Name: detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta at JoVE.com

Los autores quieren agradecer a Bob Farrar y Alexis Park por proporcionar insectos utilizados en este estudio y por su experiencia en la puesta en escena larval. Gracias adicionales a Michael Blackburn y Saikat Ghosh por la revisión crítica del manuscrito.
La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.
USDA es un Proveedor y Empleador de Igualdad de Oportunidades.

NOTA: El siguiente protocolo está diseñado para que una persona configure, haga observaciones y recoja muestras. Se pueden combinar varias ejecuciones de la misma configuración para aumentar la replicación biológica. Cualquier repetición adicional del experimento debe configurarse a la misma hora del día para eliminar posibles influencias diurnas en la expresión génica. El protocolo está diseñado para crear 3 hojas 'infestadas' para 5 puntos de tiempo de cosecha separados. Las hojas de control coincidentes par...

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Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues.</a> Plant Physiology. , 701-710 (2001).</li><li>Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+(Lepidoptera,+Sphingidae)+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate.+III.+Fatty+acid-amino+acid+conjugates+in+herbivore+oral+secretions+are+necessary+and+sufficient+for+herbivore-specific+plant+responses.">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li><li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory.">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li><li>Hj&#228;lt&#233;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+herbivory:+problems+and+possibilities.">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li><li>Lehtil&#228;, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies.">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li><li>Schittko, U., Preston, C. 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Products Available from: <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018)</li><li>. Raising Manduca sexta Available from: <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018)</li><li>. Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018)</li><li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses.">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li></ol>

El uso de metodologías herbáceas de plantas enteras existentes no es necesario para lograr el objetivo de este estudio en particular (es decir, examinar un conjunto de genes candidatos para su respuesta a la infestación). El beneficio obvio del refinamiento de la hoja separada es acortar el tiempo que se tarda en realizar ensayos herbívoros. La naturaleza difícil de controlar de plantas enteras con jaulas de clip se elimina y los ensayos se realizan antes, ya que las plantas de tan solo 2 semanas se pueden utilizar ...

Herbivory pone en marcha una serie de eventos moleculares durante los cuales una planta puede identificar el ataque y montar una respuesta apropiada para su supervivencia. Una planta recibe dos señales básicas de los insectos masticadores; uno por el daño físico al tejido y el otro a partir de sustancias específicas de insectos. Los patrones moleculares asociados al daño (DamP) se liberan en respuesta al daño creado por las partes bucales larvales y desencadenan una respuesta de herida bien definida que resulta en un aumento de la hormona ácido jasmónico y la transcripción de los genes de defensa1. Uno de los DamPs más conocidos es systemin, un polipéptido que se forma por el escote de la proteína prosystemin más grande después de que una hoja es herida2,3. La respuesta de la herida de ácido jasmónico se modula aún más por patrones moleculares asociados a herbívoros (HAMPs), que pueden derivarse de saliva de oruga, contenido intestinal (regurgitante) y heces (frass)4. Los insectos utilizan estas sustancias para aumentar o evadir la respuesta de defensa5. Los factores de transcripción transmiten el mensaje de las señales hormonales en la respuesta de defensa a través de la regulación de los genes de defensa aguas abajo6,7,8.
Algunos estudios de interacción entre plantas y insectos utilizados en entornos de laboratorio son del tipo simulado, con el objetivo de aproximar el método natural de alimentación por el insecto. El herbívoro simulado generalmente se logra mediante la creación de daño artificial a los tejidos vegetales con varias herramientas que imitan el mecanismo específico de las partes bucales de insectos suficientes para causar la liberación de DAPP y desencadenar la producción de genes de defensa. Otros componentes específicos de insectos como las secreciones orales o regurgitante a menudo se añaden para replicar la contribución de los HAMPs9,10,11. La creación de un tamaño y tipo específico de herida y la aplicación de cantidades precisas de HAMPs es una ventaja para este tipo de estudios y puede ofrecer resultados más reproducibles. Los estudios herbívoros naturales, donde el daño al tejido vegetal se logra mediante la aplicación de insectos adquiridos en el campo o criados en laboratorio, a menudo son más difíciles porque el tamaño de la herida y las cantidades de HAMP se rigen por el comportamiento de los insectos y añaden variabilidad a la Datos. Los métodos naturales versus simulados y sus ventajas y desventajas están bien debatidas en la literatura12,13,14.
Para estudiar los primeros eventos de señalización, como los factores de transcripción, se debe consumir un cierto porcentaje de la hoja en un período relativamente corto de tiempo, por lo que las larvas deben comenzar a masticar inmediatamente y mantener el consumo hasta que la hoja se congele para su análisis. M. sexta es un alimentador voraz en múltiples plantas solanaceous durante muchas de sus etapas larvales, por lo que es ideal para impartir el máximo daño en un período relativamente corto de tiempo15. Esto es conveniente cuando se estudian los primeros eventos de señalización, ya que la respuesta de la planta ocurre casi inmediatamente después de que un insecto entra en contacto con la superficie de la hoja16,17. El método de contención de jaulas de clip comúnmente utilizado resulta torpe, ya que varias jaulas requerirían ajustes continuos a lo largo del experimento para permitir la eliminación o adición de larvas. Las hojas también deben ser lo suficientemente grandes y fuertes como para soportar la alimentación de múltiples insectos al mismo tiempo. Estos tipos de plantas de patata requieren una gran cantidad de espacio para observar la alimentación. Las larvas a menudo se reubican en la parte inferior de la superficie de la hoja, lo que también hace que las observaciones de alimentación sean bastante difíciles. El uso de plantas enteras para realizar estos experimentos es claramente engorroso.
El estudio actual utiliza hojas desprendidas aisladas en platos Petri en lugar de plantas enteras para agilizar y simplificar todo el enfoque vegetal para estudiar el herbívoro. La aplicación del protocolo en este estudio se limita a la observación de un grupo de factores de transcripción C2H2 inducidos temprano en las hojas de patata después del daño herbívoro por M. sexta larvas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1139">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">agar substitute</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">G3251</td>
			<td style="width:471px;">product is Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">containment vessel (6,12 or 24 well dish)</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td>
			<td>many other companies sell these products</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">143880</td>
			<td>30-50 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">manduca eggs&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>50, 100, 250 or 500 eggs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">manduca larvae</td>
			<td style="width:217px;">Great Lakes Hornworm</td>
			<td style="width:173px;">call for specific larval instar requests</td>
			<td>any instar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">microcentrifuge tubes, 1.7 ml&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:173px;">1158R22</td>
			<td>these have been tested in liquid N2 and will not explode</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Murashige &#38; Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M519</td>
			<td>used to make propagation medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">nutrient agar mix</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">M5825</td>
			<td>product is Murashige &#38; Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">paper filter discs</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">09-805A</td>
			<td>Whatman circles-purchase to fit in petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">FB0875713A or FB0875712</td>
			<td>purchase size appropriate for leaf size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">potato tubers&#160;</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">pots, 10&#34;&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">41PT1000CN2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">preservative/biocide</td>
			<td style="width:217px;">Plant Cell Technology</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>product is PPM (Plant Preservative Mixture)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">seed potatoes for explant source</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">B size (not organic)</td>
			<td style="width:471px;">suggest Maine Farmer&#8217;s Exchange</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">slow release fertilizer (14-14-14 )</td>
			<td style="width:217px;">any</td>
			<td style="width:173px;">NA</td>
			<td>Osmocote is a popular brand name</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">soft touch forceps</td>
			<td style="width:217px;">BioQuip</td>
			<td style="width:173px;">4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">soil mix</td>
			<td style="width:217px;">Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td>
			<td style="width:173px;">65-51121</td>
			<td>product is Sunshine LC1 mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td style="width:173px;">C2100</td>
			<td>Magenta-type vessel, PTL-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">sterile culture vessel&#160;</td>
			<td style="width:217px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ICN2672206</td>
			<td>product is MP Biomedicals Plantcon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detached leaf assays to simplify gene expression studies in potato during infestation by chewing insect manduca sexta

La naturaleza multitrófica de los estudios de expresión génica de herbívoros de insectos exige un gran número de réplicas biológicas, creando la necesidad de protocolos herbáricos más simples y simplificados. Las perturbaciones de los insectos masticadores generalmente se estudian en sistemas vegetales enteros. Si bien esta estrategia de todo el organismo es popular, no es necesario si observaciones similares se pueden replicar en una sola hoja separada. La suposición es que los elementos básicos necesarios para la transducción de la señal están presentes dentro de la propia hoja. En el caso de los primeros acontecimientos en la transducción de la señal, las células sólo necesitan recibir la señal de la perturbación y transmitir esa señal a las células vecinas que se ensayan para la expresión génica.
El método propuesto simplemente cambia el momento del desprendimiento. En experimentos con plantas enteras, las larvas se limitan a una sola hoja que finalmente se separa de la planta y se ensaya para la expresión génica. Si se invierte el orden de la escisión, desde el último en estudios de plantas enteras, hasta el primero en el estudio separado, se simplifica el experimento de alimentación.
 Kennebec se propaga por transferencia nodal en un medio de cultivo de tejido simple y se transfiere al suelo para un mayor crecimiento si se desea. Las hojas se extircan de la planta madre y se trasladan a los platos de Petri donde el ensayo de alimentación se lleva a cabo con las etapas larvales de M. sexta. El tejido de la hoja dañado se ensaya para la expresión de eventos relativamente tempranos en la transducción de la señal. El análisis de la expresión génica identificó factores de transcripción Cys2-His2 (C2H2) específicos de la infestación, lo que confirma el éxito del uso de hojas desasociadas en estudios de respuesta temprana. El método es más fácil de realizar que las infestaciones de plantas enteras y utiliza menos espacio.

El consumo de hoja define el éxito del protocolo. Las larvas sanas y escenificadas con precisión deben comenzar a alimentarse inmediatamente después de la colocación en la superficie de la hoja y la alimentación debe continuar de manera bastante consistente durante el tiempo de infestación. En el video1, la larva en la parte superior comienza a masticar inmediatamente después de la colocación y mantiene una velocidad constante durante la alimentación. Esto es esp...

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Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

El método presentado crea tejido vegetal dañado herbívoro natural a través de la aplicación de larvas de Manduca sexta a hojas separadas de papa. El tejido vegetal se analiza para la expresión de seis homólogos del factor de transcripción implicados en las primeras respuestas al herbívoro de insectos.

Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Este protocolo utiliza un enfoque simplificado para medir la expresión génica de la planta en respuesta al herbívoro de insectos. Mediante el uso de hojas separadas aisladas en platos Petri, los insectos son más fáciles de aplicar y monitorear durante el período relativamente corto de infestación contribuyendo a datos reproducibles de expresión génica. Este protocolo puede adaptarse a muchas interacciones entre plantas y insectos.si se consideran las observaciones de referencia de sistemas vegetales enteros. La naturaleza impredecible de la alimentación de insectos puede ser un desafío. Por lo tanto, un suministro confiable de larvas correctamente escenificadas y plantas sanas proporcionan la mejor oportunidad de éxito.Visualizar cómo deben aparecer y comportarse las plantas e insectos sanos es fundamental para lograr resultados óptimos, especialmente para los investigadores nuevos en el campo de estudio. Demostrando el procedimiento conmigo estará Frances Pérez, una bióloga molecular en el laboratorio de mejora genética de frutas y verduras. Para preparar plantas de patata de cultivo de tejido propagado nodal, primero obtenga plantlets Kennebec cultivados a partir de material explantado con al menos tres a cuatro nodos.Utilice una cuchilla estéril para eliminar las hojas cortando las ramas cerca del tallo principal y dejando alrededor de dos milímetros de tejido de rama por hoja. Corte aproximadamente dos milímetros por encima y por debajo de cada nodo para eliminar las secciones nodales de los tallos y organizar los esquejes nodales en un recipiente de cultivo de tejido estéril que contenga un medio de transferencia nodal con la rama apuntando hacia arriba. Luego transfiera los esquejes nodales a una cámara de cultivo de tejido vegetal para dos o tres semanas de crecimiento a 24 grados centígrados y un período de foto oscuro de 16 horas de luz y ocho horas.Para preparar los insectos para la alimentación, obtener la etapa larval deseada de M.sexta y transferir una larva a cada pozo de un recipiente de contención apropiado de acuerdo con el tamaño de la larva. Haga plantillas de colocación para cada punto de tiempo de cosecha utilizando cinco bandejas resistentes capaces de sostener un conjunto de seis platos Petri de tamaño adecuado forrados con papel blanco. Trace un conjunto de seis círculos usando el plato Petri del tamaño adecuado en el papel en cada bandeja y etiquete un conjunto de círculos control A, B y C y el otro infestado A, B y C.Then etiquete cada plantilla de colocación con el tiempo de cosecha adecuado.A continuación, etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros para cada círculo de la plantilla de colocación para identificar adecuadamente la perturbación, la letra de replicación de la planta y el punto de tiempo de cosecha. Cuando todos los tubos hayan sido etiquetados, coloque un disco de papel de filtro estéril en un plato de Petri por plantilla y humedezca los discos con agua estéril sin dejar que el exceso de líquido se acose en cada plato. A continuación, coloque un plato en cada círculo en cada plantilla de colocación y coloque tres plantas de papa de la misma edad y tamaño relativo junto a cada plantilla de colocación.Para iniciar la infestación, utilice tijeras estériles para eliminar las hojas superiores de dos tamaños de cada planta y coloque una hoja en el plato petri de control y una en el plato Petri infestado para cada planta lo más rápido posible. Cuando se hayan colocado todas las hojas, utilice fórceps táctiles suaves para transferir al menos una larva a cada plato infestado lo más rápido posible y ajuste el temporizador para el tiempo de infestación deseado. Observe la alimentación para asegurarse de que todas las larvas están comiendo, reemplazando cualquier larva no alimentada según sea necesario.Retire todas las larvas de todas las hojas al final del tiempo de infestación e inicie el temporizador para la cosecha. Al final de cada punto de tiempo de cosecha, transfiera cada hoja al tubo correspondiente y suelte inmediatamente el tubo en nitrógeno líquido para congelar la muestra de la hoja antes de almacenarla a menos 80 grados centígrados hasta el aislamiento del ARN. Las larvas saneadas con etapas precisas deben comenzar a alimentarse inmediatamente después de la colocación en la superficie de la hoja y la alimentación debe continuar de manera bastante consistente durante todo el período de tiempo de infestación.La larva en el fondo de esta hoja no consumió ningún material vegetal y es un ejemplo de una infestación infructuosa. Estas hojas se separaron de las plantas de cultivo de tejido propagado nodal de dos semanas de edad y se consumieron a diferentes velocidades y estilos de alimentación para cada etapa larval. Sobre la base de estos resultados, se seleccionaron las cuartas larvas instar para evaluar aún más el daño a las hojas de las plantas de papa cultivadas en suelo más maduro que se aproximan más a las plantas de papa cultivadas en el campo.En estos estudios de expresión génica, se identificaron dos nuevos factores de transcripción de dedos de zinc C2H2 que responden robustamente al herbívoro M.sexta apoyando el uso de hojas separadas para ensayos de infestación. Recuerde usar la edad y el tamaño de las hojas emparejadas y para escenificar adecuadamente las larvas para cada experimento como la uniformidad resulta en datos más reproducibles. Los tejidos de las hojas se pueden ensayar para especies de oxígeno reactivo inducidas por el estrés y derivados de la hormona del ácido jasmónico.También se pueden realizar estudios completos de transcriptoma, proteoma o microbioma en los tejidos de las hojas.

Research

JoVE Journal

Environment

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Investigación

Medio ambiente

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect (Cryptococcus fagisuga Lind.)

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Una técnica a la pantalla haya americana para la resistencia al insecto Haya Scale (<em&gt; Fagisuga Cryptococcus</em&gt; Lind.)

Beech bark disease (BBD) results in high levels of initial mortality, leaving behind survivor trees that are greatly weakened and deformed.&#160;The ...

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

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Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

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