Name: detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00
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著者らは、この研究で使用される昆虫を提供し、幼虫のステージングに関する専門知識を提供してくれたボブ・ファラーとアレクシス・パークに感謝したいと思います。原稿の批判的なレビューのためのマイケル・ブラックバーンとサイカト・ゴーシュに感謝します。
本書における商号または商用製品の言及は、特定の情報を提供する目的でのみ行われ、米国農務省の勧告または推奨を意味するものではありません。
USDAは機会均等プロバイダーであり、雇用主です。

注: 次のプロトコルは、1 人のユーザーがセットアップし、観察を行い、サンプルを収集するように設計されています。同じセットアップの複数の実行を組み合わせて生物学的複製を増やすことができます。実験の追加の繰り返しは、遺伝子発現に対する可能な日次的影響を排除するために、1日の同時に設定する必要があります。プロトコルは、5つの別々の収穫時間ポイントのための3つの「...

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	<li>Choi, H. W., Klessig, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMPs,+MAMPs,+and+NAMPS+in+plant+innate+immunity.">DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity.</a> BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).</li><li>Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polypeptide+from+tomato+leaves+induces+wound-inducible+proteinase+inhibitor+proteins.">A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins.</a> Science. 253, 895-897 (1991).</li><li>Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+in+the+plant+tissue:+the+defense+of+a+dangerous+passage.">Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage.</a> Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).</li><li>Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+Plant+Defenses:+Herbivore-Associated+Molecular+Patterns+and+Effector+Arsenal+of+Chewing+Herbivores.">Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses.">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).</li><li>Chen, M. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+direct+plant+defense+against+insect+herbivores:+A+review.">Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review.</a> Insect Science. 15, 101-114 (2008).</li><li>Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modularity+in+jasmonate+signaling+for+multistress+resilience.">Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience.</a> Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).</li><li>War, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+defence+against+herbivory+and+insect+adaptations.">Plant defence against herbivory and insect adaptations.</a> AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).</li><li>McCloud, E. S., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory+and+caterpillar+regurgitants+amplify+the+wound-induced+increases+in+jasmonic+acid+but+not+nicotine+in+Nicotiana+sylvestris.">Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris.</a> Planta. 203, 430-435 (1997).</li><li>Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+(Lepidoptera,+Sphingidae)+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate:+II.+Accumulation+of+plant+mRNAs+responding+to+insect-derived+cues.">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues.</a> Plant Physiology. , 701-710 (2001).</li><li>Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+(Lepidoptera,+Sphingidae)+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate.+III.+Fatty+acid-amino+acid+conjugates+in+herbivore+oral+secretions+are+necessary+and+sufficient+for+herbivore-specific+plant+responses.">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li><li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory.">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li><li>Hj&#228;lt&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+herbivory:+problems+and+possibilities.">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li><li>Lehtil&#228;, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies.">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li><li>Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+the+evidence?+Manduca+sexta+larvae+can+not+disrupt+specific+jasmonate+induction+in+Nicotiana+attenuata+by+rapid+consumption.">Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption.</a> Planta. 210, 343-346 (2000).</li><li>Zebelo, S. A., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+early+signalling+events+in+plant-insect+interactions.">Role of early signalling events in plant-insect interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).</li><li>Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Before+gene+expression:+early+events+in+plant-insect+interaction.">Before gene expression: early events in plant-insect interaction.</a> Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).</li><li>Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+potato+by+shoot+tip+culture+in+Petri+dishes.">Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes.</a> Potato Research. 23, 445-448 (1980).</li><li>Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+propagation+of+potato+by+single+node+cuttings.">Rapid propagation of potato by single node cuttings.</a> Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).</li><li>Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+combinatorics+to+screen+Bacillus+thuringiensis+isolates+for+toxicity+against+Manduca+sexta+and+Plutella+xylostella.">Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella.</a> Biological Control. 42, 226-232 (2007).</li><li>Bell, R. A., Joachim, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+rearing+laboratory+colonies+of+tobacco+hornworms+and+pink+bollworms.">Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms.</a> Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).</li><li>Lawrence, S. D., Novak, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+remarkable+plethora+of+infestation-responsive+Q-type+C2H2+transcription+factors+in+potato.">The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato.</a> BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).</li><li>Green, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoPhyte:+a+flexible+affordable+method+to+quantify+2D+phenotypes+from+imagery.">PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery.</a> Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).</li><li>Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory+responsive+C2H2+zinc+finger+transcription+factor+protein+StZFP2+from+potato.">Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).</li><li>Korth, K. L., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+chewing+insect-specific+molecular+events+distinct+from+a+general+wound+response+in+leaves.">Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves.</a> Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).</li><li>Browne, R. A., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+an+in+vitro+detached+leaf+assay+for+pre-screening+resistance+to+Fusarium+head+blight+in+wheat.">Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat.</a> European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).</li><li>Browne, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+components+of+fusarium+head+blight+resistance+in+soft+red+winter+wheat+germ+plasm+using+a+detached+leaf+assay.">Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay.</a> Plant Disease. 89, 404-411 (2005).</li><li>Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detached+leaf+and+whole+plant+assays+for+soybean+aphid+resistance:+differential+responses+among+resistance+sources+and+biotypes.">Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes.</a> Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).</li><li>Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detached+leaf+assay+to+screen+for+host+plant+resistance+to+Helicoverpa+armigera.">Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera.</a> Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).</li><li>Vivianne, G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laboratory+assay+for+Phytophthora+infestans+resistance+in+various+Solanum+species+reflects+the+field+situation.">A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation.</a> European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).</li><li>Kamoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+encoding+a+protein+elicitor+of+Phytophthora+infestans+is+down-regulated+during+infection+of+potato.">A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).</li><li>Nowakowska, M., Nowicki, M., K&#322;osi&#324;ska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appraisal+of+artificial+screening+techniques+of+tomato+to+accurately+reflect+field+performance+of+the+Late+Blight+resistance.">Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance.</a> Plos One. 9, e109328 (2014).</li><li>Arimura, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivory-induced+volatiles+elicit+defence+genes+in+lima+bean+leaves.">Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves.</a> Nature. 406, 512-515 (2000).</li><li>Erb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+as+inducers+and+suppressors+of+plant+defense+and+immunity-origins,+specificity,+perception+and+signaling.">Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).</li><li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+of+wounding-induced+root-to-shoot+communication+in+Arabidopsis+thaliana.">Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).</li><li>Ryan, C. A., Moura, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+wound+signaling+in+plants:+A+new+perception.">Systemic wound signaling in plants: A new perception.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).</li><li>Hilleary, R., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+signaling+in+response+to+wounding+and+pathogens.">Systemic signaling in response to wounding and pathogens.</a> Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).</li><li>. Hornworms Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr">https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr</a> (2018)</li><li>. Products Available from: <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018)</li><li>. Raising Manduca sexta Available from: <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018)</li><li>. Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018)</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses.">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li></ol>

既存の植物全植物のハーブの方法論の使用は、この特定の研究の目標を達成するために必要としない(すなわち、侵入に対する応答のための候補遺伝子のセットをスクリーニングする)。剥離した葉の精製の明らかな利点は、ハーブアッセイを行うのにかかる時間を短縮することである。クリップケージを持つ植物全体の扱いにくい性質は排除され、2週間の若い植物は葉を収穫するために使用?...

ハーブは、植物が攻撃を識別し、その生存のための適切な応答をマウントすることができる一連の分子イベントを動かしています。植物は、昆虫を噛むから2つの基本的な手がかりを受け取ります。1つは組織への物理的損傷から、もう1つは昆虫特有の物質から。損傷関連分子パターン(AMP)は、幼虫の口部によって生み出される損傷に応答して放出され、ホルモンジャスモン酸の増加および防御遺伝子1の転写をもたらす明確に定義された創傷応答を引き起こす。最もよく知られているダンプの1つは、システミン、葉が傷ついた後に大きなプロシマリンタンパク質の切断によって形成されるポリペプチド2、3である。ジャスモン酸創傷応答は、毛虫唾液、腸中身(逆流)およびFEC(フラス)4に由来することができる、ハーブ動物関連分子パターン(HAMP)によってさらに調節される。昆虫は、防御応答5を高めるか、または回避するためにこれらの物質を使用します。転写因子は、下流防衛遺伝子6、7、8の調節を介して防御応答におけるホルモン信号からのメッセージを中継する。
実験室の設定で使用される植物昆虫の相互作用研究の中には、昆虫による自然な摂食方法を近似する目的で、シミュレートされたタイプの植物と昆虫の相互作用研究があります。模擬ハーブは、通常、ダンプの放出を引き起こし、防御遺伝子の産生を引き起こすのに十分な昆虫の口分けの特定のメカニズムを模倣する様々なツールを使用して植物組織に人工的な損傷を作成することによって達成されます。口腔分泌物や逆流剤などの他の昆虫特異的成分は、多くの場合、HAMP9、10、11からの寄与を複製するために追加される。特定のサイズと創傷のタイプの作成と正確な量のHAMPの適用は、研究のこれらのタイプの1つの利点であり、より再現性の高い結果を提供することができます。植物組織への損傷が被養昆虫や実験室で飼育された昆虫の適用によって達成される自然なハーブ類研究は、創傷サイズとHAMP量が昆虫の行動によって支配され、変動性を追加するので、しばしばより困難である。データ。自然対シミュレートされた方法とその長所と短所は、文献12、13、14でよく議論されています。
転写因子などの早期シグナル伝達事象を研究するには、葉の一定の割合を比較的短い時間で消費する必要があるため、幼虫はすぐに噛み始め、葉が分析のために凍結されるまで消費を維持する必要があります。M.sextaは、その幼虫の段階の多くの間に複数のソラナス植物の貪欲なフィーダーであり、比較的短い時間15で最大ダメージを与えるのに理想的です。これは、昆虫が葉面16、17に接触した直後に植物応答が起こるので、早期シグナル伝達事象を研究する際に便利である。封じ込めの一般的に使用されるクリップケージの方法は、複数のケージが幼虫の除去または追加を可能にするために実験全体を通して継続的な調整を必要とするように、不器用であることを証明します。葉はまた、同時に複数の昆虫の餌を支えるのに十分な大きさと強さでなければなりません。これらのタイプのジャガイモ植物は、摂食を観察するために大量のスペースを必要とします。幼虫はしばしば葉の表面の下側に移動し、また摂食観察を非常に困難にします。これらの実験を行うために植物全体を使用することは明らかに面倒です。
現在の研究では、植物全体ではなくペトリ皿に分離された剥離葉を使用して、ハーブを研究するための植物全体のアプローチを合理化し、簡素化しています。本研究におけるプロトコルの適用は、M.セクスタ幼虫による生体損傷後のジャガイモ葉の早期誘導C2H2転写因子の群の観察に限定される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1139">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">agar substitute</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">G3251</td>
			<td style="width:471px;">product is Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">containment vessel (6,12 or 24 well dish)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td>
			<td>many other companies sell these products</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">143880</td>
			<td>30-50 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>50, 100, 250 or 500 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">microcentrifuge tubes, 1.7 ml&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:173px;">1158R22</td>
			<td>these have been tested in liquid N2 and will not explode</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Murashige &#38; Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M519</td>
			<td>used to make propagation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">nutrient agar mix</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M5825</td>
			<td>product is Murashige &#38; Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">paper filter discs</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">09-805A</td>
			<td>Whatman circles-purchase to fit in petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">FB0875713A or FB0875712</td>
			<td>purchase size appropriate for leaf size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">potato tubers&#160;</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">pots, 10&#34;&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">41PT1000CN2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">preservative/biocide</td>
			<td style="width:217px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>product is PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">seed potatoes for explant source</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">slow release fertilizer (14-14-14 )</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>Osmocote is a popular brand name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">soft touch forceps</td>
			<td style="width:217px;">BioQuip</td>
			<td style="width:173px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">soil mix</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">65-51121</td>
			<td>product is Sunshine LC1 mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">C2100</td>
			<td>Magenta-type vessel, PTL-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ICN2672206</td>
			<td>product is MP Biomedicals Plantcon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta

昆虫のハーブボリーの遺伝子発現研究の多重栄養性は、生物学的複製の多数を必要とし、より簡単で、より合理化されたハーブプロトコルの必要性を作成する。噛む昆虫の摂動は、通常、植物システム全体で研究されています。この生物戦略全体が普及しているが、同様の観測値を単一の剥離した葉に複製できる場合は必要ない。信号伝達に必要な基本的な要素は、リーフ自体の中に存在することを前提とします。シグナル伝達の初期の事象の場合、細胞は摂動からシグナルを受け取り、そのシグナルを遺伝子発現のためにアッセイされる隣接細胞に送信するだけで済みます。
提案された方法は、単にデタッチメントのタイミングを変更します。植物全体の実験では、幼虫は、最終的に植物から切り離され、遺伝子発現のためにアッセイされる単一の葉に限定されます。切除の順序が逆化した場合、植物研究全体の最後から、剥離研究の第1位まで、摂食実験が簡素化される。
ソラナム管状var.ケネベックは、単純な組織培養培地における節点転写によって伝播し、必要に応じてさらなる成長のために土壌に移される。葉は親植物から取り除かれ、摂食アッセイがM.sextaの幼虫期で行われるペトリ皿に移される。損傷した葉組織は、信号伝達における比較的初期の事象の発現のためにアッセイされる。遺伝子発現解析では、侵入特異的Cys2-His2(C2H2)転写因子を同定し、早期応答研究で剥離葉を用いた成功を確認した。この方法は、植物全体の侵入よりも実行が容易であり、より少ないスペースを使用します。

リーフ消費は、プロトコルの成功を定義します。健康で正確にステージングされた幼虫は、葉の表面に配置した直後に摂食を開始し、摂食は、侵入時間を通じてかなり一貫した方法で継続する必要があります。ビデオ1では、上部の幼虫は配置直後に噛み始め、摂食中に一貫した速度を維持する。これは、侵入後の早期遺伝子発現事象をアッセイする場合?...

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Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

提示された方法は、ジャガイモの剥離葉にマンドゥカセクスタ幼虫の適用を通じて自然な手持ちの損傷植物組織を作成します。植物組織は、昆虫のハーブに対する早期応答に関与する6つの転写因子ホモロの発現のためにアッセイされる。

噛む昆虫マンドゥカセクスタによる侵入時のジャガイモの遺伝子発現研究を簡素化する剥離葉アッセイ

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

このプロトコルは、昆虫の草食に応答して植物遺伝子発現を測定するための合理化されたアプローチを使用しています。ペトリ皿で分離された剥離された葉を使用することにより、昆虫は、再現可能な遺伝子発現データに寄与する比較的短い感染期間中に適用および監視することが容易になる。このプロトコルは、多くの植物/昆虫の相互作用に適応することができます。プラントシステム全体からのベースライン観測が考慮される場合。昆虫の餌付けの予測不可能な性質は困難な場合があります。したがって、適切にステージングされた幼虫と健康な植物の信頼できる供給は、成功の最良のチャンスを提供します。健康な植物や昆虫がどのように見え、どのように振る舞うべきかを視覚化することは、特に研究分野に新しい研究者にとって最適な結果を達成するのに役立ちます。私と一緒に手順を実証することは、果物や野菜ラボの遺伝的改善の分子生物学者フランシス・ペレスです。節門伝播組織培養ポテト植物を調製するために、まず少なくとも3〜4個の節を有する外植物質から成長したケネベック植物を得る。滅菌ブレードを使用して、葉を取り除き、葉1本あたり枝組織を約2ミリメートル残します。各節点の上下に約2ミリメートルカットして節幹から節を取り除き、枝を上に向けて節点移動培地を含む滅菌組織培養容器に節線切断を配置します。その後、節点挿片を植物組織培養室に移し、摂氏24度で2〜3週間の成長と16時間の光、8時間の暗い写真期間を行います。餌を与えるために昆虫を準備するには、M.sextaの所望の幼虫段階を取得し、幼虫の大きさに応じて適切な格納容器の各ウェルに1つの幼虫を移す。ホワイトペーパーが並ぶ6つの適切なサイズのペトリ皿のセットを保持することができる5つの頑丈なトレイを使用して、各収穫時間の配置テンプレートを作成します。各トレイの用紙に適切なサイズのペトリ皿を使用して6つの円のセットをトレースし、1組の円がA、B、Cを制御し、他の出没したA、B、およびC.その後、適切な収穫時間で各配置テンプレートにラベルを付けます。次に、配置テンプレートの各円に対して1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにラベルを付け、摂動、植物複製レター、収穫時間を適切に特定します。すべてのチューブにラベルが付けられている場合は、テンプレートごとに1つのペトリ皿に滅菌フィルターペーパーディスクを入れ、各皿に余分な液体プールを入れずに滅菌水でディスクを湿らせます。その後、各配置テンプレートの各円に1皿を配置し、各配置テンプレートの横に同じ年齢と相対サイズの3つのジャガイモ植物を配置します。出没を開始するには、滅菌はさみを使用して各植物から上の2つのサイズの一致した葉を取り除き、コントロールペトリ皿に1枚の葉を入れ、植物ごとに出没したペトリ皿にできるだけ早く置きます。すべての葉が置かれたら、ソフトタッチ鉗子を使用して、少なくとも1匹の幼虫をできるだけ早く各出没皿に移し、目的の出没時間にタイマーを設定します。授乳を観察して、すべての幼虫が食べていることを確認し、必要に応じて非給餌幼虫を置き換えます。出没時間の終わりにすべての葉から幼虫のすべてを取り除き、収穫のためのタイマーを開始します。各収穫時間の終わりに、各葉を対応するチューブに移し、すぐに液体窒素にチューブを落とし、RNAが単離するまでマイナス80°Cで貯蔵する前に葉サンプルを凍結します。健康な正確にステージングされた幼虫は、葉表面に配置した直後に餌を与え始め、供給は出没期間を通してかなり一貫した方法で継続するべきである。この葉の底にある幼虫は植物材料を消費せず、失敗した侵入の例です。これらの葉は、2週齢の節電組織培養植物から切り離され、各幼虫段階の異なる速度と摂食様式で消費された。これらの結果に基づいて、第4のインスター幼虫は、より密接に畑栽培ジャガイモ植物のより成熟した土壌栽培ジャガイモ植物の葉への損傷をさらに評価するために選択された。これらの遺伝子発現研究では、M.sexta草牙に強く反応する2つの新しいC2H2ジンクフィンガー転写因子が、出没アッセイのための剥離葉の使用を支持することを同定した。均一性がより再現性の高いデータをもたらすので、年齢とサイズの一致した葉を使用し、各実験の幼虫を適切にステージングすることを忘れないでください。葉組織は、ストレス誘導反応性酸素種およびジャスモン酸ホルモン誘導体についてアッセイすることができる。全体のトランスクリプトーム, プロテオーム, またはマイクロバイオーム研究も葉組織に対して行うことができます。.

Research

JoVE Journal

Environment

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect (Cryptococcus fagisuga Lind.)

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect Cryptococcus fagisuga Lind.

ブナスケール昆虫への抵抗のためのアメリカのブナを（画面ための技術<em&gt;クリプトコッカスfagisuga</em&gt;リンド。）

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

篩部と半翅目昆虫の植物 sap 供給の RNA 干渉を誘発する二本鎖 RNA の経口配信方法

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

海洋モデルとしてフジツボタテジマフジツボ improvisus培養と遺伝子発現

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

稚魚の行動応答プロファイルを調べるための実験プロトコル: 神経興奮剤カフェインへの応用

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

昆虫の出現パターンの検出の正確かつ自律システム

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

純粋な落葉スタンドにおける3つの異なる方法を用いてリーフエリア指数推定

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

ポテトウイルスXベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)ポテト中。

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...