Name: preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00
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Este trabajo fue financiado por National Science Foundation a través de OIA NSF-1833040. El laboratorio nacional de campo magnético alto (NHMFL) es apoyado por la National Science Foundation a través del DMR-1157490 y el estado de Florida. El sistema MAS-DNP en el NHMFL es financiado en parte por los NIH S10 OD018519 y NSF CHE-1229170.

1. crecimiento de 13C, 15N-labeled Aspergillus fumigatus medio líquido
<ol><li>Elaboración de etiqueta y 13C, 15medio marcado con N Nota: Ambos medio de levadura extracto peptona dextrosa (YPD) y la media mínima mejora43 se utilizaron para el mantenimiento de la cultura fungicida. Se realizan todos los pasos después de autoclavar en campana de flujo laminar para reducir al mínimo la contaminación.<ol>
<li>Preparación de medio líquid...

En comparación con los métodos bioquímicos, NMR de estado sólido tiene ventajas como una técnica no destructiva y de alta resolución. NMR es también cuantitativa en el análisis compositivo, y a diferencia de la mayoría otros métodos analíticos, no han las incertidumbres introducidas por la solubilidad limitada de los biopolímeros. Establecimiento del protocolo actual facilita futuros estudios sobre biomateriales ricos en hidratos de carbono y polímeros funcionalizados. Sin embargo, debe señalarse que el an?...

Hidratos de carbono juegan un papel central en varios procesos biológicos tales como almacenamiento de energía, construcción estructural y reconocimiento celular y adhesión. Se enriquecen en la pared celular, que es un componente fundamental en plantas, hongos, algas y bacterias1,2,3. La pared celular sirve como una fuente central para la producción de biocombustibles y biomateriales, así como un objetivo prometedor para terapias antimicrobiana4,5,6,7,8 , 9.
La comprensión contemporánea de estos materiales complejos se ha avanzado sustancialmente por décadas de esfuerzos que se dedicaron a la caracterización estructural mediante cuatro principales métodos bioquímicos o genéticos. El primer método principal se basa en tratamientos secuenciales usando productos químicos fuertes o enzimas para romper las paredes celulares en diferentes porciones, que es seguida de composición y análisis del acoplamiento de los azúcares en cada fracción de10. Este método arroja luz sobre la distribución del dominio de los polímeros, pero la interpretación puede ser engañosa debido a las propiedades químicas y físicas de las biomoléculas. Por ejemplo, es difícil determinar si la fracción extraíble de álcali origina de un solo dominio de moléculas menos estructurados o de moléculas espacialmente separadas con solubilidad comparable. En segundo lugar, las porciones extraídas o toda las paredes celulares puede también medirse usando la solución NMR para determinar la vinculación covalente, denominada también como entrecruzamiento entre moléculas diferentes11,12,13, 14,15. De esta manera, la detallada estructura de covalentes anclajes podría ser sondada, pero pueden existir limitaciones debido a la baja solubilidad de los polisacáridos, el relativamente pequeño número de sitios de entrecruzamiento y la ignorancia de los efectos no covalente que estabiliza embalaje de polisacáridos, incluyendo la vinculación de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, interacción electrostática y enredo de polímero. En tercer lugar, la afinidad ha sido determinado en vitro usando polisacáridos aislados16,17,18,19, pero la purificación procedimientos pueden alterar sustancialmente la estructura y propiedades de estas biomoléculas. Este método también es incapaz de replicar la deposición sofisticada y montaje de macromoléculas después de biosíntesis. Finalmente, el fenotipo, la morfología celular y propiedades mecánicas de los mutantes genéticos con producción atenuada de cierto componente de la pared celular arrojan luces sobre las funciones estructurales de los polisacáridos, pero se necesitan pruebas más molecular para estos observaciones macroscópicas con la función de ingeniería de proteína maquinarias20.
Los recientes avances en el desarrollo y aplicación de la espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional han introducido una oportunidad única para resolver estos rompecabezas estructurales. Experimentos de NMR estado sólidos 2D/3D permiten la investigación de alta resolución de la composición y arquitectura de materiales ricos en hidratos de carbono en el estado nativo sin mayor perturbación. Se han realizado con éxito estudios estructurales en primaria y pared celular secundaria de las plantas, la biomasa tratada catalíticamente, biofilm bacteriano, el pigmento fantasmas en hongos y, recientemente por los autores, las paredes celulares intactas en un hongo patógeno Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. el desarrollo de la polarización nuclear dinámica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 substancialmente facilita la elucidación estructural de NMR como la mejora de la sensibilidad por DNP notablemente acorta el tiempo experimental de estos biomateriales complejo. El protocolo descrito aquí detalla los procedimientos para el hongo a. fumigatus de isótopo-etiquetado y preparación de hongos y plantas muestras de estado sólido caracterización NMR y DNP. Similares procedimientos de etiquetado debe ser aplicable a otros hongos con medio alterado, y los procedimientos de preparación de la muestra deben ser generalmente aplicables a otros biomateriales ricos en hidratos de carbono.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>12054-85-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical weighing balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>B730439218</td>
			<td>Model PA84C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioclave 16 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470230-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco corporation</td>
			<td>302319100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9222</td>
			<td>store at 15-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Honeywell|Fluka</td>
			<td>60820</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7202152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151874</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td>&#8805;99 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 3.2 kDa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2272</td>
			<td>132724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>750004271</td>
			<td>Maximum RCF 25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR-MAS Disposable Insert Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B4493</td>
			<td>Kel-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14498</td>
			<td>&#8805;99+ %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034998</td>
			<td>store at 18-26 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) Chloride Tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>11563</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-254</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>B706689216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>13235-36-9</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33399</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12C3, d8-glycerol</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratory</td>
			<td>CDLM-8660</td>
			<td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma Alrdrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;99 % (CP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-sodium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;98 % 15N, &#8805;99 (cp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire NMR rotor</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>B6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm Silicone plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm MAS Rotor Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>H14355</td>
			<td>Zirconia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr

Este protocolo muestra cómo uniformemente 13C, 15N etiquetado materiales fungicidas pueden ser producidos y experimentos de cómo estos materiales blandos deben ser procedidos para NMR de estado sólido y la sensibilidad mejorada del DNP. También se detalla el procedimiento de procesamiento de las muestras de biomasa vegetal. Este método permite la medición de una serie de 1D y 2D 13C -13C / espectros de correlaciones de15N, que permite alta resolución elucidación estructural de complejos biomateriales en su estado natal, con la mínima perturbación. El isótopo de etiquetado puede ser examinado mediante la cuantificación de la intensidad en espectros 1D y la eficacia de la transferencia de polarización en espectros de correlación 2D. El éxito de la preparación de la muestra de la polarización nuclear dinámica (DNP) puede ser evaluado por el factor de mejora de la sensibilidad. Otros experimentos examinando los aspectos estructurales de los polisacáridos y las proteínas dará lugar a un modelo de la arquitectura tridimensional. Estos métodos pueden ser modificados y adaptados para investigar una amplia gama de materiales ricos en hidratos de carbono, incluyendo las paredes de la célula naturales de plantas, hongos, algas y bacterias, así como sintetizados o diseñado polímeros de hidratos de carbono y su complejo con otros moléculas.

El etiquetado del isótopo sustancialmente incrementa la sensibilidad de NMR y hace posible medir una serie de 2D 13C -13C y 13C -15N espectros de correlación para analizar la composición, la hidratación, la movilidad y el embalaje de polímeros, que se integrarán para construir un modelo tridimensional de la arquitectura de la pared celular (figura 1). Si el etiquetado uniforme tiene éxito, un conjunto complet...

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Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica

Se presenta un protocolo para preparar 13C,15marcado con N muestras de hongos y plantas para espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional y las investigaciones de la polarización nuclear dinámica (DNP).

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Este protocolo se puede utilizar para preparar materiales fúngicos y vegetales para la resonancia magnética nuclear de estado sólido, o RMN, y la polarización nuclear dinámica, o DNP, experimentos para la caracterización compleja del biosistema. Esta técnica nos permite investigar biomateriales a un nivel de resolución atómica en su entorno nativo, por ejemplo, en células enteras. La adquisición de información estructural de alta resolución sobre materiales fúngicos ayudará en el desarrollo de fármacos antifúngicos.El método proporciona información sobre la composición y la estructura de carbohidratos complejos en las paredes celulares de hongos y se puede aplicar a muchos organismos ricos en carbohidratos, incluyendo plantas, hongos, algas y bacterias. Algunos investigadores pueden tener problemas con la contaminación por hongos en sus cultivos celulares. Mi consejo es esterilizar el medio y el equipo a fondo antes de su uso para evitar esta contaminación.Esta demostración ayudará a los investigadores con poca experiencia en RMN o cultivo celular a aprender cómo implementar estas técnicas en sistemas de hongos y plantas. Para preparar un medio de crecimiento líquido sin etiquetar, disolver 6,5 gramos de dextrosa de peptona de extracto de levadura o polvo de YPD en 100 mililitros de agua destilada, y luego autoclave la solución resultante durante 25 minutos a 134 grados Celsius. Para preparar un medio de crecimiento sólido sin etiquetar, agregue 6,5 gramos de polvo de agar YPD a 100 mililitros de agua destilada, y autoclave el medio durante 25 minutos a 121 grados centígrados, antes de enfriar el medio a aproximadamente 50 grados centígrados.A continuación, transfiera de 13 a 15 mililitros del medio de crecimiento sólido fundido a platos Petri de plástico estéril individuales, e inmediatamente coloque las tapas en los platos. Para preparar el medio de crecimiento líquido con etiqueta de nitrógeno-13, nitrógeno-15, ajuste un volumen de 100 mililitros de isótopo medio mínimo que contenga un pH de 6,6 con ácido o base según sea necesario. A continuación, disolver las sales enumeradas en la tabla en 100 mililitros de agua destilada, añadir al medio de crecimiento líquido con etiqueta de carbono-13, nitrógeno-15, y autoclave la solución resultante durante 25 minutos a 121 grados Celsius.Cuando la solución se haya enfriado a temperatura ambiente, añada 100 microlitros de solución de oligoelementos a todo el volumen de carbono-13, nitrógeno-15-etiquetado medio mínimo. Para cultivar los materiales fúngicos, utilice un bucle de inoculación para transferir una pequeña cantidad de hongos del almacenamiento a una placa YPD, y el cultivo del hongo durante dos días en una incubadora de grados Celsius de 30 grados. Al final de la incubación, utilice un nuevo bucle de inoculación para transferir un borde de hongos de crecimiento activo al medio de crecimiento líquido con etiqueta de carbono-13, nitrógeno-15, y coloque el cultivo en 30 grados celsius y 220 rotaciones por minuto durante tres a cinco días en una incubadora de temblores.Cuando grandes cantidades del hongo cubran el fondo del matraz y floten en el líquido, recoja los hongos por centrifugación y deseche el sobrenadante. Hidratar el pellet con una solución adecuada, y utilizar fórceps para recoger alrededor de 0,5 gramos del pellet bien hidratado para análisis de RMN y DNP. A continuación, mezcle el material restante con una solución de 20% de glicerol en un tubo cónico y coloque la muestra de hongos a menos 80 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo.Para preparar el A.fumigatus para el análisis de RMN de estado sólido, primero utilice una bolsa de diálisis con un corte de peso molecular de 3.5-kilodalton para marcar la muestra de hongos con etiqueta de nitrógeno de 0,5 gramos de carbono-13 contra un litro de búfer de fosfato de 10 mililitrolares a cuatro grados Celsius durante tres días para eliminar moléculas pequeñas del crecimiento medio. Al final de la diálisis, transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros para centrifugación, y empaque de 70 a 80 miligramos de la pasta de muestra etiquetada uniformemente con carbono-13 y bien hidratada en un rotor de dióxido de circonio de cuatro milímetros. Utilice una varilla metálica para apretar suavemente y repetitivamente la muestra, utilizando papel para absorber el exceso de agua.A continuación, tapone firmemente el rotor e inserte la muestra en el espectrómetro para la caracterización de RMN de estado sólido. Para preparar el A.fumigatus para el análisis de DNP, agregue 100 microlitros de matriz DNP en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por muestra de hongos con etiqueta de carbono-15 y disuelva 0,7 miligramos de agente polarizador a cada tubo para formar una solución de stock radical de 10 milificaciones. Después de vórtices durante dos a tres minutos para asegurar que los radicales se disuelvan completamente en la solución, remoje 10 miligramos de carbono-13 dializado, muestra de hongos etiquetada con nitrógeno-15 en 50 microlitros de la solución del agente polarizador, y utilice un pestillo y un mortero para moler suavemente la mezcla para asegurar la penetración de los radicales en las paredes celulares porosas.Agregue otros 30 microlitros de la solución radical al pellet molido para hidratar aún más la muestra de hongos, y empaquete el pellet en un rotor de zafiro de 3,2 milímetros. Apriete suavemente y retire el exceso de disolvente DNP como se ha demostrado, y agregue un tapón de silicona de 3,2 milímetros para evitar la pérdida de hidratación. A continuación, añada el rotor a un espectrómetro de RMN para un experimento de rutina o un espectrómetro DNP para la medición del espectro mejorado por DNP bajo irradiación de microondas.Para preparar materiales vegetales para estudios DNP, utilice una cuchilla de afeitar para cortar el material vegetal etiquetado uniformemente con carbono-13 en piezas de uno a dos milímetros. Utilice un mortero y un mortero para moler las piezas en partículas más pequeñas hasta que el polvo final tenga un aspecto homogéneo. Añadir 40 microlitros de solución de stock radical de 10 mililitros al material vegetal, y moler ligeramente la muestra durante cinco minutos adicionales para asegurar una mezcla homogénea con el radical.Hidratar la muestra de tierra con otros 20 microlitros de solución de stock radical, y empaquetar la muestra de planta equilibrada en un rotor de zafiro de 3,2 milímetros para el análisis DNP. A continuación, inserte un tapón de silicona para evitar la pérdida de hidratación y cargue la muestra en el espectrofotómetro DNP. El etiquetado de isótopos mejora sustancialmente la sensibilidad a la RMN y permite medir una serie de espectros de correlación de carbono-13-carbono-13 y carbono-13-nitrógeno-15 bidimensionales para analizar la composición, hidratación, movilidad y embalaje de los polímeros para su integración para la construcción de un modelo tridimensional de arquitectura de pared celular.Si las señales fuera de la diagonal son difíciles de obtener en el espectro 2D de carbono-13-carbono-13, el etiquetado estadístico podría haber ocurrido. Los dos picos de carbono-13 de 96 y 92 partes por millón son señales de carbono-1 de la firma de glucosa. Por lo tanto, sus intensidades fuertes en los espectros cuantitativos de polarización directa de carbono-13 medidos con largos retrasos de reciclaje de 35 segundos suelen indicar el dominio de moléculas pequeñas debido a la diálisis o lavado incompletos.Con muestras bien etiquetadas, las correlaciones de largo alcance se pueden medir aún más para detectar las proximidades espaciales de las biomoléculas y para construir un modelo estructural de las paredes celulares intactas. Esta técnica permite explorar la función de la estructura en muchos materiales naturales y diseñados, facilitando estudios futuros de biomateriales ricos en carbohidratos y polímeros funcionalizados. Como algunos hongos pueden causar infecciones o enfermedades sistemáticas en los seres humanos, asegúrese de manejar materiales fúngicos en una capucha de flujo laminar para protegerse y minimizar la exposición.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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