Name: preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR at JoVE.com

Detta arbete stöds av National Science Foundation genom NSF OIA-1833040. Nationella laboratoriet för höga magnetfält (NHMFL) stöds av National Science Foundation genom DMR-1157490 och delstaten Florida. MAS-DNP systemet på NHMFL är delvis finansierad av NIH S10 OD018519 och NSF CHE-1229170.

1. tillväxt av 13C, 15N-märkt Aspergillusfumigatus flytande Medium
<ol><li>Beredning av omärkta och 13C, 15N-märkt odlingsmedium Obs: Både jäst extrakt pepton dextros medium (YPD) och den förbättra minimal medium43 användes för underhåll av svamp kultur. Alla steg efter autoklavering utförs i en LAF att minimera kontaminering.<ol>
<li>Beredning av omärkta flytande medium: lös 6,5 g YPD pulver i 100 mL destillerat vatten och se...

Jämfört med de biokemiska metoderna, har solid-state NMR fördelar som en icke-förstörande och högupplösande teknik. NMR är också kvantitativa sammansättning analys, och till skillnad från de flesta andra analysmetoder, gör inte har osäkerheten introducerades av biopolymerer begränsad löslighet. Inrättandet av det nuvarande protokollet underlättar framtida studier på kolhydratrika biomaterial och functionalized polymerer. Det bör dock noteras att resonans tilldelning och dataanalys kan vara tidskrävand...

Kolhydrater har en central roll i olika biologiska processer som energilagring, strukturella byggnad, och cellulära erkännande och vidhäftning. De är berikade i cellväggen, som är en grundläggande komponent i växter, svampar, alger och bakterier1,2,3. Cellväggen fungerar som en central källa för produktion av biobränsle och biomaterial, samt en lovande måltavla för antimikrobiella terapier4,5,6,7,8 , 9.
Den samtida förståelsen av dessa komplexa material har tidigarelagts väsentligen av decenniers ansträngningar som ägnades åt strukturella karakterisering med fyra stora biokemiska eller genetiska metoder. Den första stora metoden bygger på sekventiella behandlingar med starka kemikalier eller enzymer bryta ner cellväggarna i olika delar, som följs av sammansättning och länkage analys av socker i varje bråkdel10. Denna metod belyser domän fördelningen av polymerer, men tolkningen kan vara missvisande på grund av de kemiska och fysikaliska egenskaperna av biomolekyler. Exempelvis är det svårt att avgöra huruvida den alkali-extraherbara fraktionen härstammar från en enda domän av mindre strukturerade molekyler eller rumsligt separerade molekyler med jämförbara löslighet. Andra, den extraherade delar eller hela cellväggar kan också mätas med hjälp av lösning NMR för att bestämma kovalenta kopplingarna, också betecknas som crosslinking, mellan olika molekyler11,12,13, 14,15. På detta sätt kovalent ankare detaljerad struktur kunde bli utforskad, men begränsningar kan finnas på grund av den låga lösligheten av polysackarider, det relativt lilla antalet crosslinking platser och okunnighet om icke-kovalenta effekter som stabiliserar polysackarid packning, inklusive väte-limning, van der Waals kraften, elektrostatiska växelverkan och polymer entanglement. Tredje, affinitet har varit beslutsam i vitro med isolerade polysackarider16,17,18,19, men rening förfaranden kan väsentligt förändra struktur och egenskaper hos dessa biomolekyler. Denna metod underlåter också att replikera den sofistikerade nedfall och sammansättningen av makromolekyler efter biosyntes. Slutligen den fenotyp, cellmorfologi och mekaniska egenskaper av genetiska mutanter med försvagat produktion av vissa cellväggen komponent kasta ljus på de strukturella funktionerna av polysackarider, men mer molekylära bevis behövs för att överbrygga dessa makroskopiska observationer med funktionen konstruerad av protein maskinerier20.
Senaste framstegen inom utveckling och tillämpning av flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi har infört en unik möjlighet för att lösa dessa strukturella pussel. 2D/3D solid-state NMR-experimenten aktivera högupplösta utredning av sammansättningen och arkitekturen av kolhydratrika material i native staten utan större störningar. Strukturella studier har genomförts framgångsrikt på både primära och sekundära cellväggar av växter, katalytiskt behandlade biomassa, bakteriell biofilm, pigmentet spöken i svampar och nyligen av författarna, intakta cellväggar i en patogen svamp Aspergillusfumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. utvecklingen av dynamiska nukleära polarisering (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 underlättar väsentligt NMR strukturella förtydligandet som känslighet förbättrande av DNP förkortar markant experimentella tiden på dessa komplexa biomaterial. Protokollet beskrivs här information om förfarandena för isotopen-märkning svampen A. fumigatus och förbereda svamp och växtprover för solid-state NMR och DNP karakterisering. Liknande märkning förfaranden bör vara tillämplig på andra svampar med förändrad medium, och prov förberedelse förfarandena bör vara allmänt tillämpliga på andra kolhydratrika biomaterial.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>12054-85-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical weighing balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>B730439218</td>
			<td>Model PA84C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioclave 16 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470230-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Labconco corporation</td>
			<td>302319100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9222</td>
			<td>store at 15-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Honeywell|Fluka</td>
			<td>60820</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7202152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151874</td>
			<td>99.9 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td>&#8805;99 atom % D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 3.2 kDa</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2272</td>
			<td>132724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dipotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraus Megafuge 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>750004271</td>
			<td>Maximum RCF 25,830 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HR-MAS Disposable Insert Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B4493</td>
			<td>Kel-F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>14498</td>
			<td>&#8805;99+ %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034998</td>
			<td>store at 18-26 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) Chloride Tetrahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>11563</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium Phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-254</td>
			<td>&#8805;99 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>B706689216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>13235-36-9</td>
			<td>&#8805;99.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>33399</td>
			<td>&#8805;98 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12C3, d8-glycerol</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratory</td>
			<td>CDLM-8660</td>
			<td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-glucose</td>
			<td>Sigma Alrdrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;99 % (CP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N-sodium nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>364606</td>
			<td>&#8805;98 % 15N, &#8805;99 (cp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire NMR rotor</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>B6939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm Silicone plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>B7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm MAS Rotor Kit</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>H14355</td>
			<td>Zirconia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of fungal and plant materials for structural elucidation using dynamic nuclear polarization solid-state nmr

Detta protokoll visar hur jämnt 13C, 15N-märkt svamp material kan produceras och hur dessa mjuka material bör fortsättas för solid-state NMR och utökad känslighet DNP experiment. Till exempel förädling av växtbiomassa är också detaljerade. Denna metod tillåter mätning av en rad 1D och 2D 13C -13C /15N korrelationer spectra, som möjliggör högupplöst strukturella förtydligandet av komplexa biomaterial i sitt ursprungliga tillstånd, med minimal störning. Isotop-märkning kan granskas av kvantifiera intensiteten i 1D spectra och polarisering spruttryck i 2D korrelation spectra. Framgången för dynamisk nukleära polarisering (DNP) provberedning kan utvärderas av den känslighet enhancement faktorn. Ytterligare experiment att undersöka de strukturella aspekterna av polysackarider och proteiner leder till en modell av den tredimensionella arkitekturen. Dessa metoder kan ändras och anpassas för att undersöka en rad olika kolhydratrika material, inklusive naturliga cellväggarna i växter, svampar, alger och bakterier, samt syntetiserade eller utformade kolhydratpolymerer och deras komplex med andra molekyler.

Isotopen märkning avsevärt förbättrar NMR känslighet och gör det möjligt för mäta en serie 2D 13C -13C och 13C -15N korrelation spectra att analysera den sammansättning, återfuktning, rörlighet och packning av polymerer, som kommer att integreras för att konstruera en tredimensionell modell av cellväggen arkitekturen (figur 1). Om enhetlig märkning lyckas, en komplett uppsättning 1D 13C oc...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR at JoVE.com

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Beredning av svamp och växtmaterial för strukturella klarläggande använder dynamisk nukleära polarisering Solid-State NMR

Ett protokoll för att förbereda 13C,15N-märkt svamp och växt prover för flerdimensionella solid-state NMR spektroskopi och dynamiska nukleära polarisering (DNP) undersökningar presenteras.

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Detta protokoll kan användas för att förbereda svamp och växtmaterial för solid-state kärnmagnetisk resonans, eller NMR, och dynamisk kärnpolarisering, eller DNP, experiment för komplexa biosystem karakterisering. Denna teknik gör det möjligt för oss att undersöka biomaterial till en atomär upplösningsnivå i deras inhemska miljö, till exempel i hela celler. Förvärvet av högupplöst strukturell information om svampmaterial kommer stöd i utvecklingen av svampdödande läkemedel.Metoden ger insikt i sammansättning och struktur av komplexa kolhydrater i svampcellväggar och kan appliceras på många kolhydratrika organismer, inklusive växter, svampar, alger, och bakterier. Vissa utredare kan kämpa med svamp kontaminering i sina cellulära kulturer. Mitt råd är att sterilisera mediet och utrustningen noggrant före användning för att förhindra denna kontaminering.Denna demonstration kommer att hjälpa utredare med liten erfarenhet av NMR eller cellkultur att lära sig att genomföra dessa tekniker i svamp och växtsystem. För att förbereda omärkta flytande tillväxt medium, lös 6,5 gram jästextrakt pepton dextros eller YPD pulver i 100 milliliter destillerat vatten, och sedan autoklavera den resulterande lösningen i 25 minuter vid 134 grader Celsius. För att förbereda omärkta solid tillväxt medium, tillsätt 6,5 gram YPD agar pulver till 100 milliliter destillerat vatten, och autoklavera mediet i 25 minuter vid 121 grader Celsius, innan du kyler mediet till cirka 50 grader Celsius.Överför sedan 13 till 15 milliliter av det smälta fasta tillväxtmediet till individuella sterila plastgjiska rätter och placera omedelbart locken på disken. För att förbereda kol-13, kväve-15-märkt flytande tillväxt medium, justera en 100-milliliter volym isotophaltiga minimalt medium till ett pH-värde på 6,6 med syra eller bas vid behov. Därefter lös de salter som anges i tabellen i 100 milliliter destillerat vatten, tillsätt kol-13, kväve-15-märkt flytande tillväxt medium, och autoklav den resulterande lösningen i 25 minuter vid 121 grader Celsius.När lösningen har svalnat till rumstemperatur, tillsätt 100 mikroliter spårämnen lösning till hela volymen av kol-13, kväve-15-märkt minimalt medium. För att odla svampmaterial, använd en inokulat slinga för att överföra en liten mängd svampar från lagring på en YPD-platta, och odla svampen i två dagar i en 30-graders Celsius inkubator. I slutet av inkubationen, använd en ny inokulat slinga för att överföra en aktiv växande svamp kant till kol-13, kväve-15-märkt flytande tillväxt medium, och placera kulturen på 30 grader Celsius och 220 rotationer per minut i tre till fem dagar i en skakande inkubator.När stora mängder av svampen täcker kolven och flyter i vätskan, samla svamparna genom centrifugering och kassera supernatanten. Återfukta pelleten med en lämplig lösning, och använd tövråkar för att samla in ca 0,5 gram av den välhydrerade pelleten för NMR- och DNP-analyser. Blanda sedan det återstående materialet med en 20%glycerollösning i ett koniskt rör, och placera svampprovet på minus 80 grader Celsius för långtidsförvaring.För att förbereda A.fumigatus för solid-state NMR-analys, använd först en dialyspåse med en 3,5-kilodalton molekylär vikt cutoff för att dialysera 0,5-gram kol-13, kväve-15-märkt svampprov mot en liter 10-millimolar fosfat buffert vid fyra grader Celsius i tre dagar för att ta bort små molekyler från tillväxtmediet. I slutet av dialysen, överför provet till ett 15-milliliter rör för centrifugering, och packa 70 till 80 milligram av den jämnt kol-13-märkta och välhydrerade provpastaen till en fyra millimeters zirkoniumdioxidortor. Använd en metallstav för att försiktigt och repetitivt pressa provet, med hjälp av papper för att absorbera överflödigt vatten.Sedan tätt locket rotorn, och sätt in provet i spektrometern för solid-state NMR karakterisering. För att förbereda A.fumigatus för DNP-analys, tillsätt 100 mikroliter DNP-matris i en 1,5-milliliter mikrocentrifugrör per kol-13, kol-15-märkt svampprov, och lös 0,7 milligram polariseringsmedel till varje rör för att bilda en 10-millimol radikal lagerlösning. Efter virvelning i två till tre minuter för att säkerställa att radikaler är helt upplösta i lösningen, blöt 10 milligram dialyserat kol-13, kväve-15-märkt svampprov i 50 mikroliter av polariseringsagenten lösningen, och använda en mortel och en mortel för att milt mala blandningen för att säkerställa penetration av radikalerna i porösa cellväggar.Tillsätt ytterligare 30 mikroliter av den radikala lösningen på marken pelleten för att ytterligare hydratisera svampprovet, och packa pelleten i en 3,2-millimeters safirrotor. Pressa milt och ta bort det överflödiga DNP-lösningsmedlet som det visats, och tillsätt en 3,2-millimeters silikonplugg för att förhindra förlust av hydrering. Lägg sedan till rotorn i en NMR-spektrometer för rutinexperiment eller en DNP-spektrometer för mätning av det DNP-förstärkta spektrumet under mikrovågsbestrålning.För att förbereda växtmaterial för DNP studier, använd ett rakblad för att skära jämnt kol-13-märkt växtmaterial i en-till två-millimeters bitar. Använd en mortel och mortelstöt för att mala bitarna till mindre partiklar tills det slutliga pulvret har ett homogent utseende. Tillsätt 40 mikroliter av 10-millimolarradikala stamlösning till växtmaterialet, och slipa provet lätt i ytterligare fem minuter för att säkerställa homogen blandning med radikalen.Hydrera markprovet med ytterligare 20 mikroliter av radikal stamlösning, och packa det ekvilovilliga växtprovet i en 3,2-millimeters safirrotor för DNP-analys. Sätt sedan i en silikonplugg för att undvika att hydrering går förlorad, och fyll på provet på DNP-spektrofotometern. Isotopmärkningen förstärker väsentligen NMR-känsligheten och gör det möjligt för mätning av en serie av tvådimensionellt kol-13-kol-13 och kol-13-kväve-15 korrelationsspektra för att analysera sammansättning, hydrering, rörlighet och packning av polymererna för deras integration för konstruktion av en tredimensionell modell av cellväggsarkitektur.Om off-diagonal signaler är svåra att få i 2D kol-13-kol-13 spektrum, statistisk märkning kan ha inträffat. De två kol-13 toppar på 96 och 92 delar per miljon är signatur kol-1 signaler av glukos. Därför deras starka intensiteter i den kvantitativa kol-13 direkt polarisering spektra mätt med långa återvinna förseningar på 35 sekunder typiskt ange dominans av små molekyler på grund av ofullständiga dialys eller tvätt.Med väl märkta prover kan långdistanskorrelationer mätas ytterligare för att upptäcka biomolekylers rumsliga närhet och för att konstruera en strukturell modell av de intakta cellväggarna. Denna teknik gör att strukturfunktion i många naturligt förekommande och konstruerade material kan utforskas, vilket underlättar framtida studier av kolhydratrika biomaterial och funktionaliserade polymerer. Som vissa svampar kan orsaka infektion eller systematiska sjukdomar hos människor, se till att hantera svamp material i en laminär flöde huva för skydd och för att minimera exponeringen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Ett protein framställningsmetod för hög kapacitet Identifiering av proteiner interagerar med en kärnteknisk Cofactor Använda LC-MS / MS-analys

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomär skala strukturella studier av makromolekylära sammansättningar av Solid-state kärnmagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modifiera baculoviridae uttryck vektorer att producera utsöndras växtproteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Mäta interaktion av klotformig och fintrådiga proteiner av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Snabb gallerförberedelse för tidsupp lös Cryo-Electron mikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

Förberedelse av provstödsfilmer i transmissionselektronmikroskopi med hjälp av ett stödflötblock

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Storskaliga Multi-omics Genome-wide Association Studies (Mo-GWAS): Riktlinjer för provberedning och normalisering

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...