25 minuti a 121 gradi Celsius, prima di raffreddare il mezzo a circa 50 gradi Celsius.Quindi, trasferire da 13 a 15 millilitri del mezzo di crescita solido fuso in singole piastre di Petri di plastica sterile e posizionare immediatamente i coperchi sui piatti. Per preparare il mezzo di crescita liquido etichettato carbonio-13, etichettato azoto-15, regolare un volume di 100 millilitri di mezzo minimo contenente isotopi a un pH di 6,6 con acido o base, se necessario. Successivamente, sciogliere i sali elencati nella tabella in 100 millilitri di acqua distillata, aggiungere al carbonio-13, al mezzo di crescita liquido etichettato azoto-15 e autoclavare la soluzione risultante per 25 minuti a 121 gradi Celsius.Quando la soluzione si è raffreddata a temperatura ambiente, aggiungere 100 microlitri di oligoelementi soluzione all'intero volume di carbonio-13, mezzo minimo etichettato azoto-15. Per far crescere i materiali fungini, utilizzare un anello inoculato per trasferire una piccola quantità di funghi dallo stoccaggio su una piastra YPD e coltivare il fungo per due giorni in un incubatore Celsius di 30 gradi. Alla fine dell'incubazione, utilizzare un nuovo anello inoculante per trasferire un bordo fungino in crescita attiva sul mezzo di crescita liquido etichettato carbonio-13, etichettato azoto-15, e posizionare la coltura a 30 gradi Celsius e 220 rotazioni al minuto per tre o cinque giorni in un incubatore di scuotimento.Quando grandi quantità del fungo coprono il fondo del pallone e galleggiano nel liquido, raccogliere i funghi per centrifugazione e scartare il supernatante. Idratare il pellet con una soluzione appropriata e utilizzare le forcep per raccogliere circa 0,5 grammi del pellet ben idratato per le analisi NMR e DNP. Quindi, mescolare il materiale rimanente con una soluzione di glicerolo al 20% in un tubo conico e posizionare il campione fungino a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.Per preparare l'A.fumigatus per l'analisi NMR allo stato solido, utilizzare prima un sacchetto di dialisi con un taglio del peso molecolare di 3,5 kilodalton per dializzare il campione fungino etichettato da 0,5 grammi di carbonio-13, etichettato azoto-15 contro un litro di tampone fosfato 10 millimolare a quattro gradi Celsius per tre giorni per rimuovere piccole molecole dal mezzo di crescita. Al termine della dialisi, trasferire il campione in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione e imballare da 70 a 80 milligrammi della pasta campione uniformemente etichettata al carbonio-13 e ben idratata in un rotore di biossido di zirconio di quattro millimetri. Utilizzare un'asta metallica per spremere delicatamente e ripetutamente il campione, usando la carta per assorbire l'acqua in eccesso.Quindi, limitare saldamente il rotore e inserire il campione nello spettrometro per la caratterizzazione NMR allo stato solido. Per preparare l'A.fumigatus per l'analisi DNP, aggiungere 100 microlitri di matrice DNP in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri per campione fungino etichettato carbonio-13 e sciogliere 0,7 milligrammi di agente polarizzante in ogni tubo per formare una soluzione di calcio radicale da 10 millimolare. Dopo aver vortice per due o tre minuti per garantire che i radicali siano completamente sciolti nella soluzione, immergere 10 milligrammi di carbonio dializzato-13, campione fungino etichettato azoto-15 in 50 microlitri della soluzione di agente polarizzante e utilizzare un pestello e una malta per macinare delicatamente la miscela per garantire la penetrazione dei radicali nelle pareti cellulari porose.Aggiungere altri 30 microlitri della soluzione radicale al pellet macinato per idratare ulteriormente il campione fungino e imballare il pellet in un rotore di zaffiro da 3,2 millimetri. Spremere leggermente e rimuovere il solvente DNP in eccesso come dimostrato e aggiungere una spina in silicone da 3,2 millimetri per prevenire la perdita di idratazione. Quindi, aggiungere il rotore a uno spettrometro NMR per esperimenti di routine o uno spettrometro DNP per la misurazione dello spettro potenziato da DNP sotto irradiazione a microonde.Per preparare i materiali vegetali per gli studi DNP, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il materiale vegetale etichettato in uniforme carbonio-13 in pezzi da uno a due millimetri. Utilizzare un mortaio e un pestello per macinare i pezzi in particelle più piccole fino a quando la polvere finale non ha un aspetto omogeneo. Aggiungere 40 microlitri di soluzione di massa radicale da 10 millimolare al materiale vegetale e macinare leggermente il campione per altri cinque minuti per garantire una miscelazione omogenea con il radicale.Idratare il campione macinato con altri 20 microlitri di soluzione di calcio radicale e imballare il campione di piante equilibrate in un rotore di zaffiro da 3,2 millimetri per l'analisi DNP. Quindi, inserire una spina in silicone per evitare la perdita di idratazione e caricare il campione sullo spettrofotometro DNP. L'etichettatura isotopica migliora sostanzialmente la sensibilità NMR e consente di misurare una serie di spettri di correlazione bidimensionali carbonio-13-carbonio-13 e carbonio-13-azoto-15 per analizzare la composizione, l'idratazione, la mobilità e l'imballaggio dei polimeri per la loro integrazione per la costruzione di un modello tridimensionale di architettura della parete cellulare.Se i segnali off-diagonali sono difficili da ottenere nello spettro 2D carbonio-13-carbonio-13, potrebbe essersi verificata un'etichettatura statistica. I due picchi di carbonio-13 a 96 e 92 parti per milione sono segnali caratteristici di carbonio-1 di glucosio. Pertanto, le loro forti intensità negli spettri quantitativi di polarizzazione diretta carbonio-13 misurati con lunghi ritardi di riciclo di 35 secondi indicano tipicamente il predominio di piccole molecole a causa di dialisi o lavaggio incompleti.Con campioni ben etichettati, le correlazioni a lungo raggio possono essere ulteriormente misurate per rilevare le prossimità spaziali delle biomolecole e per costruire un modello strutturale delle pareti cellulari intatte. Questa tecnica consente di esplorare la funzione di struttura in molti materiali naturali e ingegnerizzati, facilitando studi futuri su biomateriali ricchi di carboidrati e polimeri funzionalizzati. Poiché alcuni funghi possono causare infezioni o malattie sistematiche nell'uomo, assicurarsi di gestire materiali fungini in una cappa di flusso laminare per la protezione e ridurre al minimo l'esposizione.

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