Name: detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Bob Farrar e Alexis Park per aver fornito insetti utilizzati in questo studio e per la loro esperienza nella messa in scena larvale. Ulteriori grazie a Michael Blackburn e Saikat Ghosh per la revisione critica del manoscritto.
La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione ha lo scopo esclusivamente di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni o approvazioni da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.
USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

NOTA: il seguente protocollo è progettato per una persona per impostare, effettuare osservazioni e raccogliere campioni. Più corse della stessa configurazione possono essere combinate per aumentare la replicazione biologica. Eventuali ripetizioni aggiuntive dell'esperimento dovrebbero essere impostate alla stessa ora del giorno per eliminare possibili influenze diurne sull'espressione genica. Il protocollo è progettato per creare 3 foglie "infestate" per 5 punti di tempo di raccolta separati. Il controllo corrisponden...

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Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li><li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory.">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li><li>Hj&#228;lt&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+herbivory:+problems+and+possibilities.">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li><li>Lehtil&#228;, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies.">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li><li>Schittko, U., Preston, C. 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Products Available from: <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018)</li><li>. Raising Manduca sexta Available from: <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018)</li><li>. Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018)</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses.">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li></ol>

L'uso di metodologie erbiflue vegetali intere esistenti non è necessario per raggiungere l'obiettivo di questo particolare studio (ad esempio, vagliare una serie di geni candidati per la loro risposta all'infestazione). L'ovvio vantaggio della raffinatezza delle foglie staccate è l'accorciamento del tempo necessario per eseguire i saggi erbivori. La natura ingombrante di intere piante con gabbie clip viene eliminata e i saggi vengono eseguiti prima, poiché le piante fino a 2 settimane possono essere utilizzate per rac...

Herbivory mette in moto una serie di eventi molecolari durante i quali una pianta può sia identificare l'attacco che montare una risposta appropriata per la sua sopravvivenza. Una pianta riceve due segnali di base da insetti masticatori; uno dal danno fisico al tessuto e l'altro da sostanze specifiche per insetti. I modelli molecolari associati ai danni (DAMP) vengono rilasciati in risposta ai danni creati dalle parti della bocca larvale e innescano una risposta ben definita della ferita che si traduce in un aumento dell'acido jasmonico ormonale e nella trascrizione dei geni di difesa1. Uno dei DAMP più conosciuti è systemin, un polipeptide che è formato dalla scissione della proteina prosystemin più grande dopo una foglia viene ferita2,3. La risposta della ferita da acido jasmonico è ulteriormente modulata da modelli molecolari associati agli erbivori (HAMP), che possono essere derivati dalla saliva del bruco, dal contenuto intestinale (rigurgitante) e dalle feci (frass)4. Gli insetti usano queste sostanze per aumentare o eludere la risposta alla difesa5. I fattori di trascrizione trasmettono quindi il messaggio dai segnali ormonali nella risposta della difesa attraverso la regolazione dei geni di difesa a valle6,7,8.
Alcuni studi di interazione pianta-insetto utilizzati in ambienti di laboratorio sono di tipo simulato, con l'obiettivo di approssimare il metodo naturale di alimentazione da parte dell'insetto. L'erbivoro simulato è di solito realizzato creando danni artificiali ai tessuti vegetali con vari strumenti che imitano il meccanismo specifico delle parti della bocca degli insetti sufficiente a causare il rilascio di DAMP e innescare la produzione di geni di difesa. Altri componenti specifici degli insetti come secrezioni orali o rigurgitti vengono spesso aggiunti per replicare il contributo degli HAMP9,10,11. La creazione di una dimensione e di un tipo specifico di ferita e l'applicazione di quantità precise di HAMP è uno dei vantaggi di questi tipi di studi e può offrire risultati più riproducibili. Gli studi naturali sull'erbivoro, in cui i danni al tessuto vegetale sono compiuti mediante l'applicazione di insetti acquisiti sul campo o allevati in laboratorio, sono spesso più impegnativi perché le quantità di ferita e HAMP sono regolate dal comportamento degli insetti e aggiungono variabilità al dati. I metodi naturali rispetto a quelli simulati e i loro vantaggi e svantaggi sono ben dibattuti nella letteratura12,13,14.
Per studiare gli eventi di segnalazione precoce come i fattori di trascrizione, una certa percentuale della foglia deve essere consumata in un lasso di tempo relativamente breve, quindi le larve devono iniziare a masticare immediatamente e mantenere il consumo fino a quando la foglia non viene congelata per l'analisi. M. sexta è un alimentatore vorace su più piante solanacee durante molte delle sue fasi larve, rendendolo ideale per impartire il massimo danno in un tempo relativamente breve15. Ciò è utile quando si studiano i primi eventi di segnalazione, poiché la risposta della pianta si verifica quasi immediatamente dopo che un insetto contatta la superficie fogliare16,17. Il metodo di contenimento delle gabbie a clip comunemente usato si dimostra goffo, in quanto più gabbie richiederebbero continui aggiustamenti durante l'esperimento per consentire la rimozione o l'aggiunta di larve. Le foglie devono anche essere abbastanza grandi e forti da sostenere l'alimentazione di più insetti contemporaneamente. Questi tipi di piante di patate richiedono una grande quantità di spazio per osservare l'alimentazione. Le larve spesso si spostano nella parte inferiore della superficie della foglia, il che rende anche le osservazioni di alimentazione piuttosto difficili. L'uso di piante intere per eseguire questi esperimenti è chiaramente ingombrante.
Lo studio attuale utilizza foglie staccate isolate nei piatti Petri piuttosto che intere piante per snellire e semplificare l'intero approccio vegetale allo studio dell'erbivoro. L'applicazione del protocollo in questo studio è limitata all'osservazione di un gruppo di fattori di trascrizione C2H2 indotti precocemente nelle foglie di patate dopo danni erbivori da parte delle larve di M. sexta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1139">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">agar substitute</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">G3251</td>
			<td style="width:471px;">product is Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">containment vessel (6,12 or 24 well dish)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td>
			<td>many other companies sell these products</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">143880</td>
			<td>30-50 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>50, 100, 250 or 500 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">microcentrifuge tubes, 1.7 ml&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:173px;">1158R22</td>
			<td>these have been tested in liquid N2 and will not explode</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Murashige &#38; Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M519</td>
			<td>used to make propagation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">nutrient agar mix</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M5825</td>
			<td>product is Murashige &#38; Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">paper filter discs</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">09-805A</td>
			<td>Whatman circles-purchase to fit in petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">FB0875713A or FB0875712</td>
			<td>purchase size appropriate for leaf size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">potato tubers&#160;</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">pots, 10&#34;&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">41PT1000CN2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">preservative/biocide</td>
			<td style="width:217px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>product is PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">seed potatoes for explant source</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">slow release fertilizer (14-14-14 )</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>Osmocote is a popular brand name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">soft touch forceps</td>
			<td style="width:217px;">BioQuip</td>
			<td style="width:173px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">soil mix</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">65-51121</td>
			<td>product is Sunshine LC1 mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">C2100</td>
			<td>Magenta-type vessel, PTL-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ICN2672206</td>
			<td>product is MP Biomedicals Plantcon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta

La natura multitrofica degli studi sull'espressione genica degli insetti erbivori richiede un gran numero di repliche biologiche, creando la necessità di protocolli erbivori più semplici e più snelli. Le perturbazioni degli insetti masticatori sono di solito studiate in sistemi vegetali interi. Mentre questa strategia dell'intero organismo è popolare, non è necessario se osservazioni simili possono essere replicate in un'unica foglia staccata. L'ipotesi è che gli elementi di base necessari per la trasduzione del segnale siano presenti all'interno della foglia stessa. Nel caso di eventi iniziali nella trasduzione del segnale, le cellule devono solo ricevere il segnale dalla perturbazione e trasmettere quel segnale alle cellule vicine che vengono analizzate per l'espressione genica.
Il metodo proposto modifica semplicemente la tempistica del distacco. Negli esperimenti su piante intere, le larve sono confinate in una singola foglia che alla fine viene staccata dalla pianta e analizzata per l'espressione genica. Se l'ordine di escissione è invertito, dall'ultimo negli studi di piante intere, al primo nello studio distaccato, l'esperimento di alimentazione è semplificato.
Kennebec, Var, Varnebec di Solanum viene propagato dal trasferimento nodale in un semplice mezzo di coltura dei tessuti e trasferito al suolo per un'ulteriore crescita, se lo si desidera. Le foglie vengono ascise dalla pianta madre e trasferite ai piatti Petri dove il saggio di alimentazione viene condotto con gli stadi larvali di M. sexta. Il tessuto fogliare danneggiato viene analizzato per l'espressione di eventi relativamente precoce nella trasduzione del segnale. L'analisi dell'espressione genica ha identificato i fattori di trascrizione Cys2-His2-His2 (C2H2) specifici per l'infestazione, confermando il successo dell'uso di foglie distaccate negli studi di risposta precoce. Il metodo è più facile da eseguire rispetto alle infestazioni di piante intere e utilizza meno spazio.

Il consumo foglia definisce il successo del protocollo. Le larve in fase sane e accurate dovrebbero iniziare l'alimentazione immediatamente dopo il posizionamento sulla superficie della foglia e l'alimentazione dovrebbe continuare in modo abbastanza coerente per tutto il tempo di infestazione. Nel Video1, la larva nella parte superiore inizia a masticare subito dopo il posizionamento e mantiene una velocità costante durante l'alimentazione. Ciò è particolarmente import...

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Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

Il metodo presentato crea tessuto vegetale naturale danneggiato erbivoro attraverso l'applicazione di larve di sexta Manduca a foglie staccate di patate. Il tessuto vegetale è stato analisi per l'espressione di sei omologhi del fattore di trascrizione coinvolti nelle prime risposte all'erbivoro degli insetti.

Secondo i saggi foglia distaccati per semplificare gli studi sull'espressione genica nelle patate durante l'infestazione da mawing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Questo protocollo utilizza un approccio semplificato per misurare l'espressione genica delle piante in risposta all'erbivoro degli insetti. Usando foglie staccate isolate nelle piastre di Petri, gli insetti sono più facili da applicare e monitorare durante il periodo relativamente breve di infestazione contribuendo ai dati di espressione genica riproducibili. Questo protocollo può essere adattato a molte interazioni pianta / insetto.se vengono prese in considerazione osservazioni di base da interi sistemi impiantisi. La natura imprevedibile dell'alimentazione degli insetti può essere impegnativa. Pertanto, una fornitura affidabile di larve correttamente messe in scena e piante sane offre le migliori possibilità di successo.Visualizzare come dovrebbero apparire e comportarsi piante e insetti sani è fondamentale per ottenere risultati ottimali soprattutto per i ricercatori nuovi nel campo di studio. A dimostrare la procedura con me sarà Frances Perez, biologa molecolare nel laboratorio di miglioramento genetico di frutta e verdura. Per preparare piante di patate da coltura tissutale propagata nodale, ottenere prima le plantlet Kennebec coltivate da materiale di espianto con almeno tre o quattro nodi.Utilizzare una lama sterile per rimuovere le foglie tagliando i rami vicino allo stelo principale e lasciando circa due millimetri di tessuto di ramo per foglia. Tagliare circa due millimetri sopra e sotto ogni nodo per rimuovere le sezioni nodali dagli steli e disporre le talee nodali in un contenitore sterile di coltura tissutale contenente mezzo di trasferimento nodale con il ramo rivolto verso l'alto. Quindi trasferire le talee nodali in una camera di coltura dei tessuti vegetali per due o tre settimane di crescita a 24 gradi Celsius e un periodo fotografico buio di 16 ore e luce di otto ore.Per preparare gli insetti per l'alimentazione, ottenere lo stadio larvale desiderato di M.sexta e trasferire una larva in ogni pozzo di un vaso di contenimento appropriato in base alle dimensioni della larva. Crea modelli di posizionamento per ogni punto di tempo di raccolta utilizzando cinque robusti vassoi in grado di contenere un set di sei piastre di Petri di dimensioni appropriato foderate con carta bianca. Traccia un set di sei cerchi usando la piastra di Petri di dimensioni appropriate sulla carta in ogni vassoio ed etichetta un set di cerchi che controllano A, B e C e gli altri infestati A, B e C.Quindi etichetta ogni modello di posizionamento con il tempo di raccolta appropriato.Successivamente, etichettare un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri per ogni cerchio nel modello di posizionamento per identificare in modo appropriato la perturbazione, la lettera di replicazione delle piante e il punto di tempo di raccolta. Una volta etichettati tutti i tubi, posizionare un disco di carta da filtro sterile in una piastra di Petri per modello e inumidire i dischi con acqua sterile senza lasciare che la piscina liquida in eccesso in ogni piatto. Quindi posizionare un piatto in ogni cerchio in ogni modello di posizionamento e posizionare tre piante di patate della stessa età e dimensione relativa accanto a ciascun modello di posizionamento.Per iniziare l'infestazione, utilizzare forbici sterili per rimuovere le prime due foglie abbinate da ogni pianta e posizionare una foglia nella piastra di Petri di controllo e una nella piastra di Petri infestata per ogni pianta il più rapidamente possibile. Quando tutte le foglie sono state posizionate, utilizzare le forcep soft touch per trasferire almeno una larva in ogni piatto infestato il più rapidamente possibile e impostare il timer per il tempo di infestazione desiderato. Osserva l'alimentazione per assicurarti che tutte le larve mangino, sostituendo eventuali larve non nutrite se necessario.Rimuovere tutte le larve da tutte le foglie alla fine del tempo di infestazione e iniziare il timer per il raccolto. Alla fine di ogni momento di raccolta, trasferire ogni foglia nel tubo corrispondente e far cadere immediatamente il tubo in azoto liquido per congelare il campione fogliare prima dello stoccaggio a meno 80 gradi Celsius fino all'isolamento dell'RNA. Le larve sane accuratamente messe in scena dovrebbero iniziare a nutrirsi immediatamente dopo il posizionamento sulla superficie fogliare e l'alimentazione dovrebbe continuare in modo abbastanza coerente durante il periodo di infestazione.La larva sul fondo di questa foglia non ha consumato alcun materiale vegetale ed è un esempio di infestazione non riuscita. Queste foglie sono state staccate dalle piante di coltura dei tessuti propagate nodali di due settimane e consumate a velocità e stili di alimentazione diversi per ogni stadio larvale. Sulla base di questi risultati, sono state selezionate le quattro larve instar per valutare ulteriormente i danni alle foglie per piante di patate coltivate in terreno più mature che approssimano più da vicino le piante di patate coltivate sul campo.In questi studi sull'espressione genica, sono stati identificati due nuovi fattori di trascrizione delle dita di zinco C2H2 che sono robustamente reattivi all'erbivoro M.sexta supportando l'uso di foglie staccate per saggi di infestazione. Ricorda di usare foglie abbinate all'età e alle dimensioni e di stadioe correttamente le larve per ogni esperimento poiché l'uniformità si traduce in dati più riproducibili. I tessuti fogliari possono essere saggiati per le specie reattive dell'ossigeno induttivo dallo stress e i derivati dell'ormone dell'acido jasmonico.Trascrittami interi, proteoma o studi sul microbioma possono anche essere eseguiti sui tessuti fogliari.

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