Name: preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальный научный фонд через NSF OIA-1833040. Национальная Лаборатория высоких магнитного поля (NHMFL) поддерживается Национальный научный фонд через терминал DMR-1157490 и штата Флорида. MAS-DNP системы в NHMFL частично финансируется NIH S10 OD018519 и NSF CHE-1229170.

1. рост 13C, 15N-меченых Aspergillus fumigatus жидкой среды
<ol><li>Подготовка немеченого и 13C, 15N-меченых роста среднего Примечание: Оба дрожжевой экстракт Пептон Декстроза среднего (YPD) и улучшенная минимальный средний43 использовались для поддержания грибков...

По сравнению с биохимическими методами, твердотельного ЯМР имеет преимущества как метод неразрушающего и высоким разрешением. NMR также количественные композиционного анализа, и в отличие от большинства других аналитических методов, делает не имеют неопределенности представлен огран...

Углеводы играть центральную роль в различных биологических процессах, таких как хранение энергии, структурной здание и клеточных признание и адгезии. Они обогащаются в клеточной стенки, который является основным компонентом в растений, грибов, водорослей и бактерий в1,2,3. Стены клетки служит центральным источником для производства биотоплива и биоматериалов, а также перспективные цели для антибактериальной терапии4,5,6,,78 , 9.
Современного понимания этих сложных материалов существенно продвинулась в течение десятилетий усилия, которые были посвящены структурных характеристик, используя четыре основных биохимических и генетических методов. Первый основной метод опирается на последовательные процедуры с использованием агрессивных химикатов или ферменты сломать стены клетки на различные части, которые следуют композиционные и связь анализ сахара в каждой фракции10. Этот метод проливает свет на домен распределения полимеров, но толкование может ввести в заблуждение из-за физических и химических свойств биомолекул. Например трудно определить ли щелочно извлекаемая часть происходит от одного домена менее структурированные молекул или пространственно разделенных молекул с сопоставимыми растворимость. Во-вторых, извлеченные части или всей клеточной стенки также может быть измерена с помощью решения ЯМР для определения ковалентных связей, также называются сшивки, между различными молекулами11,12,13, 14,15. Таким образом может быть исследован Подробная структура ковалентных якорей, но могут существовать ограничения из-за низкой растворимости полисахаридов, относительно небольшое количество сайтов сшивки и невежество non ковалентные эффектов, что стабилизирует полисахарид упаковка, включая водород склеивание, Ван дер Ваальса силы, электростатического взаимодействия и полимерные запутанности. В-третьих был сродство определяется в пробирке с помощью изолированных полисахариды16,,1718,19, но очистки, которые могут существенно изменить процедуры Структура и свойства этих биомолекул. Этот метод также не удается реплицировать сложные осаждения и Ассамблеи макромолекул после биосинтеза. Наконец фенотип, морфологию клеток и механических свойств генетических мутантов с ослабленной производства некоторых компонентов клеточной стенки пролить свет на структурных функций полисахаридов, но более Молекулярные доказательства необходимы для преодоления этих макроскопические наблюдения с функцией инженерии белка механизмов20.
Последние достижения в разработке и применении многомерных твердотельного ЯМР спектроскопии ввели уникальную возможность для решения этих структурных головоломок. 2D/3D твердотельного ЯМР эксперименты позволяют разрешением исследование состава и архитектуре богатых углеводами материалов в родном государстве без крупных возмущений. Структурные исследования были успешно проведены на начальных и средних клеточной стенки растений, каталитически обработанной биомассы, бактериальные биопленки, пигмент призраков в грибов и, недавно, авторы, нетронутыми клеточной стенки в патогенных грибов Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. Разработка динамических ядерной поляризации (DNP)32,33,34,,3536,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 существенно облегчает выяснение структурной ЯМР как повышение чувствительности, DNP заметно сокращает экспериментальной время на эти сложные биоматериалов. Протокол, описанные здесь подробности процедуры изотоп маркировки гриб A. fumigatus и подготовке грибковых и образцы растений для твердотельного ЯМР и ДНП характеристику. Аналогичные процедуры маркировки должны быть применимы для других грибов с измененной среднего, и процедуры подготовки образца должны быть вообще применимы для других богатых углеводами биоматериалов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>12054-85-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical weighing balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>B730439218</td>
			<td>Model PA84C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioclave 16 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470230-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco corporation</td>
			<td>302319100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9222</td>
			<td>store at 15-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Honeywell|Fluka</td>
			<td>60820</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7202152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151874</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td>&#8805;99 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 3.2 kDa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2272</td>
			<td>132724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>750004271</td>
			<td>Maximum RCF 25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR-MAS Disposable Insert Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B4493</td>
			<td>Kel-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14498</td>
			<td>&#8805;99+ %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034998</td>
			<td>store at 18-26 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) Chloride Tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>11563</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-254</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>B706689216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>13235-36-9</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33399</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12C3, d8-glycerol</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratory</td>
			<td>CDLM-8660</td>
			<td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma Alrdrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;99 % (CP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-sodium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;98 % 15N, &#8805;99 (cp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire NMR rotor</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>B6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm Silicone plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm MAS Rotor Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>H14355</td>
			<td>Zirconia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr

Этот протокол показывает, как равномерно 13C, 15N-меченых грибковых материалы могут быть произведены и как эти мягкие материалы должны быть продолженным для твердотельного ЯМР и повышенной чувствительности DNP экспериментов. Процедура обработки образца биомассы растений также подробно. Этот метод позволяет измерение серии 1D и 2D 13C -13C /15N корреляции спектры, которые позволяет с высоким разрешением структурных разъяснения сложных биоматериалов в их родном государстве, с минимальными возмущений. Изотоп маркировки может быть проверен количественного определения интенсивности в 1D спектров и эффективность переноса поляризации в спектрах 2D корреляции. Успех динамического ядерной поляризации (DNP) пробоподготовки может оцениваться на коэффициент повышения чувствительности. Дальнейшие эксперименты, структурные аспекты белки и полисахариды приведет к модели трехмерный архитектуры. Эти методы могут быть модифицировать и адаптировать для изучения широкого спектра материалов богатых углеводами, включая природные стенки клеток растений, грибов, водорослей и бактерий, а также синтезируется или углеводов полимеров и их комплекс с другими молекул.

Изотоп маркировки существенно повышает чувствительность ЯМР и делает возможным для измерения серии 2D 13C -13C и 13C -15N корреляции спектры для анализа состава, гидратации, мобильность и упаковка Полимеры, которые будут интегрированы построить трехм...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR at JoVE.com

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Подготовка грибковых и растительных материалов для структурной разяснения, используя динамический ядерной поляризации твердотельного ЯМР

Протокол для подготовки 13C,15N-меченых грибковых и растений образцов для многомерных твердотельного ЯМР спектроскопии и динамических ядерных поляризации (DNP) расследований представил.

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Этот протокол может быть использован для подготовки грибковых и растительных материалов для твердого ядерного магнитного резонанса, или ЯМР, и динамической ядерной поляризации, или DNP, экспериментов для сложной характеристики биосистемы. Этот метод позволяет исследовать биоматериалы до уровня атомного разрешения в их родной среде, например, в целых клетках. Приобретение высококачественной структурной информации о грибковых материалах поможет в разработке противогрибковых препаратов.Метод дает представление о составе и структуре сложных углеводов в стенках грибковых клеток и может быть применен ко многим богатым углеводами организмам, включая растения, грибы, водоросли и бактерии. Некоторые исследователи могут бороться с грибкового загрязнения в их клеточных культур. Мой совет заключается в стерилизации среды и оборудования тщательно перед использованием для предотвращения этого загрязнения.Эта демонстрация поможет следователям с небольшим опытом работы в ЯМР или клеточной культуры, чтобы узнать, как реализовать эти методы в грибковых и растительных систем. Для приготовления неофощенной жидкой среды роста растворяют 6,5 грамма дрожжевого экстракта пептона декстрозы или порошка YPD в 100 миллилитров дистиллированной воды, а затем автоклав полученного раствора в течение 25 минут при 134 градусах Цельсия. Чтобы подготовить неофощенный твердый рост среды, добавить 6,5 граммов YPD агар порошок 100 миллилитров дистиллированной воды, и автоклав среды в течение 25 минут при 121 градусов по Цельсию, до охлаждения среды примерно до 50 градусов по Цельсию.Затем перенесите от 13 до 15 миллилитров расплавленной среды твердого роста в отдельные стерильные пластиковые блюда Петри и немедленно поместите крышки на посуду. Для подготовки углерода-13, азота-15 помечены жидкого роста среды, настроить 100-миллилитровый объем изотопов, содержащих минимальную среду до рН 6,6 с кислотой или базы по мере необходимости. Затем растворите соли, перечисленные в таблице в 100 миллилитров дистиллированной воды, добавьте в углерод-13, азот-15 помечены жидкой среды роста, и автоклав в результате раствор в течение 25 минут при 121 градусов по Цельсию.Когда раствор остынет до комнатной температуры, добавьте 100 микролитров раствора микроэлементов к всему объему углерода-13, азот-15 помечены минимальной средой. Чтобы вырастить грибковые материалы, используйте интокуляции петли для передачи небольшого количества грибов из хранения на пластину YPD, и культуры грибок в течение двух дней в 30-градусный инкубатор по Цельсию. В конце инкубации используйте новую инокулятную петлю для переноса активно растущего грибкового края в углерод-13, на этикетке азота-15 жидкого роста среды, и поместите культуру на 30 градусов по Цельсию и 220 вращений в минуту в течение трех-пяти дней в трясущимся инкубаторе.Когда большое количество гриба покрывают дно колбы и плавают в жидкости, собирать грибы центрифугации и отказаться от супернатанта. Гидрат гранулы с соответствующим раствором, и использовать типсы, чтобы собрать около 0,5 граммов хорошо увлажненной гранулы для ЯМР и DNP анализов. Затем смешайте оставшийся материал с раствором 20%глицерола в конической трубке и поместите грибковый образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию для длительного хранения.Чтобы подготовить A.fumigatus для твердотельных ЯМР-анализа, сначала используйте диализный мешок с 3,5-килодальтонным молекулярным весом, чтобы облизать 0,5-граммовый углерод-13, азот-15-маркированный грибковый образец против одного литра 10-миллимолярного фосфатного буфера при четырех градусах Цельсия в течение трех дней, чтобы удалить мелкие молекулы из среды роста. В конце диализа перенесите образец в 15-миллилитровую трубку для центрифугации и упакуйте от 70 до 80 миллиграммов равномерно маркированной и хорошо увлажненной образцовой пасты в четырехмиллиметровый ротор диоксида циркония. Используйте металлический стержень, чтобы аккуратно и повторно сжать образец, используя бумагу, чтобы поглотить избыток воды.Затем плотно крышка ротора, и вставить образец в спектрометр для твердого состояния ЯМР характеристики. Чтобы подготовить A.fumigatus для анализа DNP, добавьте 100 микролитров матрицы DNP в один 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку на углерод-13, углерод-15-маркированный грибковый образец, и растворите 0,7 миллиграмма поляризационного агента к каждой трубке, чтобы сформировать 10-миллимолярный радикальный фондовый раствор. После вихря в течение двух-трех минут, чтобы убедиться, что радикалы полностью растворяются в растворе, замочите 10 миллиграммов обезболенного углерода-13, азот-15 помечены грибковый образец в 50 микролитров раствора поляризационного агента, и использовать пестик и раствор, чтобы мягко молоть смесь для обеспечения проникновения радикалов в пористые клеточные стенки.Добавьте еще 30 микролитров радикального раствора в наземные гранулы для дальнейшего увлажнения грибкового образца и упакуйте гранулы в 3,2-миллиметровый сапфировый ротор. Сожмите мягко и удалить избыток растворителя DNP, как попродемонстрировано, и добавить 3,2-миллиметровый силиконовый штепсельной вилки, чтобы предотвратить потерю гидратации. Затем добавьте ротор в спектрометр ЯМР для рутинного эксперимента или спектрометр DNP для измерения спектра DNP-расширенного под микроволновым облучением.Чтобы подготовить растительные материалы для исследований DNP, используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать равномерно углерод-13-маркированный растительный материал на один-два миллиметра штук. Используйте раствор и пестик, чтобы измельчить кусочки на мелкие частицы, пока окончательный порошок имеет однородный вид. Добавьте 40 микролитров 10-миллимолярского раствора радикала в растительный материал и слегка измельчите образец еще на пять минут, чтобы обеспечить однородное смешивание с радикалом.Увлажняйте образец грунта еще 20 микролитров радикального раствора, и упакуйте equilibrated образец растения в 3,2-миллиметровый сапфировый ротор для анализа DNP. Затем вставьте силиконовую вилку, чтобы избежать потери гидратации, и загрузите образец на спектрофотометр DNP. Изотопная маркировка существенно повышает чувствительность ЯМР и позволяет измерять серию двухмерных углерод-13-углерод-13 и углерод-13-азот-15 для анализа состава, гидратации, подвижности и упаковки полимеров для их интеграции для строительства трехмерной модели архитектуры клеточной стенки.Если в спектре 2D-углерода-13-13 трудно получить внедиагнальные сигналы, то, возможно, имели место статистические маркировки. Два пика углерода-13 на 96 и 92 частей на миллион являются подписи углерода-1 сигналы глюкозы. Поэтому их сильная итензивсть в количественных спектрах прямой поляризации углерода-13, измеренных с длительными задержками рециркуляции в 35 секунд, обычно указывает на доминирование малых молекул из-за неполного диализа или стирки.С хорошо помеченными образцами, долгосрочные корреляции могут быть дополнительно измерены для обнаружения пространственной близости биомолекул и построения структурной модели нетронутых клеточных стенок. Этот метод позволяет исследовать структуру многих природных и инженерных материалов, облегчая будущие исследования богатых углеводами биоматериалов и функционализированных полимеров. Как некоторые грибы могут вызвать инфекцию или систематические заболевания у людей, не забудьте обрабатывать грибковые материалы в ламинарный капюшон потока для защиты и свести к минимуму воздействие.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Белок, Способ получения для высокой пропускной способности идентификации белков, взаимодействующих с ядерной кофактора Используя LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Изменение бакуловирусы векторы выражения производить выделяется растительных белков в клетках насекомых

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Измерения взаимодействий шаровых и волокнистых белков спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабной Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Быстрая подготовка сетки для криоэлектроно-микроскопии с временным разрешением

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Подготовка образцов опорных пленок в просвечивающей электронной микроскопии с использованием опорного флотационного блока

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Крупномасштабные мультиомные исследования геномных ассоциаций (Mo-GWAS): руководство по подготовке и нормализации образцов

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...