Name: detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00
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Die Autoren danken Bob Farrar und Alexis Park für die Bereitstellung von Insekten, die in dieser Studie verwendet werden, und für ihre Expertise in der Larveninszenierung. Weiterer Dank an Michael Blackburn und Saikat Ghosh für die kritische Überprüfung des Manuskripts.
Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium.
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HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für eine Person zum Einrichten, Erfassen von Beobachtungen und Sammeln von Proben konzipiert. Mehrere Durchläufe desselben Setups können kombiniert werden, um die biologische Replikation zu erhöhen. Alle zusätzlichen Wiederholungen des Experiments sollten zur gleichen Tageszeit eingerichtet werden, um mögliche tagtägliche Einflüsse auf die Genexpression zu beseitigen. Das Protokoll ist so konzipiert, dass 3 "befallene" Blätter für 5 separate Erntezeitpunkte erstellt werden. A...

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Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues.</a> Plant Physiology. , 701-710 (2001).</li><li>Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+(Lepidoptera,+Sphingidae)+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate.+III.+Fatty+acid-amino+acid+conjugates+in+herbivore+oral+secretions+are+necessary+and+sufficient+for+herbivore-specific+plant+responses.">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li><li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory.">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li><li>Hj&#228;lt&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+herbivory:+problems+and+possibilities.">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li><li>Lehtil&#228;, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies.">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li><li>Schittko, U., Preston, C. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+propagation+of+potato+by+single+node+cuttings.">Rapid propagation of potato by single node cuttings.</a> Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).</li><li>Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+combinatorics+to+screen+Bacillus+thuringiensis+isolates+for+toxicity+against+Manduca+sexta+and+Plutella+xylostella.">Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella.</a> Biological Control. 42, 226-232 (2007).</li><li>Bell, R. A., Joachim, F. 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Products Available from: <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018)</li><li>. Raising Manduca sexta Available from: <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018)</li><li>. Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018)</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses.">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li></ol>

Die Verwendung bestehender Methoden für pflanzenkräuterelfenbeinte Pflanzen ist nicht erforderlich, um das Ziel dieser speziellen Studie zu erreichen (d. h. eine Reihe von Kandidatengenen auf ihre Reaktion auf Densonfall zu untersuchen). Der offensichtliche Vorteil der losgelösten Blattverfeinerung ist die Verkürzung der Zeit, die es braucht, um Kräuter-Assays durchzuführen. Die sperrige Natur ganzer Pflanzen mit Clipkäfigen wird eliminiert und Tests werden früher durchgeführt, da Pflanzen, die noch 2 Wochen alt...

Herbivory setzt eine Reihe molekularer Ereignisse in Gang, bei denen eine Pflanze sowohl den Angriff identifizieren als auch eine angemessene Reaktion auf ihr Überleben montieren kann. Eine Pflanze erhält zwei grundlegende Hinweise von kauenden Insekten; eine durch die physische Schädigung des Gewebes und die andere durch insektenspezifische Substanzen. Schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) werden als Reaktion auf Schäden freigesetzt, die durch Larvenmspiele verursacht werden, und lösen eine klar definierte Wundreaktion aus, die zu einer Erhöhung des Hormons Jasmonsäure und der Transkription der Verteidigungsgene1führt. Eines der bekanntesten DAMPs ist systemin, ein Polypeptid, das durch die Spaltung des größeren Prosystemin-Proteins gebildet wird, nachdem ein Blatt 2,3verwundet wurde. Die Jasmonsäure-Wundreaktion wird durch pflanzenfressende molekulare Muster (HAMPs) weiter moduliert, die aus Raupenspeichel, Darminhalt (regurgitant) und Kot (frass) abgeleitet werden können4. Insekten verwenden diese Substanzen, um entweder die Abwehrzuwehr zu steigern oder zu umgehen5. Transkriptionsfaktoren leiten dann die Botschaft von Hormonsignalen in der Abwehrreaktion über die Regulierung der nachgeschalteten Abwehrgene6,7,8weiter.
Einige Pflanzen-Insekten-Interaktionsstudien, die in Laborumgebungen verwendet werden, sind vom simulierten Typ, mit dem Ziel, die natürliche Methode der Fütterung durch das Insekt zu annähernden. Simuliertes Krautwird wird in der Regel durch die Schaffung künstlicher Schäden an Pflanzengeweben mit verschiedenen Werkzeugen erreicht, die den spezifischen Mechanismus von Insektenmundteilen imitieren, die ausreichen, um die Freisetzung von DAMPs zu verursachen und die Produktion von Verteidigungsgenen auszulösen. Andere insektenspezifische Komponenten wie mundende Sekrete oder Regurgitant werden oft hinzugefügt, um den Beitrag von HAMPs9,10,11zu replizieren. Die Erstellung einer bestimmten Größe und Art der Wunde und die Anwendung präziser Mengen an HAMPs ist ein Vorteil für diese Arten von Studien und kann reproduzierbarere Ergebnisse liefern. Natürliche Pflanzenschutzstudien, bei denen Schäden am Pflanzengewebe durch die Anwendung von felderworbenen oder im Labor gezüchteten Insekten durchgeführt werden, sind oft schwieriger, da Wundgrößen- und HAMP-Mengen durch Insektenverhalten bestimmt werden und die Variabilität der daten. Die natürlichen versus simulierten Methoden und ihre Vor- und Nachteile sind in der Literatur gut diskutiert12,13,14.
Um frühe Signalereignisse wie Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, muss ein bestimmter Prozentsatz des Blattes in relativ kurzer Zeit verbraucht werden, so dass Larven sofort zu kauen beginnen und den Verbrauch aufrecht erhalten müssen, bis das Blatt zur Analyse eingefroren ist. M. sexta ist ein gefräßiger Feeder auf mehreren solanaceous Pflanzen während vieler seiner Larvenstadien, so dass es ideal für die Vermittlung von maximalen Schaden in einer relativ kurzen Zeit15. Dies ist praktisch, wenn frühe Signalereignisse untersucht werden, da die Reaktion der Pflanze fast unmittelbar nach einem Insektenkontakt mit der Blattoberfläche16,17auftritt. Die häufig verwendete Clip-Käfig-Methode der Einschließung erweist sich als ungeschickt, da mehrere Käfige während des gesamten Experiments kontinuierliche Anpassungen erfordern würden, um die Entfernung oder Zugabe von Larven zu ermöglichen. Die Blätter müssen auch groß genug und stark genug sein, um mehrere Insekten zu unterstützen, die gleichzeitig füttern. Diese Arten von Kartoffelpflanzen benötigen viel Platz, um die Fütterung zu beobachten. Larven werden oft an die Unterseite der Blattoberfläche verlagert, was auch Fütterungsbeobachtungen recht schwierig macht. Ganze Pflanzen zu verwenden, um diese Experimente durchzuführen, ist eindeutig umständlich.
Die aktuelle Studie verwendet freistehende Blätter, die in Petrischalen isoliert sind, anstatt ganze Pflanzen, um den gesamten Pflanzenansatz für das Studium von Kräutern zu rationalisieren und zu vereinfachen. Die Anwendung des Protokolls in dieser Studie beschränkt sich auf die Beobachtung einer Gruppe von C2H2-Transkriptionsfaktoren, die früh in Kartoffelblättern nach pflanzenfressenden Schäden durch M. sexta Larven induziert wurden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1139">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">agar substitute</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">G3251</td>
			<td style="width:471px;">product is Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">containment vessel (6,12 or 24 well dish)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td>
			<td>many other companies sell these products</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">143880</td>
			<td>30-50 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>50, 100, 250 or 500 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">microcentrifuge tubes, 1.7 ml&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:173px;">1158R22</td>
			<td>these have been tested in liquid N2 and will not explode</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Murashige &#38; Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M519</td>
			<td>used to make propagation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">nutrient agar mix</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M5825</td>
			<td>product is Murashige &#38; Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">paper filter discs</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">09-805A</td>
			<td>Whatman circles-purchase to fit in petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">FB0875713A or FB0875712</td>
			<td>purchase size appropriate for leaf size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">potato tubers&#160;</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">pots, 10&#34;&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">41PT1000CN2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">preservative/biocide</td>
			<td style="width:217px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>product is PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">seed potatoes for explant source</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">slow release fertilizer (14-14-14 )</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>Osmocote is a popular brand name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">soft touch forceps</td>
			<td style="width:217px;">BioQuip</td>
			<td style="width:173px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">soil mix</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">65-51121</td>
			<td>product is Sunshine LC1 mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">C2100</td>
			<td>Magenta-type vessel, PTL-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ICN2672206</td>
			<td>product is MP Biomedicals Plantcon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta

Die multitrophische Natur von Genexpressionsstudien von Insektenkraut erfordert eine große Anzahl biologischer Replizieren, wodurch einfachere, schlankere Kräuterschutzprotokolle erforderlich sind. Störungen von Kauinsekten werden in der Regel in ganzen Pflanzensystemen untersucht. Während diese ganze Organismus-Strategie beliebt ist, ist es nicht notwendig, wenn ähnliche Beobachtungen in einem einzigen abgetrennten Blatt repliziert werden können. Es wird davon ausgegangen, dass die für die Signaltransduktion erforderlichen Grundelemente innerhalb des Blattes selbst vorhanden sind. Bei frühen Ereignissen in der Signaltransduktion müssen Zellen nur das Signal von der Störung empfangen und an benachbarte Zellen übertragen, die auf Genexpression untersucht werden.
Die vorgeschlagene Methode ändert lediglich den Zeitpunkt der Ablösung. In ganzen Pflanzenexperimenten sind Larven auf ein einzelnes Blatt beschränkt, das schließlich von der Pflanze gelöst und auf Genexpression untersucht wird. Wenn die Reihenfolge der Exzision umgekehrt wird, von der letzten in ganzen Pflanzenstudien, auf den ersten in der freistehenden Studie, wird das Fütterungsexperiment vereinfacht.
Solanum tuberosum var. Kennebec wird durch Knotentransfer in einem einfachen Gewebekulturmedium vermehrt und auf Wunsch auf den Boden übertragen. Die Blätter werden von der Mutterpflanze entfernt und in Petrischalen verlegt, wo der Fütterungstest mit den Larvenstadien von M. sextadurchgeführt wird. Beschädigtes Blattgewebe wird auf die Expression relativ früher Ereignisse in der Signaltransduktion geprüft. Die Genexpressionsanalyse identifizierte befallspezifische Cys2-His2 (C2H2)-Transkriptionsfaktoren, was den Erfolg der Verwendung von freistehenden Blättern in frühen Reaktionsstudien bestätigte. Die Methode ist einfacher durchzuführen als ganze Pflanzenbefall und verbraucht weniger Platz.

Der Blattverbrauch definiert den Erfolg des Protokolls. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten sofort nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während der Befallzeit ziemlich konsistent fortgesetzt werden. In Video 1beginnt die Larve an der Spitze sofort nach der Platzierung zu kauen und hält eine konstante Rate während der Fütterung. Dies ist besonders wichtig, wenn frühe Genexpressionsereignisse nach dem...

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Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Dieses Protokoll verwendet einen schlanken Ansatz zur Messung der Pflanzengenexpression als Reaktion auf Insektenkraut. Durch die Verwendung von freistehenden Blättern, die in Petrischalen isoliert sind, sind die Insekten während der relativ kurzen Befallzeit leichter anzuwenden und zu überwachen und tragen zu reproduzierbaren Genexpressionsdaten bei. Dieses Protokoll kann an viele Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Insekt angepasst werden.wenn Basisbeobachtungen aus ganzen Anlagensystemen berücksichtigt werden. Die Unberechenbarkeit der Insektenfütterung kann eine Herausforderung sein. Daher bietet eine zuverlässige Versorgung mit gut inszenierten Larven und gesunden Pflanzen die besten Erfolgsaussichten.Die Visualisierung, wie gesunde Pflanzen und Insekten auftreten und sich verhalten sollten, ist entscheidend für optimale Ergebnisse, insbesondere für Forscher, die neu auf dem Gebiet der Studie sind. Mit mir wird das Verfahren demonstriert: Frances Perez, Molekularbiologin für die genetische Verbesserung von Obst und Gemüse laboriert. Um Knoten vermehrte GewebeKultur Kartoffelpflanzen vorzubereiten, erhalten Sie zuerst Kennebec Pflanzen aus Explant-Material mit mindestens drei bis vier Knoten.Verwenden Sie eine sterile Klinge, um die Blätter zu entfernen, die die Zweige in der Nähe des Hauptstamms schneiden und etwa zwei Millimeter Astgewebe pro Blatt hinterlassen. Schneiden Sie etwa zwei Millimeter über und unter jedem Knoten, um die Knotenabschnitte von den Stielen zu entfernen und die Knotenschnitte in einem sterilen Gewebekulturgefäß mit Knotentransfermedium mit nach oben zeigendem Ast anzuordnen. Dann übertragen Sie die Knotenschnitte für zwei bis drei Wochen Wachstum bei 24 Grad Celsius und eine 16-stündige helle, achtstündige dunkle Fotoperiode in eine Pflanzengewebekulturkammer.Um die Insekten für die Fütterung vorzubereiten, erhalten Sie das gewünschte Larvenstadium von M.sexta und übertragen Sie eine Larve in jeden Brunnen eines geeigneten Einschließungsgefäßes entsprechend der Größe der Larve. Erstellen Sie Platzierungsvorlagen für jeden Erntezeitpunkt mit fünf stabilen Schalen, die einen Satz von sechs mit weißem Papier ausgekleideten Petrischalen in angemessener Größe halten können. Verfolgen Sie einen Satz von sechs Kreisen mit der entsprechend großen Petrischale auf dem Papier in jedem Fach und beschriften Sie einen Satz von Kreisen, die A, B und C steuern, und die anderen befallenen A, B und C.Dann beschriften Sie jede Platzierungsvorlage mit der entsprechenden Erntezeit.Als Nächstes beschriften Sie ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr für jeden Kreis in der Platzierungsvorlage, um die Störung, den Pflanzenreplikationsbuchstaben und den Erntezeitpunkt entsprechend zu identifizieren. Wenn alle Rohre beschriftet sind, legen Sie eine sterile Filterpapierscheibe in eine Petrischale pro Schablone und befeuchten Sie die Scheiben mit sterilem Wasser, ohne überschüssigeFlüssigkeit in jeder Schale zu lassen. Legen Sie dann in jeder Platzierungsvorlage ein Gericht in jeden Kreis und platzieren Sie drei Kartoffelpflanzen gleichen Alters und relativer Größe neben jeder Platzierungsvorlage.Um den Befall zu initiieren, verwenden Sie sterile Schere, um die oberen zwei Größe abgestimmten Blätter von jeder Pflanze zu entfernen und legen Sie ein Blatt in der Kontrolle Petrischale und eine in der befallenen Petrischale für jede Pflanze so schnell wie möglich. Wenn alle Blätter platziert sind, verwenden Sie Soft-Touch-Zangen, um mindestens eine Larve so schnell wie möglich in jede befallene Schale zu übertragen und den Timer für die gewünschte Befallzeit einzustellen. Beobachten Sie die Fütterung, um sicherzustellen, dass alle Larven fressen, und ersetzen Sie bei Bedarf alle nicht fütternden Larven.Entfernen Sie alle Larven von allen Blättern am Ende der Befallzeit und starten Sie den Timer für die Ernte. Am Ende jedes Erntezeitpunkts jedes Blatt in die entsprechende Röhre geben und die Röhre sofort in flüssigen Stickstoff geben, um die Blattprobe vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Isolierung einzufrieren. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten unmittelbar nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während des Befallszeitraums ziemlich konsistent fortgesetzt werden.Die Larve am Boden dieses Blattes verbrauchte kein Pflanzenmaterial und ist ein Beispiel für einen erfolglosen Befall. Diese Blätter wurden von zwei Wochen alten, sich vermehrten Gewebekulturpflanzen gelöst und mit unterschiedlichen Raten und Fütterungsstilen für jedes Larvenstadium verzehrt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden vierte Instar-Larven ausgewählt, um die Schäden an den Blättern für reifere Kartoffelpflanzen, die sich den Feldkartoffeln annähern, weiter zu bewerten.In diesen Genexpressionsstudien wurden zwei neue C2H2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren identifiziert, die robust auf M.sexta-Kräutersindien reagieren und die Verwendung von freistehenden Blättern für Befall-Assays unterstützen. Denken Sie daran, Alter und Größe abgestimmte Blätter zu verwenden und die Larven für jedes Experiment richtig zu inszenieren, da die Homogenität zu reproduzierbareren Daten führt. Blattgewebe kann auf stressinduzierte reaktive Sauerstoffspezies und Jasmonsäurehormonderivate geprüft werden.Ganze Transkriptom, Proteom, oder Mikrobiom Studien können auch auf dem BlattGewebe durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Environment

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Forschung

Umwelt

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect (Cryptococcus fagisuga Lind.)

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect Cryptococcus fagisuga Lind.

Eine Technik, um Amerikanische Buche für Widerstand gegen die Buche Schildlaus (Bildschirm<em&gt; Cryptococcus fagisuga</em&gt; Lind.)

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Messraten von Herbizid Metabolism in DICOT Weeds mit einem herausgeschnittenen Blatt Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

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Die Barnacle Balanus Improvisus als Marine Modell - Kultivierung und Genexpression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Experimentelles Protokoll für die Prüfung Verhaltensreaktion Profile in Larval Fish: Anwendung auf die Neuro-Stimulans Koffein

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Eine präzise und autonomen System zur Erkennung von Insekten entstehen Muster

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

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Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Leaf Area Index Estimation mit drei unterschiedlichen Methoden in reinen Laubständen

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...