Name: detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta at JoVE.com

De auteurs willen Bob Farrar en Alexis Park bedanken voor het leveren van insecten die in deze studie worden gebruikt en voor hun expertise in larvale staging. Extra dank aan Michael Blackburn en Saikat Ghosh voor kritische recensie van het manuscript.
Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van landbouw.
USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever.

Opmerking: het volgende protocol is bedoeld voor het instellen van een persoon, het maken van observaties en het verzamelen van samples. Meerdere uitvoeringen van dezelfde Setup kunnen worden gecombineerd om de biologische replicatie te verhogen. Eventuele extra herhalingen van het experiment moeten op hetzelfde moment van de dag worden ingesteld om mogelijke diurnale invloeden op genexpressie te elimineren. Het protocol is ontworpen om 3 ' besmette ' Bladeren te maken voor 5 afzonderlijke oogsttijd punten. De overeenkom...

<ol>
	<li>Choi, H. W., Klessig, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMPs,+MAMPs,+and+NAMPS+in+plant+innate+immunity.">DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity.</a> BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).</li><li>Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polypeptide+from+tomato+leaves+induces+wound-inducible+proteinase+inhibitor+proteins.">A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins.</a> Science. 253, 895-897 (1991).</li><li>Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+in+the+plant+tissue:+the+defense+of+a+dangerous+passage.">Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage.</a> Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).</li><li>Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+Plant+Defenses:+Herbivore-Associated+Molecular+Patterns+and+Effector+Arsenal+of+Chewing+Herbivores.">Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).</li><li>Chen, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+direct+plant+defense+against+insect+herbivores:+A+review.">Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review.</a> Insect Science. 15, 101-114 (2008).</li><li>Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modularity+in+jasmonate+signaling+for+multistress+resilience.">Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience.</a> Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).</li><li>War, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+defence+against+herbivory+and+insect+adaptations.">Plant defence against herbivory and insect adaptations.</a> AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).</li><li>McCloud, E. S., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory+and+caterpillar+regurgitants+amplify+the+wound-induced+increases+in+jasmonic+acid+but+not+nicotine+in+Nicotiana+sylvestris.">Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris.</a> Planta. 203, 430-435 (1997).</li><li>Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+(Lepidoptera,+Sphingidae)+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate:+II.+Accumulation+of+plant+mRNAs+responding+to+insect-derived+cues.">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues.</a> Plant Physiology. , 701-710 (2001).</li><li>Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+(Lepidoptera,+Sphingidae)+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate.+III.+Fatty+acid-amino+acid+conjugates+in+herbivore+oral+secretions+are+necessary+and+sufficient+for+herbivore-specific+plant+responses.">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li><li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory.">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li><li>Hj&#228;lt&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+herbivory:+problems+and+possibilities.">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li><li>Lehtil&#228;, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies.">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li><li>Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+the+evidence?+Manduca+sexta+larvae+can+not+disrupt+specific+jasmonate+induction+in+Nicotiana+attenuata+by+rapid+consumption.">Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption.</a> Planta. 210, 343-346 (2000).</li><li>Zebelo, S. A., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+early+signalling+events+in+plant-insect+interactions.">Role of early signalling events in plant-insect interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).</li><li>Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Before+gene+expression:+early+events+in+plant-insect+interaction.">Before gene expression: early events in plant-insect interaction.</a> Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).</li><li>Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+potato+by+shoot+tip+culture+in+Petri+dishes.">Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes.</a> Potato Research. 23, 445-448 (1980).</li><li>Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+propagation+of+potato+by+single+node+cuttings.">Rapid propagation of potato by single node cuttings.</a> Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).</li><li>Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+combinatorics+to+screen+Bacillus+thuringiensis+isolates+for+toxicity+against+Manduca+sexta+and+Plutella+xylostella.">Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella.</a> Biological Control. 42, 226-232 (2007).</li><li>Bell, R. A., Joachim, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+rearing+laboratory+colonies+of+tobacco+hornworms+and+pink+bollworms.">Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms.</a> Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).</li><li>Lawrence, S. D., Novak, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+plethora+of+infestation-responsive+Q-type+C2H2+transcription+factors+in+potato.">The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato.</a> BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).</li><li>Green, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoPhyte:+a+flexible+affordable+method+to+quantify+2D+phenotypes+from+imagery.">PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery.</a> Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).</li><li>Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory+responsive+C2H2+zinc+finger+transcription+factor+protein+StZFP2+from+potato.">Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).</li><li>Korth, K. L., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+chewing+insect-specific+molecular+events+distinct+from+a+general+wound+response+in+leaves.">Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves.</a> Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).</li><li>Browne, R. A., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+an+in+vitro+detached+leaf+assay+for+pre-screening+resistance+to+Fusarium+head+blight+in+wheat.">Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat.</a> European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).</li><li>Browne, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+components+of+fusarium+head+blight+resistance+in+soft+red+winter+wheat+germ+plasm+using+a+detached+leaf+assay.">Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay.</a> Plant Disease. 89, 404-411 (2005).</li><li>Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detached+leaf+and+whole+plant+assays+for+soybean+aphid+resistance:+differential+responses+among+resistance+sources+and+biotypes.">Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes.</a> Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).</li><li>Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detached+leaf+assay+to+screen+for+host+plant+resistance+to+Helicoverpa+armigera.">Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera.</a> Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).</li><li>Vivianne, G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laboratory+assay+for+Phytophthora+infestans+resistance+in+various+Solanum+species+reflects+the+field+situation.">A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation.</a> European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).</li><li>Kamoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+encoding+a+protein+elicitor+of+Phytophthora+infestans+is+down-regulated+during+infection+of+potato.">A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).</li><li>Nowakowska, M., Nowicki, M., K&#322;osi&#324;ska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraisal+of+artificial+screening+techniques+of+tomato+to+accurately+reflect+field+performance+of+the+Late+Blight+resistance.">Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance.</a> Plos One. 9, e109328 (2014).</li><li>Arimura, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory-induced+volatiles+elicit+defence+genes+in+lima+bean+leaves.">Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves.</a> Nature. 406, 512-515 (2000).</li><li>Erb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+as+inducers+and+suppressors+of+plant+defense+and+immunity-origins,+specificity,+perception+and+signaling.">Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+of+wounding-induced+root-to-shoot+communication+in+Arabidopsis+thaliana.">Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).</li><li>Ryan, C. A., Moura, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+wound+signaling+in+plants:+A+new+perception.">Systemic wound signaling in plants: A new perception.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).</li><li>Hilleary, R., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+signaling+in+response+to+wounding+and+pathogens.">Systemic signaling in response to wounding and pathogens.</a> Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).</li><li>. Hornworms Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr">https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr</a> (2018)</li><li>. Products Available from: <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018)</li><li>. Raising Manduca sexta Available from: <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018)</li><li>. Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018)</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses.">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li></ol>

Het gebruik van bestaande volledige plantenherbivory methodieken is niet nodig om het doel van deze specifieke studie te bereiken (d.w.z. een reeks kandidaatgenen te schermen voor hun reactie op besmetting). Het voor de hand liggende voordeel van de vrijstaande blad verfijning is het verkorten van de tijd die het kost om ivoren assays uit te voeren. De onhandige aard van hele planten met clip kooien wordt geëlimineerd en assays worden eerder uitgevoerd, omdat planten zo jong als 2 weken kunnen worden gebruikt om bladere...

Herbivory zet een reeks moleculaire gebeurtenissen in gang waarbij een plant zowel de aanval kan identificeren als een passende respons voor zijn overleving aankoppelt. Een plant krijgt twee basis aanwijzingen van vretende insecten; een van de fysieke schade aan het weefsel en de andere van insecten-specifieke stoffen. Schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) worden vrijgegeven in reactie op schade door larvale mondstukken en leiden tot een goed gedefinieerde wond respons die resulteert in een toename van het hormoon jasmonic zuur en de transcriptie van Defense genen1. Een van de bekendste Damps is systemIn, een polypeptide dat wordt gevormd door het decolleté van het grotere prosystemine eiwit nadat een blad is verwond2,3. De reactie van jasmonic acid wond wordt verder gemoduleerd door herbivore-geassocieerde moleculaire patronen (HAMPs), die kunnen worden afgeleid van Caterpillar speeksel, darminhoud (regurgitant) en ontlasting (frass)4. Insecten gebruiken deze stoffen om de afweerreactie5te stimuleren of te omzeilen. Transcriptiefactoren dan de boodschap doorgeven van hormoon signalen in de verdediging reactie via regulering van downstream verdediging genen6,7,8.
Sommige planten-insecten interactiestudies gebruikt in laboratorium instellingen zijn van het gesimuleerde type, met een doelstelling van de benadering van de natuurlijke methode van het voeden door het insect. Gesimuleerde ivoren wordt meestal bereikt door het creëren van kunstmatige schade aan plantenweefsels met verschillende gereedschappen die het specifieke mechanisme van insecten mondstukken voldoende nabootsen om de vrijlating van Damps te veroorzaken en de productie van verdedigings genen te triggeren. Andere insectenspecifieke componenten zoals orale afscheidingen of regurgitant worden vaak toegevoegd om de bijdrage van hamps9,10,11te repliceren. Het creëren van een specifieke grootte en type wond en de toepassing van precieze hoeveelheden HAMPs is een voordeel voor dit soort studies en kan meer reproduceerbare resultaten bieden. Natuurlijke ivoren studies, waarbij beschadiging van het plantenweefsel wordt bewerkstelligd door de toepassing van in het veld verworven of door laboratoria opgefokt insecten, zijn vaak uitdagender, omdat de bedragen van wond grootte en Hamp worden beheerst door insecten gedrag en variabiliteit toevoegen aan de Gegevens. De natuurlijke versus gesimuleerde methoden en hun voor-en nadelen zijn goed besproken in de literatuur12,13,14.
Om vroege signalering van gebeurtenissen zoals transcriptiefactoren te bestuderen, moet een bepaald percentage van het blad in relatief korte tijd worden verbruikt, dus larven moeten onmiddellijk beginnen te kauwen en het verbruik behouden totdat het blad is bevroren voor analyse. M. sexta is een vraatzuchtige feeder op meerdere nachtschadeachtigen planten tijdens veel van zijn larvale stadia, waardoor het ideaal is voor het impareren van maximale schade in relatief korte tijd15. Dit is handig bij het bestuderen van vroege signalering van gebeurtenissen, als de reactie van de plant komt bijna onmiddellijk na een insect contact op met het blad oppervlak16,17. De veelgebruikte clip Cage-methode van containment bewijst onhandig, omdat meerdere kooien tijdens het experiment voortdurend moeten worden aangepast om de verwijdering of toevoeging van larven mogelijk te maken. De bladeren moeten ook groot genoeg en sterk genoeg zijn om meerdere insecten voeden tegelijkertijd te ondersteunen. Deze soorten aardappelplanten vereisen een grote hoeveelheid ruimte om de voeding te observeren. Larven zullen vaak naar de onderzijde van het bladoppervlak verhuizen, wat het voeren van waarnemingen ook heel moeilijk maakt. Het gebruik van hele planten om deze experimenten uit te voeren is duidelijk omslachtig.
De huidige studie maakt gebruik van losstaande bladeren geïsoleerd in Petri schalen in plaats van hele planten te stroomlijnen en vereenvoudigen van de hele plant aanpak voor het bestuderen van herbivory. De toepassing van het protocol in deze studie is beperkt tot de waarneming van een groep van C2H2 transcriptiefactoren die vroeg in aardappel bladeren zijn geïnduceerd na herbivante schade door M. sexta larven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1139">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">agar substitute</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">G3251</td>
			<td style="width:471px;">product is Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">containment vessel (6,12 or 24 well dish)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td>
			<td>many other companies sell these products</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">143880</td>
			<td>30-50 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>50, 100, 250 or 500 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">microcentrifuge tubes, 1.7 ml&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:173px;">1158R22</td>
			<td>these have been tested in liquid N2 and will not explode</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Murashige &#38; Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M519</td>
			<td>used to make propagation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">nutrient agar mix</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M5825</td>
			<td>product is Murashige &#38; Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">paper filter discs</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">09-805A</td>
			<td>Whatman circles-purchase to fit in petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">FB0875713A or FB0875712</td>
			<td>purchase size appropriate for leaf size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">potato tubers&#160;</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">pots, 10&#34;&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">41PT1000CN2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">preservative/biocide</td>
			<td style="width:217px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>product is PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">seed potatoes for explant source</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">slow release fertilizer (14-14-14 )</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>Osmocote is a popular brand name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">soft touch forceps</td>
			<td style="width:217px;">BioQuip</td>
			<td style="width:173px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">soil mix</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">65-51121</td>
			<td>product is Sunshine LC1 mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">C2100</td>
			<td>Magenta-type vessel, PTL-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ICN2672206</td>
			<td>product is MP Biomedicals Plantcon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta

De Multitrofische aard van genexpressie studies van insecten ivoren eist grote aantallen biologische replicaten, waardoor de behoefte aan eenvoudigere, meer gestroomlijnde ivoren protocollen ontstaat. Perturbaties van vretende insecten worden meestal bestudeerd in hele planten systemen. Hoewel deze hele organisme strategie populair is, is het niet nodig als vergelijkbare waarnemingen in één vrijstaand blad kunnen worden gerepliceerd. De veronderstelling is dat de basiselementen die nodig zijn voor signaaltransductie aanwezig zijn in het blad zelf. In het geval van vroege gebeurtenissen in signaaltransductie hoeven cellen alleen het signaal van de perturbatie te ontvangen en dat signaal door te geven aan naburige cellen die worden aangevallen voor genexpressie.
De voorgestelde methode verandert eenvoudigweg de timing van het detachement. In hele planten experimenten zijn larven beperkt tot een enkel blad dat uiteindelijk loskomt van de plant en wordt aangevallen voor genexpressie. Als de volgorde van excisie wordt omgekeerd, van de laatste in hele planten studies, tot de eerste in de losgekoppelde studie, wordt het Voer experiment vereenvoudigd.
Solanum tuberosum var. Kennebec wordt door Nodale Transfer in een eenvoudig weefselkweek medium vermeerderd en naar de bodem overgebracht voor verdere groei indien gewenst. De bladeren worden uit de moederplant weggesneden en naar Petri schalen verplaatst waar de voedings test wordt uitgevoerd met de larvale stadia van M. sexta. Beschadigd blad weefsel wordt getest voor de expressie van relatief vroege gebeurtenissen in signaaltransductie. Genexpressie analyse identificeerde infestatie-specifieke Cys2-His2 (C2H2) transcriptiefactoren, ter bevestiging van het succes van het gebruik van losgekoppelde bladeren in vroege respons studies. De methode is gemakkelijker uit te voeren dan hele planten besmettingen en gebruikt minder ruimte.

Leaf-verbruik definieert het succes van het protocol. Gezonde, nauwkeurig geënsceneerde larven moeten onmiddellijk na de plaatsing op het bladoppervlak gaan voeden en de voeding moet op een vrij consistente manier gedurende de infestatie tijd worden voortgezet. In Video 1begint de larve aan de bovenkant onmiddellijk na de plaatsing te kauwen en behoudt een consistente snelheid tijdens het voeden. Dit is vooral belangrijk als u vroege genexpressie gebeurtenissen na besmet...

Watch this Scientific Journal Video about Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta at JoVE.com

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

De gepresenteerde methode creëert natuurlijke herbivoor beschadigd plantenweefsel door de toepassing van Manduca sexta larven op losgeraakte bladeren van aardappel. Het plantenweefsel wordt onderzocht voor de uitdrukking van zes transcriptiefactor homologs die betrokken zijn bij vroege reacties op insecten herbivory.

Vrijstaande blad testen voor het vereenvoudigen van genexpressie studies in aardappel tijdens besmetting door kauwen insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Dit protocol maakt gebruik van een gestroomlijnde aanpak voor het meten van plantengenexpressie in reactie op insectenherbisder. Door het gebruik van losstaande bladeren geïsoleerd in petrischaaltjes, zijn de insecten gemakkelijker toe te passen en te controleren tijdens de relatief korte periode van besmetting die bijdraagt aan reproduceerbare genexpressiegegevens. Dit protocol kan worden aangepast aan vele interacties tussen planten en insecten.als rekeningmetswaarnemingen van hele installatiesystemen in aanmerking worden genomen. De onvoorspelbare aard van insectenvoeding kan een uitdaging zijn. Daarom bieden een betrouwbare toevoer van goed geënsceneerde larven en gezonde planten de beste kans op succes.Het visualiseren van hoe gezonde planten en insecten moeten verschijnen en zich gedragen is instrumenteel om optimale resultaten te bereiken, vooral voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van studie. Het aantonen van de procedure met mij zal Frances Perez, een moleculair bioloog in de genetische verbetering van groenten en fruit lab. Voor de voorbereiding van nodale gekweekte weefselkweek aardappelplanten, eerst verkrijgen Kennebec planten die worden geteeld uit explant materiaal met ten minste drie tot vier knooppunten.Gebruik een steriel blad om de bladeren te verwijderen snijden van de takken dicht bij de hoofdsteel en het verlaten van ongeveer twee millimeter vertakking weefsel per blad. Snijd ongeveer twee millimeter boven en onder elk knooppunt om de knooppunten van de stengels te verwijderen en de nodale stekken te schikken in een steriel weefselkweekvat met knooppuntoverdrachtsmedium met de tak omhoog. Breng vervolgens de nodale stekken over naar een plantenweefselkweekkamer voor twee tot drie weken groei bij 24 graden Celsius en een 16-uurs licht, acht uur durende donkere fotoperiode.Om de insecten voor te bereiden op het voeden, verkrijg het gewenste larvenstadium van M.sexta en breng één larve over in elke put van een geschikt insluitingsvat afhankelijk van de grootte van de larve. Maak plaatsingssjablonen voor elk oogsttijdpunt met behulp van vijf stevige trays die een set van zes op de juiste manier formaat petrischaaltjes bekleed met wit papier kunnen houden. Traceer een set van zes cirkels met behulp van de juiste grootte Petri schotel op het papier in elke lade en label een set cirkels controle A, B en C en de andere besmet A, B en C.Then label elke plaatsing sjabloon met de juiste oogsttijd.Label vervolgens één 1,7 milliliter microcentrifugebuis voor elke cirkel in de plaatsingssjabloon om de verstoring, de plantenreplicatieletter en het oogsttijdpunt op de juiste manier te identificeren. Wanneer alle buizen zijn gelabeld, plaats een steriele filter papier schijf in een petrischaal per sjabloon en bevochtigen de schijven met steriel water zonder te laten overtollige vloeistof zwembad in elk gerecht. Plaats vervolgens een schotel in elke cirkel in elke plaatsing sjabloon en plaats drie aardappelplanten van dezelfde leeftijd en relatieve grootte naast elke plaatsing sjabloon.Om de besmetting te starten, gebruik steriele schaar om de bovenste twee grootte afgestemde bladeren van elke plant te verwijderen en plaats een blad in de controle Petri schotel en een in de besmette petrischaal voor elke plant zo snel mogelijk. Wanneer alle bladeren zijn geplaatst, gebruik soft touch tangen om ten minste een larve over te brengen in elk besmet gerecht zo snel mogelijk en stel de timer voor de gewenste besmetting tijd. Let op de voeding om ervoor te zorgen dat alle larven eten, ter vervanging van alle niet-voedende larven als dat nodig is.Verwijder alle larven van alle bladeren aan het einde van de besmettingstijd en start de timer voor de oogst. Breng aan het einde van elk oogsttijdpunt elk blad in de overeenkomstige buis en laat de buis onmiddellijk in vloeibare stikstof vallen om het bladmonster te bevriezen voordat het bij min 80 graden Celsius wordt opgeslagen tot de RNA-isolatie. Gezonde nauwkeurig geënsceneerde larven moeten onmiddellijk na plaatsing op het bladoppervlak beginnen met voeden en het voederen moet gedurende de besmettingsperiode vrij consistent worden voortgezet.De larve aan de onderkant van dit blad heeft geen plantaardig materiaal verbruikt en is een voorbeeld van een mislukte besmetting. Deze bladeren werden losgemaakt van twee weken oude nodale gekweekte weefselkweek planten en geconsumeerd in verschillende snelheden en voeding stijlen voor elke larve stadium. Op basis van deze resultaten werden vierde instar larven geselecteerd om de schade aan bladeren verder te beoordelen voor meer volwassen aardappelplanten die dichter bij elkaar komen bij de aardappelplanten.In deze genexpressie studies, twee nieuwe C2H2 zink vinger transcriptie factoren die robuust reageren op M.sexta herbivory werden geïdentificeerd ter ondersteuning van het gebruik van vrijstaande bladeren voor besmetting testen. Vergeet niet om leeftijd en grootte afgestemde bladeren te gebruiken en om de larven voor elk experiment goed te fasereren, omdat uniformiteit resulteert in meer reproduceerbare gegevens. Bladweefsels kunnen worden getest voor stress-geïnduceerde reactieve zuurstofsoorten en jasmoninezuur hormoonderivaten.Hele transcriptoom, proteoom, of microbioom studies kunnen ook worden uitgevoerd op de bladweefsels.

Research

JoVE Journal

Environment

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect (Cryptococcus fagisuga Lind.)

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect Cryptococcus fagisuga Lind.

Een techniek om Screen Amerikaanse Beech voor Weerstand tegen de Beech Scale Insect (<em&gt; Cryptococcus fagisuga</em&gt; Lind.)

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

De rankpootkreeften Balanus improvisus als een Marine Model - kweken en genexpressie

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Experimentele Protocol voor de behandeling van de gedragsmatige reactie profielen in larvale vissen: toepassing op de Neuro-stimulerende cafeïne

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Een precieze en autonome systeem voor het opsporen van insecten ontstaan patronen

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens en Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van aardappel- en de activiteit van de promotor van een gen suberine door GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Blad gebied index schatting met behulp van drie verschillende methoden in zuivere Bladverliedige stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Aardappelvirus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Aardappel.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...