Name: xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00
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इस काम को जेएसपीएस केकेनही (नहीं) द्वारा समर्थित किया गया था। 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H20285

नोट: इस प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चार्ट चित्र 1में दिखाया गया है।
1. नमूना: Xylem Conduits के जल स्तंभ के भीतर तनाव विश्राम
नोट: निम्न तनाव छूट उपचार Xylem जल वितरण में ठंड और तनाव प्रेर?...

इस पत्र में शुरू की गई क्रायो-सेम अवलोकन विधियों को सेलुलर पैमाने पर जल वितरण को स्पष्ट रूप से विज़ुअलाइज़ करने के लिए व्यावहारिक है। इस विधि के माध्यम से, जाइलम के भीतर पानी के वितरण में परिवर्तन की खो?...

जल संसाधनों की उपलब्धता (अर्थात, वर्षा, मृदा जल की मात्रा) पौधों की प्रजातियों की मृत्यु दर और भौगोलिक वितरण को कड़ाई से निर्धारित करती है, क्योंकि उन्हें मिट्टी से जल को अवशोषित करने और प्रकाश संश्लेषी उत्पादन के लिए पत्तियों तक ले जाने की आवश्यकता होती है। पौधों को अस्थिर पानी की आपूर्ति के तहत अपनी जल परिवहन प्रणाली को बनाए रखना चाहिए। विशेष रूप से, वुडी पौधों transpiration धाराओं के साथ उनके नाली में उच्च तनाव उत्पन्न के रूप में, कुछ मामलों में, वे जमीन से अधिक 100 मीटर से अधिक अपने मुकुट पकड़ की जरूरत है. इस तरह के उच्च नकारात्मक दबाव के तहत पानी के कॉलम को बनाए रखने के लिए, जाइलम conduits कठोर और हाइड्रोफोबिक-लिग्नीकृत सेल दीवारों1के साथ ट्यूबलर कोशिकाओं के एक निरंतरता से मिलकर बनता है। प्रत्येक प्रजाति में जाइलम कंसित्स के जाइलम रोग की भेद्यता अस्थिर जल आपूर्ति2के अंतर्गत प्रजातियों के जीवित रहने का एक अच्छा निर्धारक है . इसके अलावा, जाइलम नाली की पानी की स्थिति का अध्ययन अजैविक या जैविक तनाव के अधीन व्यक्तिगत पेड़ों के स्वास्थ्य की स्थिति के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है। मापने रस प्रवाह या पानी की क्षमता जाइलम नाली के एकीकृत हाइड्रोलिक समारोह के कारण एक वुडी संयंत्र के पानी की स्थिति का अनुमान प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, जाइलम कोशिकाओं में पानी के वितरण visualizing जाइलम हाइड्रोलिक प्रणाली के व्यक्तिगत घटकों की स्थिति स्पष्ट कर सकते हैं.
जाइलम नाली के जल की स्थिति को विज़ुअलाइज़ करने के लिए अनेक तकनीकेंमौजूद हैं 3. वुडी ऊतक में जल पथों को देखने के लिए शास्त्रीय और उपयोगी विधियों में कटी हुई शाखाओं के सिरोंको डाई में डुबोकर या खड़े पेड़ में डाई का इंजेक्शन लगाकर जल स्तंभ को धुंधला करना शामिल है . नरम एक्स-रे फोटोग्राफी भी जाइलम5,6में नमी के अंतर एक्स-रे अवशोषण तीव्रता के कारण कटा हुआ लकड़ी डिस्क के पानी के वितरण के दृश्य की अनुमति देता है। इन तरीकों, तथापि, केवल पानी आंदोलन की पटरियों प्रदान करते हैं या पानी के स्थूल वितरण का प्रदर्शन. हाल ही में, इस तरह के माइक्रो फोकस एक्स-रे गणना टोमोग्राफी के रूप में गैर विनाशकारी अवलोकन तकनीक,7,8,9,10और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)11, 12, बरकरार पौधों के भीतर जाइलम नाली में पानी के अवलोकन की अनुमति देने के लिए काफी सुधार किया गया है। इन गैर विनाशकारी तरीकों में महान लाभ है कि हम कृत्रिम काटने के प्रभाव के बिना जाइलम पानी की स्थिति का निरीक्षण कर सकते हैं, और हम अनुक्रमिक इमेजिंग द्वारा पानी के प्रवाह गतिशीलता ट्रैक या एक विपरीत एजेंट शुरू कर सकते हैं10. हालांकि, हम संयंत्र इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित एमआरआई या synchron आधारित जेडसीटी के लिए एक विशेष सुविधा का उपयोग करने के लिए छवियों जो सेलुलर स्तर पानी की सामग्री की पहचान कर सकते हैं प्राप्त करने की जरूरत है. इसके अलावा, हालांकि synchron आधारित जेडसीटी प्रणाली उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ठीक छवियों को प्राप्त करने के लिए सक्षम है, जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी के बराबर है7,8,9, जीवित कोशिकाओं द्वारा घायल हो सकता है उच्च ऊर्जा एक्स-रे13,14का विकिरण । एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप जिसमें क्रायो-इकाइयों स्थापित कर रहे हैं रोजगार (cryo-SEM) ठीक एक सेलुलर स्तर पर जाइलम में पानी का पता लगाने के लिए एक बहुत ही उपयोगी तरीका है, हालांकि यह विनाशकारी अवलोकन के लिए नमूना कटाई की आवश्यकता है. जाइलम नाली में पानी को ठीक करने के लिए, तनों का एक हिस्सा (अर्थात, टहनियाँ, शाखाएंया तनों) को तरल नाइट्रोजन (एलएन 2) द्वारा सीटू में जमकर रखना पड़ता है। क्रायो-सेम द्वारा छंटनी की गई, जमे हुए नमूनों की सतह के प्रेक्षण जाइलम संरचना के उच्च-उत्रूपित प्रतिबिंब प्रदान करते हैं जहां से हम जाइलम नाली में जल को बर्फ के रूप में पहचान सकते हैं। इस विधि का एक महत्वपूर्ण सीमा है कि एक ही नमूने के भीतर पानी movability के अनुक्रमिक अवलोकन असंभव है. हालांकि, एक क्षेत्र में रहने वाले पेड़ों की अनुक्रमिक अवलोकन के लिए जेडसीटी या एमआरआई का उपयोग बेहद चुनौतीपूर्ण है क्योंकि ये उपकरण पोर्टेबल नहीं हैं। इसके विपरीत, क्रायो-एसईएम क्षेत्र प्रयोगों में बड़े पेड़ों पर इस तकनीक का उपयोग करने के लिए एक क्षमता है स्पष्ट रूप से न केवल सेलुलर स्तर पर पानी की सामग्री कल्पना लेकिन यह भी एक बेहतर संरचना स्तर पर, उदाहरण के लिए, intervascular गड्ढे में पानी15, पानी में अंतरकोशिकीय स्थान16, या जल स्तंभ17में बुलबुले .
क्रायो-सेम द्वारा जाइलम जल को देखने वाले अनेक अध्ययनों में 5,12,18,19,20,21,23की सूचना दी गई है . Utsumi एट अल (1996) शुरू में स्टेम21पर सेट एक कंटेनर में LN2 भरने के माध्यम से एक जीवित ट्रंक के फ्रीज-फिक्सेशन द्वारा सीटू में जाइलम के अवलोकन के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की। नमूना संग्रह के दौरान और जाइलम नाली के भीतर बर्फ पिघलने से बचने के लिए क्रायो-सेम तैयारी के दौरान नमूना का तापमान -20 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखा गया था। इस विधि का उपयोग जाइलम में जल का निरीक्षण करने के लिए किया गया है ताकि बदलते जल शासन11,12,24,25,26के अंतर्गत जल वितरण को स्पष्ट किया जा सके, 27,28, जल वितरण की मौसमी भिन्नता21,29,30, फ्रीज-थॉ व चक्र17,31, 32, गीली लकड़ीमेंजल का वितरण 5 , सैपवुड से हार्टवुड20में संक्रमण के दौरान जल वितरण में परिवर्तन , कैम्बियल गतिविधि का मौसमी समय पाठ्यक्रम और जहाजों का विभेद33, और कुछ जीवीय तनाव23,34द्वारा प्रेरित गुहिकायन . द्रवीय चालकता और गुहिकाभों की भेद्यता का सत्यापन क्रायो-सेम35,36से किया गया है। क्रायो-सेम ऊर्जा प्रसारक एक्स-रे स्पेक्ट्रोमेट्री (EDX या EDS) से लैस पानी37युक्त एक नमूना की सतह पर तत्व वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
एक जीवित ट्रंक का फ्रीज-फिक्सेशन जिसमें उच्च हाइड्रोलिक तनाव होता है, कभी-कभी कृत्रिम कैविटेशन का कारण बनता है जो क्रायो-सेम द्वारा नाली38,39के लुमेन में खंडित बर्फ क्रिस्टल के रूप में मनाया जाता है। विशेष रूप से, लंबे समय तक और व्यापक नाली वाली व्यापक प्रजातियां तनाव-प्रेरित कलाकृतियों की चपेट में होती हैं, जैसे नमूना काटने के कारण गुहिकायन, भले ही पानी3,40 केनीचे आयोजित की जाती हों। Cavitation कलाकृतियों एक traspiring पेड़ के नमूने के बाद स्पष्ट हो (यानी, दिन के समय के दौरान नमूना) या गंभीर सूखे की स्थिति में और वे गुहिकायन घटना3,38के एक overestimation को गुमराह कर सकते हैं, 39. इसलिए , नाली में काम करने वाले तनाव को जारी करना होगा ताकि कृत्रिम गुहिकायन3,12,39से बचा जा सके .
एक नमूना कक्ष में स्थापित चाकू का उपयोग फ्रीज फ्रैक्चर तकनीक अक्सर cryo-SEM अवलोकन के लिए नमूना सतह का पर्दाफाश करने के लिए कार्यरत है। तथापि, वुडी पादप के ऊतकों के फ्रीज-फ्रैक्टेड विमानों, विशेष रूप से द्वितीयक जाइलम के अनुप्रस्थ खंड, ऊतक6में शारीरिक विशेषताओं और जल को स्पष्ट रूप से देखने के लिए बहुत अधिक कठिन होते हैं। किसी नमूने को ट्रिम करने के लिए क्रायोस्टैट का प्रयोग नमूना सतहों की तीव्र और उच्च गुणवत्ता वाली तैयारीकीअनुमति देता है 20,23. इस विधि का समग्र लक्ष्य नमूना कलाकृतियों की घटना के बिना सीटू में जाइलम कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार में जल वितरण के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संकल्प के साथ सबूत प्रदान कर रहा है। हम अपनी अद्यतन प्रक्रिया है, जो तेजी से सुधार किया गया है के बाद से हम पहली बार इसे अपनाया, नमूना के बारे में, trimming और जाइलम के cryo-निश्चित नमूने के उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन micrographs प्राप्त करने के लिए नमूना सतह की सफाई.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:249px;">coating material</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">Gold wire, 0.50 &#215; 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499&#160;</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:249px;">cryo scanning electron microscope</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:48px;width:249px;">cryostat</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">CryoStar NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">microtome blade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">tissue freezing embedding medium</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope

एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप स्थापित क्रायो-इकाई (cryo-SEM) subzero तापमान पर नमूना अवलोकन की अनुमति देता है और तरल नाइट्रोजन का उपयोग फ्रीज निर्धारण तकनीकों के साथ संयोजन में संयंत्र के ऊतकों में पानी के वितरण की खोज के लिए इस्तेमाल किया गया है (LN 2) वुडी प्रजातियों के लिए, तथापि, जाइलम अनुप्रस्थ सतह को देखने के लिए तैयारी लकड़ी फाइबर के उन्मुखीकरण के कारण कुछ कठिनाइयों को शामिल. इसके अतिरिक्त, जाइलम conduits में पानी स्तंभ में उच्च तनाव कभी कभी पानी वितरण में artifactual परिवर्तन पैदा कर सकता है, विशेष रूप से नमूना निर्धारण और संग्रह के दौरान. इस अध्ययन में, हम एक क्रायओस्टैट और क्रायो-सेम का उपयोग करके सीटू में वुडी पौधों के जाइलम के भीतर जल वितरण का निरीक्षण करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया प्रदर्शित करते हैं। सबसे पहले, नमूना संग्रह के दौरान, जाइलम पानी की क्षमता को मापने के लिए निर्धारित करना चाहिए कि उच्च तनाव xylem नाली में मौजूद है. जब जाइलम जल क्षमता कम होती है (और का. ]0.5 एम.पी.ए.), नमूना फ्रीज निर्धारण के दौरान जाइलम नाली में जल की स्थिति के बेहतर संरक्षण को सुविधाजनक बनाने के लिए तनाव विश्राम प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। इसके बाद, एक watertight कॉलर पेड़ स्टेम के आसपास जुड़ा हुआ है और xylem के पानी की स्थिति के फ्रीज निर्धारण के लिए LN2 से भरा है. कटाई के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि अवलोकन के लिए नमूना तैयारी की प्रक्रियाओं को पूरा करते समय नमूना को संरक्षित किया जाता है। एक cryostat स्पष्ट रूप से जाइलम अनुप्रस्थ-कट सतह का पर्दाफाश करने के लिए कार्यरत है। क्रायो-एसईएम टिप्पणियों में, फ्रोज़न-इचिंग के लिए समय समायोजन को ठंढ धूल को हटाने और देखने की सतह पर सेल दीवारों के किनारे को बढ़ाने के लिए आवश्यक है। हमारे परिणाम सेलुलर और subcellular स्तर पर जाइलम के भीतर जल वितरण के अवलोकन के लिए क्रायो-SEM तकनीकों की प्रयोज्यता का प्रदर्शन. गैर विनाशकारी के साथ क्रायो-SEM के संयोजन situ अवलोकन तकनीकों में गहराई से वुडी संयंत्र पानी के प्रवाह गतिशीलता के अन्वेषण में सुधार होगा.

क्रायो-सेम द्वारा देखे गए शंकुधारी और विस्तृत वृक्ष जाइलम के अनुप्रस्थ-कट सतहों के प्रतिनिधि चित्र चित्र 2में दर्शाए गए हैं। कम आवर्धन पर, छवियों में काला क्षेत्र गुहाओं को इंग?...

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Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

जाइलम के भीतर जल वितरण को देखने से वुडी पौधों में जल प्रवाह गतिशीलता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी मिलती है। इस अध्ययन में, हम एक cryostat और क्रायो-SEM, जो नमूना तैयार करने के दौरान पानी की स्थिति में artifactual परिवर्तन समाप्त का उपयोग करके situ में xylem जल वितरण का निरीक्षण करने के लिए व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं.

वुडी पौधों में Xylem जल वितरण एक Cryo-स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Research

JoVE Journal

Environment

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