Name: xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00
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Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI (N. . 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

NOTA: un grafico schematico di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.
1. Campionamento: Rilassamento della tensione all'interno della colonna d'acqua dei condotti Xylem
NOTA: Il seguente trattamento di rilassamento della tensione è raccomandato prima dell'applicazione LN2 per evitare sia il congelamento che gli artefatti indotti dalla tensione nella distribuzione dell'acqua xylem.
<ol><li>Racchiudere un ramo e le ...

I metodi di osservazione crio-SEM introdotti in questo documento sono pratici per visualizzare chiaramente la distribuzione dell'acqua su scala cellulare. Attraverso questo metodo, esplorare i cambiamenti nella distribuzione dell'acqua all'interno di xylem può potenzialmente aiutare a chiarire il meccanismo di tolleranza delle specie arboree allo stress abiotico (carenza di acqua o congelamento) o allo stress biotico (malattia degli alberi).
Il passo più importante in questo metodo è preser...

La disponibilità di risorse idriche (ad esempio, precipitazioni, contenuto di acqua del suolo) determina rigorosamente la mortalità e la distribuzione geografica delle specie vegetali, poiché devono assorbire l'acqua dal suolo e trasportarla alle foglie per la produzione fotosintetica. Gli impianti devono mantenere il loro sistema di trasporto idrico sotto l'approvvigionamento idrico fluttuante. In particolare, le piante legnose generano alte tensioni nei loro condotti lungo i corsi d'acqua di traspirazione in quanto, in alcuni casi, hanno bisogno di tenere la corona a più di 100 m da terra. Per mantenere le colonne d'acqua sotto una pressione negativa così elevata, i condotti xylem consistono in un continuum di cellule tubolari con pareti cellulari rigide e lofobiche-lignifiche1. La vulnerabilità alla disfunzione xylem dei condotti xylem in ogni specie è un buon determinante della sopravvivenza delle specie sotto l'approvvigionamento idrico fluttuante2. Inoltre, lo studio dello stato dell'acqua dei condotti xylem è importante per la valutazione delle condizioni di salute dei singoli alberi sottoposti a stress abiotico o biotico. La misurazione del flusso di linfa o del potenziale idrico può fornire stime dello stato dell'acqua di un impianto legnoso a causa della funzione idraulica integrata dei condotti xylem. Inoltre, la visualizzazione della distribuzione dell'acqua nelle cellule xiliere può chiarire la condizione dei singoli componenti del sistema idraulico xylem.
Diverse tecniche per visualizzare lo stato dell'acqua dei condotti xylem esistono3. I metodi classici e utili per osservare le vie dell'acqua nel tessuto legnoso comportano la colorazione della colonna d'acqua immergendo le estremità dei rami tagliati in un colorante o iniettando un colorante nei gambi degli alberi in piedi4. La fotografia a raggi X morbida consente anche la visualizzazione della distribuzione dell'acqua dei dischi di legno a fette a causa dell'intensità differenziale di assorbimento dei raggi X dell'umidità nello xilarem5,6. Questi metodi, tuttavia, forniscono solo tracce di movimento dell'acqua o dimostrano distribuzioni macroscopiche di acqua. Recentemente, tecniche di osservazione non distruttiva, come la tomografia computerizzata a raggi X micro-fuoco (CT)7,8,9,10e la risonanza magnetica (RM)11, 12, sono stati notevolmente migliorati per consentire l'osservazione dell'acqua nei condotti xylem all'interno di alberelli intatti. Questi metodi non distruttivi hanno grandi vantaggi in quanto possiamo osservare lo stato dell'acqua dello xylem senza effetti di taglio artificiale, e possiamo monitorare le dinamiche del flusso d'acqua mediante imaging sequenziale o introducendo un agente di contrasto10. Tuttavia, dobbiamo utilizzare una risonanza magnetica personalizzata per l'imaging delle piante o un impianto specializzato per la TC a base di sincrotrone al fine di ottenere le immagini in grado di identificare il contenuto di acqua a livello cellulare. Inoltre, anche se il sistema CT basato sul sincrotrone ha permesso di ottenere immagini pregiate ad alta risoluzione spaziale, che è paragonabile alla microscopia leggera7,8,9, le cellule viventi possono essere ferite radiazione di raggi X ad alta energia13,14. L'impiego di un microscopio elettronico a scansione in cui sono installate crio-unità (crio-SEM) è un metodo molto utile per localizzare con precisione l'acqua nello xilem a livello cellulare, anche se questo richiede la raccolta distruttiva del campione per l'osservazione. Per fissare l'acqua nei condotti xylem, una parte dei gambi (ad esempio, ramoscelli, rami o steli) viene congelata in situ con azoto liquido (LN2). Le osservazioni della superficie degli esemplari rifilati e congelati da crio-SEM forniscono immagini altamente ingrandite della struttura xylem da cui possiamo identificare l'acqua nei condotti xylem come ghiaccio. Una limitazione significativa di questo metodo è che l'osservazione sequenziale della movabilità dell'acqua all'interno dello stesso campione è impossibile. Tuttavia, l'applicazione di CT o RM per l'osservazione sequenziale di alberi che vivono in un campo è estremamente impegnativa perché questi strumenti non sono portatili. Al contrario, il crio-SEM ha il potenziale per utilizzare questa tecnica su grandi alberi negli esperimenti sul campo per visualizzare chiaramente il contenuto dell'acqua non solo a livello cellulare, ma anche a un livello di struttura più fine, ad esempio acqua nei pozzi intervascolari15, acqua in spazi intercellulari16, o bolle nella colonna d'acqua17.
Molti studi che osservano l'acqua xilem da crio-SEM sono stati segnalati 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) inizialmente stabilì il protocollo per l'osservazione dello xylem in situ con gelata di un tronco vivente tramite il riempimento di LN2 in un contenitore impostato sul gambo21. La temperatura del campione è stata mantenuta al di sotto dei -20 gradi centigradi durante la raccolta del campione e durante la preparazione crio-SEM al fine di evitare lo scioglimento del ghiaccio all'interno dei condotti xylem. Questo metodo è stato utilizzato per osservare l'acqua nello xilem al fine di chiarire la distribuzione dell'acqua in condizionando il regime idrico11,12,24,25,26, 27,28, la variazione stagionale della distribuzione dell'acqua21,29,30, l'effetto dei cicli di congelamento-scongelamento17,31, 32, la distribuzione dell'acqua nel legno bagnato5, cambiamenti nella distribuzione dell'acqua durante il passaggio da sapwood a heartwood20, corso di tempo stagionale di attività cambiale e differenziazione dei vasi33, e cavitazione indotta da alcuni stress biotici23,34. Anche la conduttività idraulica e la vulnerabilità dei condotti alla cavitazione sono stati verificati utilizzando crio-SEM35,36. Cryo-SEM dotato di spettrometria a raggi X di dispersione energetica (EDX o EDS) è stato utilizzato per studiare la distribuzione degli elementi sulla superficie di un campione contenente acqua37.
Fissazione del congelamento di un tronco vivente che contiene condotti sotto alta tensione idraulica a volte provoca cavitazioni artificiali che vengono osservate dal crio-SEM come cristalli di ghiaccio fratturati nel lume dei condotti38,39. In particolare, le specie a foglia larga con condotti più lunghi e larghi sono vulnerabili a manufatti indotti dalla tensione, come la cavitazione causata dal taglio del campione, anche se condotta sott'acqua3,40. I manufatti di cavitazione diventano evidenti dopo il campionamento di un albero traspirante (cioè il campionamento durante il giorno) o in condizioni di siccità gravi e possono indurre in errore a soprastare l'occorrenza della cavitazione3,38, 39. Pertanto, la tensione di lavoro nei condotti deve essere liberata per evitare la cavitazione artifactualiva3,12,39.
La tecnica di congelazione con un coltello installato in una camera di campioni è spesso impiegata per esporre la superficie del campione per l'osservazione crio-SEM. Tuttavia, i piani congelato di tessuti vegetali legnosi, in particolare sezioni trasversali di xylem secondari, sono troppo ruvidi per osservare chiaramente le caratteristiche anatomiche e l'acqua nel tessuto6. L'applicazione di un criostato per il taglio di un campione consente una preparazione rapida e di alta qualità delle superfici campione20,23. L'obiettivo generale di questo metodo è fornire prove con la risoluzione della microscopia elettronica della distribuzione dell'acqua in vari tipi di cellule xilime in situ senza la comparsa di artefatti di campionamento. Introduciamo la nostra procedura aggiornata, che è stata costantemente migliorata da quando l'abbiamo adottata per la prima volta, per quanto riguarda il campionamento, il taglio e la pulizia della superficie del campione per ottenere micrografie elettroniche di alta qualità di campioni crio-fissi di xilema.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:249px;">coating material</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">Gold wire, 0.50 &#215; 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499&#160;</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:249px;">cryo scanning electron microscope</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:48px;width:249px;">cryostat</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">CryoStar NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">microtome blade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">tissue freezing embedding medium</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope

Un microscopio elettronico a scansione installato crio-unità (crio-SEM) consente l'osservazione dei campioni a temperature sotto zero ed è stato utilizzato per esplorare la distribuzione dell'acqua nei tessuti delle piante in combinazione con tecniche di fissazione del congelamento utilizzando azoto liquido (LN 2). Per le specie legnose, tuttavia, i preparativi per l'osservazione della superficie trasversale dello xilema comportano alcune difficoltà dovute all'orientamento delle fibre di legno. Inoltre, una maggiore tensione nella colonna d'acqua nei condotti xylem può occasionalmente causare cambiamenti artifactuali nella distribuzione dell'acqua, soprattutto durante la fissazione e la raccolta dei campioni. In questo studio, dimostriamo una procedura efficace per osservare la distribuzione dell'acqua all'interno dello xylem delle piante legnose in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM. In un primo momento, durante la raccolta del campione, misurare il potenziale dell'acqua xylem dovrebbe determinare se è presente un'alta tensione nei condotti xylem. Quando il potenziale dell'acqua xylem è basso (< ca. 0,5 MPa), è necessaria una procedura di rilassamento della tensione per facilitare una migliore conservazione dello stato dell'acqua nei condotti xylem durante la fissazione del congelamento del campione. Successivamente, un collare a tenuta stagna è attaccato intorno al gambo dell'albero e riempito con LN2 per la fissazione del congelamento dello stato dell'acqua di xylem. Dopo la raccolta, occorre fare attenzione a garantire che il campione sia conservato mentre si completano le procedure di preparazione del campione per l'osservazione. Un criostato viene impiegato per esporre chiaramente la superficie xylem taglio trasversale. Nelle osservazioni crio-SEM, è necessaria la regolazione del tempo per il congelamento per rimuovere la polvere di gelo e accentuare il bordo delle pareti cellulari sulla superficie di visualizzazione. I nostri risultati dimostrano l'applicabilità delle tecniche crio-SEM per l'osservazione della distribuzione dell'acqua all'interno di xylem a livello cellulare e subcellulare. La combinazione di crio-SEM con tecniche di osservazione in situ non distruttive migliorerà profondamente l'esplorazione delle dinamiche del flusso idrico delle piante legnose.

Immagini rappresentative di superfici trasversali di xylem di conifere e a foglia larga, osservate dal crio-SEM, sono mostrate nella Figura 2. A basso ingrandimento, l'area nera nelle immagini indica le cavità da cui l'acqua scompare interamente o parzialmente e l'area grigia indica pareti di cellule xylem, citoplasma e acqua (Figura 2A). Ad alto ingrandimento, è evidente che l'acqua non è completamente persa ...

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Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Osservare la distribuzione dell'acqua all'interno dello xilema fornisce informazioni significative per quanto riguarda la dinamica del flusso d'acqua nelle piante legnose. In questo studio, dimostriamo l'approccio pratico per osservare la distribuzione dell'acqua xylem in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM, che elimina i cambiamenti artifactuali nello stato dell'acqua durante la preparazione del campione.

Distribuzione dell'acqua Xylem nelle piante legnose con un microscopio elettronico a scansione crio-scansione

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornirci una risoluzione elettromicroscopia della distribuzione dell'acqua in vari tipi di cellule xilem in situ. Questo metodo è stato utilizzato per osservare l'acqua in xilelem al fine di chiarire la distribuzione dell'acqua e i regimi idrici mutevoli, la variazione stagionale della distribuzione dell'acqua, l'effetto dei cicli di congelamento /disgelo, la distribuzione dell'acqua nel legno umido e la cavitazione indotta da alcune sollecitazioni biotiche. Il congelamento-fissazione di un tronco vivente sotto alte tensioni idrauliche a volte causa cavitazioni artificiali, che sono osservate dal crio-SEM come cristalli di ghiaccio rotto nel lume del condotto.Questa procedura aggiornata si concentra sull'ottenimento di micrografie aerotome di alta qualità di xilem senza l'artefatto nella procedura di campionamento. Una dimostrazione praticabile è fondamentale perché ci sono una serie di dettagli importanti che non possono essere facilmente spiegati. Allo stesso tempo, ottenere una formazione non è facile perché solo pochi laboratori in tutto il mondo praticano questo metodo.Per iniziare questa procedura, racchiudere un ramo e lascia per il campionamento con un sacchetto di plastica nero per equilibrare il potenziale idrico tra xilem e lascia più di due ore prima del campionamento. Utilizzando una camera di pressione, determinare il potenziale idrico di almeno due foglie dal campione. Quando il potenziale idrico è superiore a circa meno 0,5 megapascal, un campione può essere raccolto dopo il congelamento.Quando il potenziale idrico è inferiore a meno 0,5 megapascal, procedere con il trattamento per il rilassamento. Fissare un collare a tenuta stagna attorno al gambo, che sarà riempito d'acqua. Utilizzando cesoie da potatura o una sega, tagliare lo stelo sotto la superficie dell'acqua e mantenere l'estremità tagliata del campione sott'acqua.Trasferire il campione in un altro contenitore d'acqua il più rapidamente possibile per ridurre al minimo l'esposizione dell'estremità tagliata all'aria. Per le specie a lati largo, assicurarsi che la lunghezza dal punto in cui il campione di crio per SEM sarà ottenuto sul bordo tagliato dello stelo raccolto sia più lunga della lunghezza massima del recipiente del campione al fine di prevenire artefatti indotti dalla tensione all'interno del crisoample. Quindi, coprire il campione con un sacchetto di plastica nero per ridurre la traspirazione.Mantenere l'estremità di taglio del campione nell'acqua e mantenere questa condizione per circa 30 minuti al fine di rilassare la tensione dello xilema. Successivamente, misurare nuovamente il potenziale idrico per confermare il rilassamento della tensione xilem. In primo luogo, utilizzare forbici o un coltello da utilità per tagliare e aprire un lato di un colletto a tenuta d'acqua.Attaccare saldamente il collare attorno allo stelo con nastro adesivo tenendo l'apertura orizzontalmente. Indossare guanti isolanti e tenere in sicurezza il vaso di azoto liquido. Far funzionare azoto liquido nel collare fino a quando non è pieno e tenerlo riempito aggiungendo costantemente azoto liquido aggiuntivo per congelare completamente l'acqua nello xilem.Dopo un tempo di congelamento sufficiente, staccare il collare dalla porzione congelata dello stelo del campione per rimuovere l'azoto liquido. Utilizzare immediatamente una sega a mano fine per raccogliere il campione. Quindi coprire il campione congelato con un pezzo di foglio di alluminio o rimetterlo in un tubo campione.Posizionare rapidamente il campione raccolto in un contenitore pieno di azoto liquido. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per eseguire l'osservazione. Per iniziare, impostare la temperatura della camera campione del criostato a meno 30 gradi Celsius, che di solito è abbastanza fredda da mantenere la linfa xilem della maggior parte delle piante in uno stato congelato.Utilizzare un coltello affilato o una sega a denti fini per tagliare il campione in un piccolo pezzo che può essere regolato per il supporto del campione di un crio-SEM. Montare il pezzo tagliato su un mandrino, un supporto per un criostato, con mezzo di incorporamento con congelamento dei tessuti per la criosezione. Attaccare il mandrino a un portapenne di un microtomo del criostato.Tagliare la superficie radendo ripetutamente sezioni spesse da cinque a sette micrometri. Tagliare più di 1.000-2.000 micrometri in profondità totale alla superficie iniziale è utile per elmininare la porzione danneggiata del campione causata dal pre-taglio. Dopo aver tagliato approssimativamente una superficie del campione, regolare una porzione inutilizzata della lama del microtomo sopra la superficie del campione.Allargare leggermente la distanza tra la superficie del campione e la lama. E tagliare la superficie solo una o due volte. Quindi, far scorrere di nuovo la lama e posizionare una porzione inutilizzata della lama sulla superficie del campione.Ripetere questa lavorazione di taglio da tre a quattro volte per ottenere una superficie chiara senza segni di coltello. Dopo il taglio finale, impostare la posizione della lama lontano dal campione per evitare che la polvere si attacchi al campione. E stacca il mandrino dal microtomo.Successivamente, attaccare il campione a un supporto per campioni crio-SEM con mezzo di incorporamento con congelamento dei tessuti nella camera criostatica. In primo luogo, utilizzare azoto liquido per mantenere una temperatura inferiore a meno 120 Celsius nella camera del campione crio-SEM secondo il manuale dell'utente dell'apparecchiatura. Quindi, posizionare il supporto del campione con il campione preparato in un contenitore isolante riempito con azoto liquido nella camera criostatica.Utilizzare un campione che scambia l'asta per tenere il portamine sotto l'azoto liquido. Trasferire rapidamente il supporto del campione nella camera di pre-evacuazione della camera del campione crio-SEM non appena inizia l'evacuazione della camera di pre-evacuazione. Per iniziare, accendere la tensione di accelerazione della pistola elettrica.Quindi, aumentare la temperatura dello stadio del campione a meno 100 gradi Celsius. Attendere alcuni minuti per rimuovere la polvere di gelo e per ridurre leggermente il livello superficiale del ghiaccio nelle cellule xileche rispetto alle pareti cellulari. Quindi, abbassare la temperatura dello stadio speiumen a meno 120 gradi Celsius.In questo studio, i metodi di osservazione crio-SEM sono usati per visualizzare chiaramente la distribuzione dell'acqua su scala cellulare. A basso ingrandimento, l'area nera nelle immagini indica le cavità da cui l'acqua scompare completamente o parzialmente, mentre l'area grigia indica pareti cellulari xilem, citoplasma e acqua. Ad alto ingrandimento, diventa evidente che l'acqua non è completamente persa dall'apparecchio di tre tracheidi, indicando il verificarsi di macro bolle nella linfa xilem in situ.Per quanto riguarda le specie a lati, l'occorrenza della cavitazione è facilmente individuabile all'interno dei vasi, mentre l'esistenza dell'acqua è difficile da distinguere all'interno delle fibre, specialmente a basso ingrandimento. Le cellule di citoplasma e parenchima possono essere distinte dall'acqua all'interno di tracheidi o vasi attraverso trame del piano di ghiaccio. L'analisi dell'effetto della temperatura sul processo di incisione del congelamento rivela che la polvere di gelo viene gradualmente sublimato e le membrane a fossa endotracehid diventano più chiare attraverso la progressione della sublimazione con l'aumento della temperatura.Le particelle di polvere di gelo di grandi dimensioni rimanenti possono essere eliminate con un'ulteriore incisione del congelamento. Ma questo può essere problematico in quanto diminuisce inutilmente il livello superficiale del ghiaccio nei condotti xylem. L'alta qualità dell'osservazione si ottiene in gran parte attraverso un'accurata preparazione del campione.La levigatura della superficie con la lama affilata del microtomo è particolarmente importante. L'insufficiente levigatura da parte di una lama usata a volte può creare una superficie ruvida simile ai segni del coltello o può creare numerose occorrenze di polvere dai tagli. Il congelamento del campione senza il rilassamento della pressione negativa della colonna d'acqua causerà l'induzione artefatta della cavitazione nei condotti xilem.Cristalli di ghiaccio raggruppati si osservano in vasi di esemplari in cui il campione non è stato rilassato. Al contrario, non si osservano cristalli di ghiaccio raggruppati nei campioni rilassati con un potenziale idrico simile. L'applicazione della fissazione del congelamento alle piante viventi traspiranti che soffrono di siccità può indurre manufatti a base di risultati come cristalli di ghiaccio raggruppati.Questi artefatti portano a interpretazioni errate dello stato dell'acqua nel condotto xilem. Quindi è importante prima confermare il potenziale idrico dei campioni prima della fissazione del congelamento. Sebbene questa procedura fornisca un'immagine di quale stato nel condotto xilem, un albero vivente deve essere distrutto per l'osservazione.La combinazione di altri metodi di osservazione non invasivi come la risonanza prima o la micro-TC con l'osservazione delle immagini a livello sussidiario approfondirà la nostra comprensione della natura tra trasporto e utilizzo dell'acqua. L'osservazione dello stato dell'acqua introdotta da questo documento fornirà anche un metodo per chiarire la relazione dell'acqua che viene mescolata nelle cellule e altre risposte anatomiche allo stress abiotico o biotico. Cryo-SEM equipaggiato con spettroscopia a raggi X dispersiva di energia o sim superiore sono stati utilizzati per studiare la distribuzione degli elementi sulla superficie di un campione contenente acqua.Combinare l'analisi elementale e questa procedura in quel frame simile può darci una profonda conoscenza del comportamento delle cellule xilem legate allo stato dell'acqua. Quando si utilizza azoto liquido per il congelamento-fissazione dei campioni in una stanza, non dimenticare di ventilare la stanza per evitare carenza di ossigeno.

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