Name: detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Bob Farrar og Alexis Park for at levere insekter, der anvendes i denne undersøgelse, og for deres ekspertise i larve iscenesættelse. Yderligere tak til Michael Blackburn og Saikat Ghosh for kritisk gennemgang af manuskriptet.
Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende med henblik på at give specifikke oplysninger og ikke indebærer anbefaling eller godkendelse af det amerikanske landbrugsministerium.
USDA er en udbyder af lige muligheder og arbejdsgiver.

Bemærk: følgende protokol er beregnet til én person til at oprette, foretage observationer og indsamle prøver. Flere kørsler af samme opsætning kan kombineres for at øge biologisk replikering. Eventuelle yderligere gentagelser af forsøget bør oprettes på samme tidspunkt af dagen for at eliminere mulige døgn påvirkninger på genekspression. Protokollen er designet til at skabe 3 ' angrebne ' blade til 5 separate høst tidspunkter. Matchede kontrol blade for hvert tidspunkt skaber i alt 30 prøver. Eksperimente...

<ol>
	<li>Choi, H. W., Klessig, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMPs,+MAMPs,+and+NAMPS+in+plant+innate+immunity.">DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity.</a> BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).</li><li>Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polypeptide+from+tomato+leaves+induces+wound-inducible+proteinase+inhibitor+proteins.">A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins.</a> Science. 253, 895-897 (1991).</li><li>Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+in+the+plant+tissue:+the+defense+of+a+dangerous+passage.">Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage.</a> Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).</li><li>Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+Plant+Defenses:+Herbivore-Associated+Molecular+Patterns+and+Effector+Arsenal+of+Chewing+Herbivores.">Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).</li><li>Chen, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+direct+plant+defense+against+insect+herbivores:+A+review.">Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review.</a> Insect Science. 15, 101-114 (2008).</li><li>Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modularity+in+jasmonate+signaling+for+multistress+resilience.">Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience.</a> Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).</li><li>War, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+defence+against+herbivory+and+insect+adaptations.">Plant defence against herbivory and insect adaptations.</a> AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).</li><li>McCloud, E. S., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory+and+caterpillar+regurgitants+amplify+the+wound-induced+increases+in+jasmonic+acid+but+not+nicotine+in+Nicotiana+sylvestris.">Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris.</a> Planta. 203, 430-435 (1997).</li><li>Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+(Lepidoptera,+Sphingidae)+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate:+II.+Accumulation+of+plant+mRNAs+responding+to+insect-derived+cues.">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues.</a> Plant Physiology. , 701-710 (2001).</li><li>Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+(Lepidoptera,+Sphingidae)+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate.+III.+Fatty+acid-amino+acid+conjugates+in+herbivore+oral+secretions+are+necessary+and+sufficient+for+herbivore-specific+plant+responses.">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li><li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory.">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li><li>Hj&#228;lt&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+herbivory:+problems+and+possibilities.">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li><li>Lehtil&#228;, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies.">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li><li>Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+the+evidence?+Manduca+sexta+larvae+can+not+disrupt+specific+jasmonate+induction+in+Nicotiana+attenuata+by+rapid+consumption.">Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption.</a> Planta. 210, 343-346 (2000).</li><li>Zebelo, S. A., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+early+signalling+events+in+plant-insect+interactions.">Role of early signalling events in plant-insect interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).</li><li>Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Before+gene+expression:+early+events+in+plant-insect+interaction.">Before gene expression: early events in plant-insect interaction.</a> Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).</li><li>Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+potato+by+shoot+tip+culture+in+Petri+dishes.">Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes.</a> Potato Research. 23, 445-448 (1980).</li><li>Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+propagation+of+potato+by+single+node+cuttings.">Rapid propagation of potato by single node cuttings.</a> Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).</li><li>Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+combinatorics+to+screen+Bacillus+thuringiensis+isolates+for+toxicity+against+Manduca+sexta+and+Plutella+xylostella.">Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella.</a> Biological Control. 42, 226-232 (2007).</li><li>Bell, R. A., Joachim, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+rearing+laboratory+colonies+of+tobacco+hornworms+and+pink+bollworms.">Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms.</a> Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).</li><li>Lawrence, S. D., Novak, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+plethora+of+infestation-responsive+Q-type+C2H2+transcription+factors+in+potato.">The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato.</a> BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).</li><li>Green, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoPhyte:+a+flexible+affordable+method+to+quantify+2D+phenotypes+from+imagery.">PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery.</a> Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).</li><li>Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory+responsive+C2H2+zinc+finger+transcription+factor+protein+StZFP2+from+potato.">Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).</li><li>Korth, K. L., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+chewing+insect-specific+molecular+events+distinct+from+a+general+wound+response+in+leaves.">Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves.</a> Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).</li><li>Browne, R. A., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+an+in+vitro+detached+leaf+assay+for+pre-screening+resistance+to+Fusarium+head+blight+in+wheat.">Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat.</a> European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).</li><li>Browne, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+components+of+fusarium+head+blight+resistance+in+soft+red+winter+wheat+germ+plasm+using+a+detached+leaf+assay.">Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay.</a> Plant Disease. 89, 404-411 (2005).</li><li>Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detached+leaf+and+whole+plant+assays+for+soybean+aphid+resistance:+differential+responses+among+resistance+sources+and+biotypes.">Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes.</a> Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).</li><li>Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detached+leaf+assay+to+screen+for+host+plant+resistance+to+Helicoverpa+armigera.">Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera.</a> Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).</li><li>Vivianne, G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laboratory+assay+for+Phytophthora+infestans+resistance+in+various+Solanum+species+reflects+the+field+situation.">A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation.</a> European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).</li><li>Kamoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+encoding+a+protein+elicitor+of+Phytophthora+infestans+is+down-regulated+during+infection+of+potato.">A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).</li><li>Nowakowska, M., Nowicki, M., K&#322;osi&#324;ska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraisal+of+artificial+screening+techniques+of+tomato+to+accurately+reflect+field+performance+of+the+Late+Blight+resistance.">Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance.</a> Plos One. 9, e109328 (2014).</li><li>Arimura, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory-induced+volatiles+elicit+defence+genes+in+lima+bean+leaves.">Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves.</a> Nature. 406, 512-515 (2000).</li><li>Erb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+as+inducers+and+suppressors+of+plant+defense+and+immunity-origins,+specificity,+perception+and+signaling.">Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+of+wounding-induced+root-to-shoot+communication+in+Arabidopsis+thaliana.">Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).</li><li>Ryan, C. A., Moura, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+wound+signaling+in+plants:+A+new+perception.">Systemic wound signaling in plants: A new perception.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).</li><li>Hilleary, R., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+signaling+in+response+to+wounding+and+pathogens.">Systemic signaling in response to wounding and pathogens.</a> Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).</li><li>. Hornworms Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr">https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr</a> (2018)</li><li>. Products Available from: <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018)</li><li>. Raising Manduca sexta Available from: <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018)</li><li>. Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018)</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses.">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li></ol>

Det er unødvendigt at anvende eksisterende plantebeskyttelsesmetoder for hele planten for at nå målet med denne særlige undersøgelse (dvs. screene et sæt kandidat gener for deres reaktion på infestation). Den indlysende fordel ved den fritliggende blad raffinement er afkortning den tid, det tager at udføre æderne assays. Den tunge natur af hele planter med Clip bure elimineres og assays udføres hurtigere, da planter så unge som 2 uger kan bruges til at høste blade. Det kræver også en meget mindre fodaftryk ...

Herbivory sætter i gang en række molekylære begivenheder, hvor en plante kan både identificere angrebet og montere en passende respons for dens overlevelse. Et anlæg modtager to grundlæggende signaler fra gnavende insekter; en fra den fysiske beskadigelse af vævet og den anden fra insekt-specifikke stoffer. Skade-associerede molekylære mønstre (DAMPs) frigives som reaktion på skader skabt af larve munddele og udløse en veldefineret sårrespons, der resulterer i en stigning i hormonet jasmoninsyre og transkriptionen af forsvars gener1. En af de mest kendte damps er systemIn, et polypeptid, der dannes ved kavalergang af de større prosystemin protein efter et blad er såret2,3. Den jasmoninsyre sårrespons er yderligere moduleret af herbivore-associerede molekylære mønstre (HAMPs), som kan udledes af Caterpillar spyt, tarmindhold (regurgitant) og afføring (Frass)4. Insekter bruger disse stoffer til enten at øge eller unddrage sig forsvaret svar5. Transkriptionsfaktorer derefter viderebringe budskabet fra hormon signaler i forsvaret svar via regulering af downstream Defense gener6,7,8.
Nogle plante-insekt interaktion undersøgelser, der anvendes i laboratorie-indstillinger er af simuleret type, med et mål om at tilnærme den naturlige metode til fodring af insektet. Simuleret æderne opnås normalt ved at skabe kunstige skader på plantevæv med forskellige værktøjer, der efterligner den specifikke mekanisme af insekt munddele tilstrækkelig til at forårsage frigivelse af damps og udløse produktionen af forsvars gener. Andre insekt-specifikke komponenter såsom orale sekreter eller regurgitant tilsættes ofte for at replikere bidraget fra hamps9,10,11. Skabelsen af en specifik størrelse og type af sår og anvendelsen af nøjagtige mængder af HAMPs er en fordel for disse typer af undersøgelser og kan tilbyde mere reproducerbare resultater. Naturlige æderne undersøgelser, hvor skader på plantevæv opnås ved anvendelse af felt-erhvervet eller laboratorium-opdrættet insekter, er ofte mere udfordrende, fordi sårstørrelse og hamp beløb styres af insekt adfærd og tilføje variation til Data. De naturlige versus simulerede metoder og deres fordele og ulemper er godt debatteret i litteraturen12,13,14.
For at studere tidlige signalerings hændelser, såsom transkriptionsfaktorer, skal en vis procentdel af bladet indtages i relativt kort tid, så larverne skal begynde at tygge straks og opretholde forbruget, indtil bladet er frosset til analyse. M. Sexta er en glubende feeder på flere natskygge-planter i mange af sine larvestadier, hvilket gør den ideel til at give maksimal skade på relativt kort tid15. Dette er praktisk, når man studerer tidlige signalerings hændelser, da anlæggets respons forekommer næsten umiddelbart efter et insekt kontakter blad overfladen16,17. Den almindeligt anvendte Clip Cage metode til indeslutning viser klodset, da flere bure ville kræve løbende justeringer i hele eksperimentet for at muliggøre fjernelse eller tilsætning af larver. Bladene skal også være store nok og stærke nok til at støtte flere insekter fodring på samme tid. Disse typer af kartoffelplanter kræver en stor mængde plads til at observere fodring. Larverne vil ofte flytte til undersiden af blad overfladen, hvilket også gør fodring observationer ganske vanskeligt. Det er helt klart besværligt at bruge hele planter til at udføre disse eksperimenter.
Den nuværende undersøgelse bruger fritliggende blade isoleret i Petri skåle snarere end hele planter til at strømline og forenkle hele planten tilgang til at studere herbivory. Anvendelsen af protokollen i denne undersøgelse er begrænset til observation af en gruppe af C2H2 transkriptionsfaktorer induceret tidligt i kartoffel blade efter planteædende skader af M. Sexta larvae.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1139">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">agar substitute</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">G3251</td>
			<td style="width:471px;">product is Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">containment vessel (6,12 or 24 well dish)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td>
			<td>many other companies sell these products</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">143880</td>
			<td>30-50 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>50, 100, 250 or 500 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">microcentrifuge tubes, 1.7 ml&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:173px;">1158R22</td>
			<td>these have been tested in liquid N2 and will not explode</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Murashige &#38; Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M519</td>
			<td>used to make propagation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">nutrient agar mix</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M5825</td>
			<td>product is Murashige &#38; Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">paper filter discs</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">09-805A</td>
			<td>Whatman circles-purchase to fit in petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">FB0875713A or FB0875712</td>
			<td>purchase size appropriate for leaf size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">potato tubers&#160;</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">pots, 10&#34;&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">41PT1000CN2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">preservative/biocide</td>
			<td style="width:217px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>product is PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">seed potatoes for explant source</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">slow release fertilizer (14-14-14 )</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>Osmocote is a popular brand name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">soft touch forceps</td>
			<td style="width:217px;">BioQuip</td>
			<td style="width:173px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">soil mix</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">65-51121</td>
			<td>product is Sunshine LC1 mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">C2100</td>
			<td>Magenta-type vessel, PTL-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ICN2672206</td>
			<td>product is MP Biomedicals Plantcon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta

Den multitrofiske natur af genekspression undersøgelser af insekt æderne kræver et stort antal biologiske replikater, hvilket skaber behovet for enklere, mere strømlinede æderne protokoller. Perturbationer af gnavende insekter undersøgt normalt i hele plantesystemer. Mens hele denne organisme strategi er populær, er det ikke nødvendigt, hvis lignende observationer kan replikeres i en enkelt fritliggende blad. Forudsætningen er, at de grundlæggende elementer, der kræves for signaltransduktion, er til stede i selve bladet. I tilfælde af tidlige begivenheder i signaltransduktion, behøver cellerne kun at modtage signalet fra perturbationen og sende signalet til tilstødende celler, som er analyseret for genekspression.
Den foreslåede metode blot ændrer timing af løsrivelse. I hele planten eksperimenter, larver er begrænset til et enkelt blad, som i sidste ende løsrevet fra planten og analyseret for genekspression. Hvis rækkefølgen af excision er vendt, fra sidste i hele planten undersøgelser, at først i den fritliggende undersøgelse, fodring eksperiment forenkles.
Solanum tuberosum var. Kennebec er formeret ved knude overførsel i et simpelt vævskultur medium og overføres til jord for yderligere vækst, hvis det ønskes. Bladene er fjernet fra moderplanten og flyttet til Petri skåle, hvor foder analysen udføres med larvestadierne i M. Sexta. Beskadiget blad væv er analyseret for ekspression af relativt tidlige begivenheder i signaltransduktion. Genekspression analyse identificerede infestation-specifikke Cys2-His2 (C2H2) transkriptionsfaktorer, bekræfter succesen med at bruge fritliggende blade i tidlig respons undersøgelser. Metoden er lettere at udføre end hele planten angreb og bruger mindre plads.

Blad forbrug definerer protokollens succes. Sunde, præcist iscenesat larver bør begynde fodring umiddelbart efter placering på blad overfladen og fodring bør fortsætte på en temmelig konsekvent måde i hele infestationstid. I video 1begynder Larven i toppen at tygge umiddelbart efter placering og opretholder en konsekvent hastighed under fodring. Dette er især vigtigt, hvis bestemmelse tidlige genekspression begivenheder efter infestation. Larven i bunden ikke forb...

Watch this Scientific Journal Video about Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta at JoVE.com

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

Den præsenterede metode skaber naturlige planteædende beskadigede plante vævet gennem anvendelse af manduca Sexta larver til fritliggende blade af kartoffel. Planten væv er analyseret for udtryk for seks transkriptionsfaktor homologer involveret i tidlige reaktioner på insekt herbivory.

Aftagne blad analyser for at forenkle genekspression undersøgelser i kartoffel under infestation ved at tygge insekt Manduca Sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Denne protokol bruger en strømlinet tilgang til måling af plantegenspression som reaktion på insektædende. Ved at bruge fritliggende blade isoleret i petriskåle er insekterne lettere at påføre og overvåge i den relativt korte angrebsperiode, hvilket bidrager til reproducerbare genudtryksdata. Denne protokol kan tilpasses mange plante-/insektinteraktioner.hvis der tages udgangspunkt i observationer fra hele anlægssystemer. Den uforudsigelige karakter af insekt fodring kan være udfordrende. Derfor giver en pålidelig forsyning af korrekt iscenesatte larver og sunde planter den bedste chance for succes.Visualisere, hvordan sunde planter og insekter skal vises og opføre sig, er medvirkende til at opnå optimale resultater, især for forskere, der er nye inden for studieområdet. Demonstrere proceduren med mig vil være Frances Perez, en molekylær biolog i den genetiske forbedring af frugt og grøntsager lab. For at forberede nodal formeret væv kultur kartoffelplanter, først få Kennebec plantlets dyrket af explant materiale med mindst tre til fire noder.Brug en steril klinge til at fjerne bladene skære grenene tæt på de vigtigste stilk og efterlader omkring to millimeter gren væv pr blad. Skær ca. to millimeter over og under hver knudepunkt for at fjerne knudepunktssektionerne fra stængerne og arranger knudepunktsstiklingerne i et sterilt vævskulturbeholder, der indeholder nodaloverførselsmediet, hvor grenen peger op. Overfør derefter knudepunktsstiklingerne til et plantevævskulturkammer til to til tre ugers vækst ved 24 grader Celsius og en 16-timers lys, otte timers mørk fotoperiode.For at forberede insekterne til fodring, opnå den ønskede larve fase af M.sexta og overføre en larver i hver brønd af en passende indeslutning fartøj i henhold til størrelsen af larver. Lav placering skabeloner for hver høst tid punkt ved hjælp af fem robuste bakker i stand til at holde et sæt af seks passende størrelse petriskåle foret med hvidt papir. Spor et sæt af seks cirkler ved hjælp af passende størrelse Petriskål på papiret i hver bakke og mærke et sæt cirkler kontrol A, B og C og den anden angrebne A, B og C.Derefter mærke hver placering skabelon med den relevante høst tid.Dernæst skal du mærke et 1,7 milliliter mikrocentrifugerør for hver cirkel i placeringsskabelonen for at identificere forstyrrelsen, plantereplikationsbrevet og høsttidpunktet. Når alle rørene er mærket, skal du placere en steril filterpapirskive i en petriskål pr. skabelon og fugte skiverne med sterilt vand uden at lade overskydende væskepool i hver skål. Placer derefter en skål i hver cirkel i hver placeringsskabelon og placer tre kartoffelplanter af samme alder og relative størrelse ved siden af hver placeringsskabelon.For at indlede angreb, bruge sterile saks til at fjerne de to øverste størrelse matchede blade fra hver plante og placere et blad i kontrol Petriskålen og en i den angrebne petriskål for hver plante så hurtigt som muligt. Når alle bladene er placeret, skal du bruge soft touch-virbe til at overføre mindst én larve til hver angrebsskål så hurtigt som muligt og indstille timeren til den ønskede angrebstid. Overhold fodringen for at sikre, at alle larverne spiser, og udskiftning af eventuelle ikke-fodring larver efter behov.Fjern alle larverne fra alle bladene i slutningen af angrebstiden og start timeren for høsten. Ved afslutningen af hvert høsttidspunkt overføres hvert blad til det tilsvarende rør, og røret skal straks smides i flydende nitrogen for at fryse bladprøven før opbevaring ved minus 80 grader Celsius, indtil RNA-isolationen. Sunde præcist iscenesatte larver bør begynde at fodre umiddelbart efter anbringelsen på bladoverfladen, og fodringen bør fortsætte på en ret ensartet måde i hele angrebsperioden.Larven i bunden af dette blad ikke forbruge noget plantemateriale og er et eksempel på en mislykket angreb. Disse blade blev løsrevet fra to uger gamle nodal formeret væv kultur planter og forbruges på forskellige satser og fodring stilarter for hver larve fase. På grundlag af disse resultater blev fjerde instar larver udvalgt til yderligere at vurdere skaderne på blade til mere modne jorddyrkede kartoffelplanter, der i højere grad tilnærmer markdyrkede kartoffelplanter.I disse genekspressionsundersøgelser blev to nye C2H2-zinkfinger transskriptionsfaktorer, der er robust lydhøre over for M.sexta planteædende, identificeret til støtte for brugen af fritliggende blade til angrebsanalyser. Husk at bruge alder og størrelse matchede blade og til korrekt fase larverne for hvert eksperiment som ensartethed resulterer i mere reproducerbare data. Bladvæv kan analyseres for stress-induktionerede reaktive ilt arter og jasmonsyre hormon derivater.Hele transcriptome, proteome, eller mikrobiom undersøgelser kan også udføres på bladet væv.

Research

JoVE Journal

Environment

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Forbigående genekspression i Tobacco hjælp Gibson forsamling og Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect (Cryptococcus fagisuga Lind.)

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect Cryptococcus fagisuga Lind.

En teknik til Screen amerikanske Bøg til Resistance til bøg Scale Insect (<em&gt; Cryptococcus fagisuga</em&gt; Lind.)

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Måling Satser for Ukrudtsmiddel Metabolisme i tokimbladede Ukrudt med en udskåret Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Dobbelt-strenget RNA Oral leveringsmetoder til at fremkalde RNA-interferens i Phloem og plante-sap-fodring Hemipteran insekter

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacle Balanus improvisus som en Marine Model - dyrkning og genekspression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Forsøgsplan for behandlingen af adfærdsmæssige reaktion profiler i larve fisk: ansøgning til Neuro-stimulerende koffein

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

En præcis og autonome System til påvisning af insekt fremkomsten mønstre

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens og Agrobacterium rhizogenes-medieret Transformation af kartoffel og promotor aktivitet af en Suberin gen af GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Beregning af bladareal ved hjælp af tre forskellige metoder i rene løvfældende stande

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Kartoffelvirus x-baseret microRNA-lyddæmpning (VbMS) i kartoffel.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...