Name: xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

REMARQUE : Un tableau schématique de ce protocole est affiché à la figure 1.
1. Échantillonnage : Relaxation de tension dans la colonne d'eau des conduits de Xylem
REMARQUE : Le traitement suivant de relaxation de tension est recommandé avant l'application de LN2 pour éviter les artefacts de congélation et de tension-induits dans la distribution d'eau de xylème.
<ol><li>Enfermer une branche et des feuilles pour l'é...

Les méthodes d'observation cryo-SEM introduites dans ce document sont pratiques pour visualiser clairement la distribution de l'eau à l'échelle cellulaire. Grâce à cette méthode, l'exploration des changements dans la distribution de l'eau dans le xylisme peut potentiellement aider à clarifier le mécanisme de tolérance des espèces d'arbres au stress abiotique (pénurie d'eau ou de congélation) ou au stress biotique (maladie des arbres).
L'étape la plus cruciale de cette méthode est...

La disponibilité des ressources en eau (c.-à-d. précipitations, teneur en eau du sol) détermine strictement la mortalité et la répartition géographique des espèces végétales, puisqu'elles doivent absorber l'eau du sol et la transporter vers les feuilles pour la production photosynthétique. Les usines doivent maintenir leur système de transport d'eau sous des approvisionnements fluctuants en eau. En particulier, les plantes ligneuses génèrent de fortes tensions dans leurs conduits le long des cours d'eau de transpiration car, dans certains cas, elles doivent tenir leur couronne à plus de 100 m au-dessus du sol. Pour maintenir des colonnes d'eau sous une pression négative aussi élevée, les conduits de xylée se composent d'un continuum de cellules tubulaires avec des parois cellulaires rigides et hydrophobes lignifiées1. La vulnérabilité au dysfonctionnement du xylée des conduits de xylisdans chaque espèce est un bon déterminant de la survie de l'espèce sous l'approvisionnement fluctuant en eau2. En outre, l'étude de l'état de l'eau des conduits de xylée est importante pour l'évaluation de l'état de santé des arbres individuels soumis à des stress abiotiques ou biotiques. La mesure du débit de sève ou du potentiel d'eau peut fournir des estimations de l'état de l'eau d'une usine ligneuse en raison de la fonction hydraulique intégrée des conduits de xylisme. En outre, la visualisation de la distribution de l'eau dans les cellules xylées peut clarifier l'état des composants individuels du système hydraulique xylée.
Plusieurs techniques de visualisation de l'état de l'eau des conduits de xylage existent3. Les méthodes classiques et utiles pour observer les voies d'eau dans les tissus ligneux impliquent de tacher la colonne d'eau en plongeant les extrémités des branches coupées dans un colorant ou en injectant un colorant dans les tiges d'arbres debout4. La photographie aux rayons X souple permet également la visualisation de la distribution de l'eau des disques de bois tranchés en raison de l'intensité différentielle d'absorption des rayons X de l'humidité dans le xylisme5,6. Ces méthodes, cependant, ne fournissent que des traces de mouvement de l'eau ou démontrent des distributions macroscopiques de l'eau. Récemment, les techniques d'observation non destructives, telles que la tomographie calculée par rayons X micro focus (CT)7,8,9,10et l'imagerie par résonance magnétique (IRM)11, 12, ont été considérablement améliorés pour permettre l'observation de l'eau dans les conduits de xylage dans les jeunes arbres intacts. Ces méthodes non destructives ont de grands avantages en ce que nous pouvons observer l'état de l'eau du xylèm sans effets de coupe artificielles, et nous pouvons suivre la dynamique du débit d'eau par imagerie séquentielle ou l'introduction d'un agent de contraste10. Cependant, nous devons utiliser une IRM personnalisée pour l'imagerie végétale ou une installation spécialisée pour l'OstT à base de synchrotron afin d'obtenir les images qui peuvent identifier la teneur en eau au niveau cellulaire. En outre, bien que le système de TCT à base de synchrotron ait permis d'obtenir des images fines avec une haute résolution spatiale, ce qui est comparable à la microscopie légère7,8,9, les cellules vivantes peuvent être blessées par le rayonnement de rayons X à haute énergie13,14. L'utilisation d'un microscope électronique à balayage dans lequel des cryo-unités sont installées (cryo-SEM) est une méthode très utile pour localiser précisément l'eau dans le xylisme au niveau cellulaire, bien que cela nécessite la récolte destructrice de l'échantillon pour l'observation. Pour fixer l'eau dans les conduits de xylème, une partie des tiges (c.-à-d. brindilles, branches ou tiges) sont congelées in situ par l'azote liquide (LN2). Les observations de la surface des spécimens congelés et taillés par cryo-SEM fournissent des images très amples de la structure du xylisme à partir de laquelle nous pouvons identifier l'eau dans les conduits de xylée comme de la glace. Une limitation importante de cette méthode est qu'il est impossible d'observer séquentiel la movabilité de l'eau dans le même échantillon. Cependant, l'application de l'ItC ou de l'IRM pour l'observation séquentielle des arbres qui vivent dans un champ est extrêmement difficile parce que ces instruments ne sont pas portables. En revanche, cryo-SEM a un potentiel pour utiliser cette technique sur les grands arbres dans les expériences sur le terrain pour visualiser clairement le contenu de l'eau non seulement au niveau cellulaire, mais aussi à un niveau de structure plus fine, par exemple, l'eau dans les fosses intervasculaires15, l'eau dans espaces intercellulaires16, ou bulles dans la colonne d'eau17.
Beaucoup d'études observant l'eau de xylem par cryo-SEM ont été rapportées 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et coll. (1996) ont d'abord établi le protocole d'observation du xylème in situ par congélation d'un tronc vivant en remplissant le LN2 dans un récipient fixé sur la tige21. La température de l'échantillon a été maintenue en dessous de -20 oC pendant la collecte de l'échantillon et pendant la préparation cryo-SEM afin d'éviter de faire fondre la glace dans des conduits de xylisme. Cette méthode a été utilisée pour observer l'eau dans le xylisme afin de clarifier la distribution de l'eau sous le régime changeant de l'eau11,12,24,25,26, 27,28, la variation saisonnière de la distribution d'eau21,29,30, l'effet des cycles de gel-dégel17,31, 32, la distribution de l'eau dans le bois humide5, les changements dans la distribution de l'eau au cours de la transition du bois de sève au bois de coeur20, le cours saisonnier de temps de l'activité cambiale et la différenciation des navires33, et la cavitation induite par certains stress biotiques23,34. La conductivité hydraulique et la vulnérabilité des conduits à la cavitation ont également été vérifiées à l'aide de cryo-SEM35,36. Cryo-SEM équipé d'une spectrométrie de rayons X dispersive séduismnisée (EDX ou EDS) a été utilisé pour étudier la distribution des éléments à la surface d'un spécimen contenant de l'eau37.
La fixation par congélation d'un tronc vivant qui contient des conduits sous haute tension hydraulique provoque parfois des cavitations artificielles qui sont observées par cryo-SEM comme cristaux de glace fracturés dans le lumen des conduits38,39. En particulier, les espèces à larges deleurs avec des conduits plus longs et plus larges sont vulnérables aux artefacts induits par la tension, tels que la cavitation causée par la coupe d'échantillons, même si elle est menée sous l'eau3,40. Les artefacts de cavitation deviennent visibles après l'échantillonnage d'un arbre qui transpire (c.-à-d. l'échantillonnage pendant la journée) ou dans de graves conditions de sécheresse et ils peuvent induire en erreur une surestimation de l'occurrence de cavitation3,38, 39. Par conséquent, la tension de travail dans les conduits doit être libéré afin d'éviter la cavitation artifactual3,12,39.
La technique de congélation-fracture à l'aide d'un couteau installé dans une chambre de spécimen est souvent employée pour exposer la surface de spécimen pour l'observation cryo-SEM. Cependant, les plans gelés des tissus végétaux ligneux, en particulier les sections transversales du xylisme secondaire, sont trop rugueux pour observer clairement les caractéristiques anatomiques et l'eau dans le tissu6. L'application d'un cryostat pour l'élagage d'un spécimen permet une préparation rapide et de haute qualité des surfaces d'échantillon20,23. L'objectif global de cette méthode est de fournir des preuves avec la résolution de microscopie électronique de la distribution de l'eau dans divers types de cellules xylées in situ sans l'occurrence d'artefacts d'échantillonnage. Nous introduisons notre procédure mise à jour, qui a été régulièrement améliorée depuis que nous l'avons adoptée pour la première fois, en ce qui concerne l'échantillonnage, la coupe et le nettoyage de la surface du spécimen pour obtenir des micrographes électroniques de haute qualité d'échantillons cryo-fixes de xylisme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:249px;">coating material</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">Gold wire, 0.50 &#215; 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499&#160;</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:249px;">cryo scanning electron microscope</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:48px;width:249px;">cryostat</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">CryoStar NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">microtome blade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">tissue freezing embedding medium</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope

Un microscope électronique à balayage installé cryo-unité (cryo-SEM) permet l'observation des spécimens à des températures inférieures à zéro et a été utilisé pour explorer la distribution d'eau dans les tissus végétaux en combinaison avec des techniques de fixation du gel à l'aide d'azote liquide (LN 2). Pour les espèces ligneuses, cependant, les préparations pour l'observation de la surface transversale du xylisme impliquent certaines difficultés en raison de l'orientation des fibres de bois. En outre, une tension plus élevée dans la colonne d'eau dans les conduits de xylée peut parfois provoquer des changements artificiels dans la distribution de l'eau, en particulier lors de la fixation et la collecte de l'échantillon. Dans cette étude, nous démontrons une procédure efficace pour observer la distribution d'eau dans le xylisme des plantes ligneuses in situ en utilisant un cryostat et cryo-SEM. Dans un premier temps, lors de la collecte de l'échantillon, la mesure du potentiel d'eau xylée devrait déterminer si une tension élevée est présente dans les conduits de xylisme. Lorsque le potentiel d'eau du xylée est faible (lt; vers 0,5 MPa), une procédure de relaxation de tension est nécessaire pour faciliter une meilleure préservation de l'état de l'eau dans les conduits de xylée pendant la fixation du gel de l'échantillon. Ensuite, un collier étanche est fixé autour de la tige de l'arbre et rempli de LN2 pour la fixation de gel de l'état de l'eau du xylème. Après la récolte, il faut veiller à ce que l'échantillon soit conservé congelé tout en complétant les procédures de préparation à l'observation de l'échantillon. Un cryostat est utilisé pour exposer clairement la surface transversale du xylisme. Dans les observations cryo-SEM, l'ajustement du temps pour le gel-gravure est nécessaire pour enlever la poussière de gel et d'accentuer le bord des parois cellulaires sur la surface d'observation. Nos résultats démontrent l'applicabilité des techniques cryo-SEM pour l'observation de la distribution d'eau dans le xylisme aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La combinaison de cryo-SEM avec des techniques d'observation in situ non destructive améliorera profondément l'exploration de la dynamique du débit d'eau des plantes ligneuses.

Des images représentatives des surfaces transversales du xylée d'arbre conifère et à feuilles larges, observées par cryo-SEM, sont montrées à la figure 2. Au faible grossissement, la zone noire des images indique les cavités d'où disparaît entièrement ou partiellement l'eau, et la zone grise indique les parois des cellules xylées, le cytoplasme et l'eau (Figure 2A). Au grossissement élevé, il est é...

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Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

L'observation de la distribution d'eau dans le xylisme fournit des informations significatives sur la dynamique du débit d'eau dans les plantes ligneuses. Dans cette étude, nous démontrons l'approche pratique pour observer la distribution d'eau de xylée in situ en utilisant un cryostat et cryo-SEM, qui élimine les changements artifactual dans l'état de l'eau pendant la préparation de l'échantillon.

La distribution d'eau de Xylem dans les usines ligneuses visualisée avec un microscope électronique cryo-scanné

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

L’objectif global de ce protocole est de nous fournir une résolution électromicroscopy de la distribution de l’eau dans divers types de cellules xylèmes in situ. Cette méthode a été utilisée pour observer l’eau dans le xylème afin de clarifier la distribution de l’eau et l’évolution des régimes arrosés, la variation saisonnière de la distribution de l’eau, l’effet des cycles de gel/dégel, la distribution de l’eau dans le bois humide et la cavitation induite par certaines contraintes biotiques. Le gel-fixation d’un tronc vivant sous de fortes tensions hydrauliques provoque parfois des cavitations artificielles, qui sont observées par cryo-SEM comme cristaux de glace rompus dans le lumen du conduit.Cette procédure mise à jour se concentre sur l’obtention de micrographes aérotomes de haute qualité de xylème sans l’artefact dans la procédure d’échantillonnage. Une démonstration viable est essentielle parce qu’il y a un certain nombre de détails importants qui ne peuvent pas être facilement expliqués. Dans le même temps, l’obtention d’une formation n’est pas facile parce que seuls quelques laboratoires à travers le monde pratiquent cette méthode.Pour commencer cette procédure, enfermer une branche et les feuilles pour l’échantillonnage avec un sac en plastique noir pour équilibrer le potentiel d’eau entre xylème et laisse plus de deux heures avant l’échantillonnage. À l’aide d’une chambre de pression, déterminer le potentiel arrosé d’au moins deux feuilles de l’échantillon. Lorsque le potentiel d’eau est supérieur à environ moins 0,5 mégapascal, un échantillon peut être prélevé après congélation.Lorsque le potentiel d’eau est inférieur à moins 0,5 mégapascals, procéder au traitement pour la relaxation. Fixer un collier étanche autour de la tige, qui sera rempli d’eau. À l’aide de cisailles d’élagage ou d’une scie, couper la tige sous la surface de l’eau et garder l’extrémité coupée de l’échantillon sous l’eau.Transférez l’échantillon dans un autre contenant d’eau le plus rapidement possible afin de minimiser l’exposition de l’extrémité coupée à l’air. Pour les espèces à feuilles larges, assurez-vous que la longueur de l’endroit où l’échantillon cryo de sem sera obtenu jusqu’au bord coupé de la tige récoltée est plus longue que la longueur maximale du navire de l’échantillon afin d’éviter les artefacts induits par la tension dans le crysoample. Ensuite, couvrez l’échantillon d’un sac en plastique noir pour réduire la transpiration.Gardez l’extrémité coupée de l’échantillon dans l’eau et maintenez cette condition pendant environ 30 minutes afin de détendre la tension xylème. Après cela, mesurer le potentiel d’eau à nouveau pour confirmer la relaxation de la tension xylème. Tout d’abord, utilisez des ciseaux ou un couteau utilitaire pour couper et ouvrir un côté d’un collier étanche à l’eau.Attachez le collier étroitement autour de la tige avec du ruban adhésif tout en tenant l’ouverture horizontalement. Mettez des gants isolants et tenez en toute sécurité le récipient d’azote liquide. Faire entrer l’azote liquide dans le col jusqu’à ce qu’il soit plein et le garder rempli en ajoutant régulièrement de l’azote liquide supplémentaire pour congeler complètement l’eau dans le xylème.Après un temps de congélation suffisant, détachez le collier de la partie gelée de la tige de l’échantillon afin d’éliminer l’azote liquide. Utilisez immédiatement une fine scie à main pour récolter l’échantillon. Couvrez ensuite l’échantillon congelé d’un morceau de papier d’aluminium ou remetez-le dans un tube d’échantillon.Placez rapidement l’échantillon récolté dans un récipient rempli d’azote liquide. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à effectuer l’observation. Pour commencer, réglez la température de la chambre de spécimen du cryostat à moins 30 degrés Celsius, qui est habituellement assez froid pour maintenir la sève xylème de la plupart des plantes dans un état gelé.Utilisez un couteau pointu ou une scie à dents fines pour couper l’échantillon en un petit morceau qui peut être ajusté pour le porte-spécimen d’un cryo-SEM. Montez la pièce taillée à un mandrin, un support pour un cryostat, avec un milieu d’intégration glaçant les tissus pour le cryo-sectionnement. Fixez le mandrin à un porte-spécimen d’une microtome du cryostat.Coupez la surface en rasant à plusieurs reprises les sections de cinq à sept micromètres d’épaisseur. Couper plus de 1000 à 2000 micromètres en profondeur totale à la surface initiale est utile pour elmininer la partie endommagée de l’échantillon causée par la précoupage. Après avoir grossièrement écrémé une surface de l’échantillon, ajustez une partie inutilisée de la lame de microtome au-dessus de la surface de l’échantillon.Élargir légèrement la distance entre la surface du spécimen et la lame. Et ne coupez la surface qu’une ou deux fois. Ensuite, faites glisser la lame à nouveau et placez une partie inutilisée de la lame sur la surface de l’échantillon.Répétez ce traitement de coupe trois à quatre fois pour obtenir une surface claire sans marques de couteau. Après la coupe finale, placez la position de la lame loin de l’échantillon pour empêcher la poussière de coller sur l’échantillon. Et détachez le mandrin de la microtome.Ensuite, fixez le spécimen à un porte-spécimen cryo-SEM avec un milieu d’intégration de congélation des tissus dans la chambre cryostatique. Tout d’abord, utilisez de l’azote liquide pour maintenir une température inférieure à moins 120 Degrés Celsius dans la chambre de spécimen cryo-SEM selon le manuel de l’utilisateur de l’équipement. Ensuite, placez le porte-spécimen avec le spécimen préparé dans un récipient isolant rempli d’azote liquide dans la chambre cryostatique.Utilisez un spécimen échangeant une tige pour tenir le porte-spécimen sous l’azote liquide. Transférer rapidement le porte-spécimen à la chambre de pré-évacuation de la chambre de spécimen cryo-SEM dès le début de l’évacuation de la chambre de pré-évacuation. Pour commencer, allumez la tension d’accélération du canon électrique.Ensuite, augmenter la température du stade de l’échantillon à moins 100 degrés Celsius. Attendez plusieurs minutes que la poussière de givre soit enlevée et que le niveau de surface de la glace dans les cellules xylème diminue légèrement par rapport aux parois cellulaires. Ensuite, abaissez la température du stade speiumen à moins 120 degrés Celsius.Dans cette étude, des méthodes d’observation cryo-SEM sont utilisées pour visualiser clairement la distribution de l’eau à l’échelle cellulaire. À faible grossissement, la zone noire des images indique les cavités d’où l’eau disparaît entièrement ou partiellement, tandis que la zone grise indique les parois cellulaires xylèmes, le cytoplasme et l’eau. Au grossissement élevé, il devient évident que l’eau n’est pas entièrement perdue du lumina de trois trachéides, ce qui indique l’apparition de bulles macro dans la sève xylème in situ.En ce qui concerne les espèces à larges lamentations, l’occurrence de cavitation est facilement détectée dans les navires, tandis que l’existence de l’eau est difficile à distinguer dans les fibres, en particulier à faible grossissement. Les cellules de cytoplasme et de parenchyme peuvent être distinguées de l’eau dans les trachées ou les vaisseaux par des textures de plan de glace. L’analyse de l’effet de la température sur le processus de gel-gravure révèle que la poussière de gel est graduellement sublimée, et les membranes de fosse endotracehid deviennent plus claires par la progression de la sublimation avec la température croissante.Les grosses particules de poussière de givre restantes peuvent être éliminées par d’autres eaux-froids. Mais cela peut être problématique car il diminue inutilement le niveau de surface de la glace dans les conduits xylèmes. La haute qualité de l’observation est largement obtenue grâce à une préparation précise des spécimens.Le lissage de la surface avec la lame tranchante du microtome est particulièrement important. Un lissage insuffisant par une lame usée peut parfois créer une surface rugueuse qui ressemble à des marques de couteau, ou peut créer de nombreuses occurrences de poussière à partir des coupures. Le gel d’échantillon sans la relaxation de la pression négative de colonne d’eau causera l’induction artifactual de la cavitation dans les conduits de xylème.Des cristaux de glace groupés sont observés dans des récipients de spécimens où l’échantillon n’a pas été relâché. En revanche, aucun cristaux de glace groupé n’est observé dans les échantillons détendus ayant un potentiel d’eau similaire. L’application de fixation du gel aux plantes vivantes transpirantes qui souffrent de sécheresse peut induire des artefacts fondés sur des résultats tels que des cristaux de glace groupés.Ces artefacts conduisent à des interprétations erronées de l’état de l’eau dans le conduit xylème. Il est donc important de confirmer d’abord le potentiel arrosé des échantillons avant la fixation du gel. Bien que cette procédure donne une image de l’état du conduit xylème, un arbre vivant doit être détruit pour l’observation.La combinaison d’autres méthodes d’observation non invasives telles que l’IRM ou le micro-CT avec l’observation de l’image au niveau subsidiaire approfondira notre compréhension de la nature entre le transport maritime et l’utilisation. L’observation de l’état de l’eau introduite par cet article fournira également une méthode pour clarifier la relation de l’eau qui est mélangée dans les cellules et d’autres réponses anatomiques au stress abiotique ou biotique. Cryo-SEM équipé d’une spectroscopie à rayons X dispersive d’énergie ou d’une carte SIM supérieure ont été utilisés pour étudier la distribution d’éléments à la surface d’un spécimen contenant de l’eau.La combinaison de l’analyse élémentaire et de cette procédure dans ce cadre similaire peut nous donner une connaissance approfondie du comportement des cellules xylèmes liés à l’état de l’eau. Lorsque vous utilisez de l’azote liquide pour congeler la fixation des échantillons dans une pièce, n’oubliez pas de ventiler la pièce pour éviter une carence en oxygène.

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