Name: preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation através da NSF OIA-1833040. O laboratório nacional de campo magnético elevado (NHMFL) é suportado pela National Science Foundation através de DMR-1157490 e o estado da Flórida. O sistema MAS-DNP no NHMFL é financiado em parte pelo NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.

1. crescimento de 13C, 15N-rotulado Aspergillus fumigatus meio líquido
<ol><li>Preparação de sem rótulo e 13C, meio de crescimento N-rotulado de 15 Nota: Os dois meio de levedura extrato peptona Dextrose (YPD) e o melhor médio mínimo43 foram utilizados para a manutenção da cultura fúngica. Todas as etapas após a autoclavagem são executadas em uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação.<ol>
<li>Preparação de meio ...

Comparado com os métodos bioquímicos, NMR Solid-State tem vantagens como uma técnica não-destrutiva e em alta resolução. NMR também é quantitativa na análise composicional, e ao contrário da maioria dos outros métodos analíticos, não terá as incertezas introduzido pela solubilidade limitada de biopolímeros. Estabelecimento do protocolo atual facilita estudos futuros sobre biomateriais ricos em carboidratos e polímeros funcionalizados. No entanto, deve notar-se que a análise de dados e atribuição de res...

Hidratos de carbono desempenham um papel central em vários processos biológicos, tais como armazenamento de energia, construção estrutural e reconhecimento celular e adesão. Eles são enriquecidos na parede celular, que é um componente fundamental em plantas, fungos, algas e bactérias1,2,3. Parede celular serve como uma fonte central para a produção de biocombustível e biomateriais, bem como um alvo promissor para terapias antimicrobiana4,5,6,7,8 , 9.
A compreensão contemporânea destes materiais complexos tem sido substancialmente avançada por décadas de esforços que foram dedicados à caracterização estrutural usando quatro principais métodos bioquímicos ou genéticos. O primeiro método principal se baseia em tratamentos sequenciais usando produtos químicos ou enzimas para quebrar as paredes celulares em porções diferentes, que é seguido por composição e análise de enlace de açúcares em cada fração de10. Este método lança luz sobre a distribuição de domínio de polímeros, mas a interpretação pode ser enganosa devido às propriedades físicas e químicas das biomoléculas. Por exemplo, é difícil determinar se a fração alcaloide extraíveis origina-se de um único domínio de moléculas menos estruturadas ou de moléculas espacialmente separadas com solubilidade comparável. Em segundo lugar, a porções extraídas ou paredes de célula inteira pode também ser medidas usando solução NMR para determinar as ligações covalentes, também denominadas como reticulação, entre diferentes moléculas11,12,13, 14,15. Desta forma, a estrutura detalhada das ligações covalentes âncoras poderia ser sondada, mas limitações podem existir devido a baixa solubilidade de polissacarídeos, o número relativamente pequeno de sites de reticulação e a ignorância dos efeitos não-covalente que estabiliza embalagem de polissacarídeo, incluindo a ligação do hidrogênio, força de van der Waals, interação eletrostática e entrelaçamento de polímero. Em terceiro lugar, a afinidade obrigatória tem sido determinada em vitro usando polissacarídeos isolados16,17,18,19, mas a purificação procedimentos podem alterar substancialmente a estrutura e propriedades destas biomoléculas. Esse método também não consegue replicar a deposição sofisticada e montagem de macromoléculas após a biossíntese. Finalmente, o fenótipo, morfologia celular e propriedades mecânicas dos mutantes genéticos com produção atenuada de determinado componente da parede celular lançar luzes sobre as funções estruturais dos polissacarídeos, mas evidências moleculares mais é necessário para colmatar estas observações macroscópicas com a função engenharia de proteína machineries20.
Recentes avanços no desenvolvimento e aplicação de espectroscopia NMR Solid-State multidimensional introduziram uma oportunidade única para resolver estes enigmas estruturais. 2D/3D Solid-State NMR experimentos permitem investigação high-resolution da composição e arquitetura de materiais ricos em carboidratos no estado nativo, sem grandes perturbações. Estudos estruturais têm sido realizados com sucesso no primário e paredes celulares secundárias de plantas, a biomassa tratada cataliticamente, biofilme bacteriano, o pigmento fantasmas em fungos e, recentemente pelos autores, as paredes celulares intactos em um fungo patogênico Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. o desenvolvimento da polarização nuclear dinâmica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 substancialmente facilita a elucidação estrutural de NMR como o aprimoramento da sensibilidade pela DNP marcadamente encurta o tempo experimental em biomateriais estes complexos. O protocolo descrito aqui detalha os procedimentos para o fungo a. fumigatus isótopo-rotulagem e preparando fúngicas e amostras da planta para a caracterização do estado sólida NMR e DNP. Procedimentos de rotulagem semelhantes devem ser aplicáveis a outros fungos com meio alterado, e os procedimentos de preparação de amostra devem ser geralmente aplicáveis a outros biomateriais ricos em carboidratos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>12054-85-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical weighing balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>B730439218</td>
			<td>Model PA84C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioclave 16 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470230-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco corporation</td>
			<td>302319100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9222</td>
			<td>store at 15-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Honeywell|Fluka</td>
			<td>60820</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7202152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151874</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td>&#8805;99 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 3.2 kDa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2272</td>
			<td>132724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>750004271</td>
			<td>Maximum RCF 25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR-MAS Disposable Insert Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B4493</td>
			<td>Kel-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14498</td>
			<td>&#8805;99+ %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034998</td>
			<td>store at 18-26 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) Chloride Tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>11563</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-254</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>B706689216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>13235-36-9</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33399</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12C3, d8-glycerol</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratory</td>
			<td>CDLM-8660</td>
			<td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma Alrdrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;99 % (CP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-sodium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;98 % 15N, &#8805;99 (cp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire NMR rotor</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>B6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm Silicone plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm MAS Rotor Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>H14355</td>
			<td>Zirconia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr

Este protocolo mostra como uniformemente 13C, 15N-rotulado materiais fúngicos podem ser produzidos e como estes materiais macios devem ser procedeu para NMR Solid-State e DNP sensibilidade melhorada dos experimentos. O procedimento de processamento da amostra de biomassa de planta também é detalhado. Este método permite a medição de uma série de 1D e 2D 13C -13C / espectros de correlações15N, que permite a elucidação estrutural de alta resolução de biomateriais complexos em seu estado nativo, com mínima perturbação. O isótopo-rotulagem pode ser examinado através da quantificação da intensidade em espectros de 1D e a eficiência de transferência de polarização em espectros de correlação 2D. O sucesso da preparação da amostra de polarização nuclear dinâmica (DNP) pode ser avaliado pelo fator de aumento de sensibilidade. Novas experiências, examinando os aspectos estruturais dos polissacarídeos e proteínas conduzirá a um modelo da arquitetura tridimensional. Esses métodos podem ser modificados e adaptados para investigar uma ampla gama de materiais ricos em carboidratos, incluindo as paredes celulares naturais de plantas, fungos, algas e bactérias, bem como sintetizado ou projetado, polímeros de carboidratos e seus complexos com outros moléculas.

A rotulagem de isótopo substancialmente aumenta a sensibilidade de NMR e torna possível para medir uma série de 13C -15N correlação espectros para analisar a composição, hidratação, mobilidade e 2D 13C -13C e embalagem de polímeros, que serão integrados para construir um modelo tridimensional de arquitetura da parede celular (Figura 1). Se a rotulagem uniforme for bem-sucedido, um conjunto completo de esp...

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Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Este protocolo pode ser usado para preparar materiais fúngicos e vegetais para ressonância magnética nuclear de estado sólido, ou RN, e polarização nuclear dinâmica, ou DNP, experimentos para caracterização complexa do biossistema. Essa técnica nos permite investigar biomateriais a um nível de resolução atômica em seu ambiente nativo, por exemplo, em células inteiras. A aquisição de informações estruturais de alta resolução sobre materiais fúngicos ajudará no desenvolvimento de medicamentos antifúngicos.O método fornece uma visão da composição e estrutura de carboidratos complexos em paredes celulares fúngicas e pode ser aplicado a muitos organismos ricos em carboidratos, incluindo plantas, fungos, algas e bactérias. Alguns investigadores podem lutar contra a contaminação fúngica em suas culturas celulares. Meu conselho é esterilizar o meio e o equipamento completamente antes de usar para evitar essa contaminação.Esta demonstração ajudará os investigadores com pouca experiência em NMR ou cultura celular a aprender a implementar essas técnicas em sistemas fúngicos e vegetais. Para preparar o meio de crescimento líquido sem rótulo, dissolva 6,5 gramas de extrato de levedura peptone dextrose ou pó YPD em 100 mililitros de água destilada e, em seguida, autoclave a solução resultante por 25 minutos a 134 graus Celsius. Para preparar o meio de crescimento sólido sem rótulo, adicione 6,5 gramas de ágar em pó YPD a 100 mililitros de água destilada, e autoclave o meio por 25 minutos a 121 graus Celsius, antes de esfriar o médio a aproximadamente 50 graus Celsius.Em seguida, transfira de 13 a 15 mililitros do meio de crescimento sólido derretido em placas de Petri de plástico estéril individuais, e coloque imediatamente as tampas nos pratos. Para preparar o carbono-13, meio de crescimento líquido com rótulo nitrogênio 15, ajuste um volume de 100 mililitros de isótopo contendo meio mínimo a um pH de 6,6 com ácido ou base conforme necessário. Em seguida, dissolva os sais listados na tabela em 100 mililitros de água destilada, adicione ao carbono-13, nitrogênio-15-rotulado meio de crescimento líquido, e autoclave a solução resultante por 25 minutos a 121 graus Celsius.Quando a solução for resfriada à temperatura ambiente, adicione 100 microliters de elementos de traço solução ao volume inteiro de carbono-13, nitrogênio-15-rotulado meio mínimo. Para cultivar os materiais fúngicos, use um laço inoculante para transferir uma pequena quantidade de fungos do armazenamento para uma placa YPD, e cultivar o fungo por dois dias em uma incubadora Celsius de 30 graus. No final da incubação, use um novo laço inoculante para transferir uma borda fúngica de crescimento ativo para o meio de crescimento líquido de carbono-13, com rótulo de nitrogênio 15, e coloque a cultura a 30 graus Celsius e 220 rotações por minuto por três a cinco dias em uma incubadora de agitação.Quando grandes quantidades do fungo cobrirem o fundo do frasco e flutuarem no líquido, colete os fungos por centrifugação e descarte o supernatante. Hidrate a pelota com uma solução adequada e use fórceps para coletar cerca de 0,5 gramas da pelota bem hidratada para análises de RMR e DNP. Em seguida, misture o material restante com uma solução de 20% de glicerol em um tubo cônico e coloque a amostra fúngica a menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.Para preparar o A.fumigatus para análise de NMR de estado sólido, primeiro use um saco de diálise com um corte de peso molecular de 3,5 quilodalton para dialisar o carbono-13 de 0,5 gramas, amostra fúngica de nitrogênio-15 com um litro de tampão fosfato de 10 milimônios a quatro graus Celsius durante três dias para remover pequenas moléculas do meio de crescimento. No final da diálise, transfira a amostra para um tubo de 15 mililitros para centrifugação, e embale de 70 a 80 miligramas da pasta de amostra uniformemente de carbono 13 e bem hidratada em um rotor de dióxido de zircônio de quatro milímetros. Use uma haste de metal para espremer suave e repetidamente a amostra, usando papel para absorver o excesso de água.Em seguida, tampa firmemente o rotor e insira a amostra no espectrômetro para caracterização de NMR de estado sólido. Para preparar o A.fumigatus para análise de DNP, adicione 100 microliters de matriz DNP em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por carbono-13, amostra fúngica com rótulo carbono 15 e dissolva 0,7 miligramas de agente polarizador em cada tubo para formar uma solução de estoque radical de 10 milimolares. Depois de dois a três minutos para garantir que os radicais sejam totalmente dissolvidos na solução, mergulhe 10 miligramas de carbono dialisado-13, amostra fúngica com nitrogênio-15 em 50 microlitrais da solução de agente polarizador, e use um pilão e uma argamassa para moer levemente a mistura para garantir a penetração dos radicais nas paredes celulares porosas.Adicione mais 30 microliters da solução radical à pelota moída para hidratar ainda mais a amostra fúngica, e embalar a pelota em um rotor de safira de 3,2 milímetros. Aperte levemente e remova o excesso de solvente DNP como demonstrado, e adicione um plugue de silicone de 3,2 milímetros para evitar a perda de hidratação. Em seguida, adicione o rotor a um espectrômetro NMR para experimento de rotina ou um espectrômetro DNP para medição do espectro aprimorado do DNP sob irradiação de micro-ondas.Para preparar materiais vegetais para estudos de DNP, use uma lâmina de barbear para cortar o material vegetal uniformemente com etiqueta de carbono 13 em pedaços de um a dois milímetros. Use uma argamassa e pilão para moer os pedaços em partículas menores até que o pó final tenha uma aparência homogênea. Adicione 40 microlitadores de 10 mililitros de solução de estoque radical ao material vegetal, e moer levemente a amostra por mais cinco minutos para garantir a mistura homogênea com o radical.Hidrate a amostra de terra com outros 20 microliters de solução de estoque radical, e embale a amostra de planta equilibrada em um rotor de safira de 3,2 milímetros para análise de DNP. Em seguida, insira um plugue de silicone para evitar a perda de hidratação e carregue a amostra no espectrômetro DNP. A rotulagem de isótopos aumenta substancialmente a sensibilidade da RMN e torna possível medir uma série de espectros de correlação de carbono bidimensional 13-carbono-13 e carbono-13-nitrogênio-15 para analisar a composição, hidratação, mobilidade e embalagem dos polímeros para sua integração para a construção de um modelo tridimensional de arquitetura de parede celular.Se sinais off-diagonal são difíceis de obter no espectro 2D carbono-13-carbono-13, a rotulagem estatística pode ter ocorrido. Os dois picos de carbono-13 em 96 e 92 partes por milhão são sinais de glicose de carbono 1. Portanto, suas fortes intensidades no espectro de polarização direta de carbono-13 quantitativo medido com longos atrasos de reciclagem de 35 segundos normalmente indicam o domínio de pequenas moléculas devido à diálise incompleta ou lavagem.Com amostras bem rotuladas, correlações de longo alcance podem ser medidas para detectar as proximidades espaciais das biomoléculas e construir um modelo estrutural das paredes celulares intactas. Essa técnica permite que a função estrutural em muitos materiais naturais e projetados seja explorada, facilitando estudos futuros de biomateriais ricos em carboidratos e polímeros funcionalizados. Como alguns fungos podem causar infecção ou doenças sistemáticas em humanos, certifique-se de lidar com materiais fúngicos em uma coifa de fluxo laminar para proteção e minimizar a exposição.

Research

JoVE Journal

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