Name: xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00
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この作品は、JSPSカケンヒ(いいえ) 20120009、20120010、19780129、25292110、23780190、23248022、15H02450、16H04936、16H04948、17H03825、1822)

注: このプロトコルの概略図を図 1に示します。
1. サンプリング:キシレム導管の水柱内の緊張緩和
注:Xylem水配分における凍結および張力誘発アーティファクトの両方を避けるために、LN2アプリケーションの前に次の張力緩和治療が推奨されます。
<ol><li>黒いビニール袋でサンプリング用の枝と葉を囲み、キシレムと葉...

本論文で紹介したクライオSEM観測法は、細胞規模での水分布を明確に可視化するために実用的である。この方法を通じて、キシレム内の水の分布の変化を調べた場合、生物ストレス(水不足または凍結)や生物学的ストレス(樹木病)に対する樹種耐性のメカニズムを明らかにするのに役立つ可能性がある。
この方法で最も重要なステップは、サンプル収集およびその後のサ?...

水資源(沈殿、土壌水分含有量)の利用可能性は、土壌から水を吸収し、光合成生産のために葉に輸送する必要があるため、植物種の死亡率と地理的分布を厳密に決定します。植物は、変動する水供給の下で水輸送システムを維持する必要があります。特に、木質植物は、場合によっては、地上100m以上のクラウンを保持する必要があるため、蒸散流れに沿って導管に高い張力を発生させます。このような高い負圧下で水柱を維持するために、キシレム導管は、硬直および疎水性細胞壁1を有する管状細胞の連続体からなる。各種におけるキシレム導管のキシレム機能障害に対する脆弱性は、変動する水供給2の下での種生存の良好な決定要因である。また、キシレム導管の水位を調ることは、生物学的または生物学的ストレスを受けた個々の樹木の健康状態を評価するために重要である。樹液の流れまたは水の電位を測定することは、キシレム導管の統合された油圧機能による木質植物の水の状態の推定を提供できる。さらに、キシレム細胞における水の分布を可視化することで、キシレム油圧システムの個々の成分の状態を明らかにすることができる。
キシレム導管の水位を可視化するためのいくつかの技術が存在する3.木質組織の水経路を観察するための古典的で有用な方法は、切断された枝の端を染料に浸すことによって、または立っている木の茎4に染料を注入することによって、水柱を染色することを含む。柔らかいX線写真はまたxylem5、6の水分の差動X線吸収強度によるスライスされた木ディスクの水配分の視覚化を可能にする。しかし、これらの方法は、水の動きの軌跡を提供するか、水のマクロ的な分布を示すだけです。近年、マイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(μCT)7、8、9、10、磁気共鳴画像(MRI)などの非破壊観測技術、12は、無傷の苗木内のキシレム導管中の水の観察を可能にするために大幅に改善された。これらの非破壊法は、人工切断効果なしにキシレムの水位を観察できるという大きな利点があり、シーケンシャルイメージングまたは造影剤10の導入により水流のダイナミクスを追跡することができます。しかし、細胞レベルの水分含有量を識別できる画像を得るためには、植物イメージング用にカスタマイズされたMRIやシンクロトロン系μCTの特殊な施設を使用する必要があります。また、シンクロトロンベースのμCTシステムは、光顕微鏡7、8、9に匹敵する高い空間分解能で微細な画像を得ることを可能にしたが、高エネルギーX線13、14の放射線。クライオユニット(cryo-SEM)を設置した走査型電子顕微鏡(cryo-SEM)を採用することは、キシレム中の水を細胞レベルで正確に見つけ出す非常に有用な方法ですが、観察のためにサンプルを破壊的に収穫する必要があります。キシレム導管中の水を固定するために、茎の一部(すなわち、小枝、枝または茎)は、液体窒素(LN2)によってその中で凍結される。クライオSEMによるトリミングされた凍結標本の表面の観測は、キシレム導管中の水を氷として識別できるキシレム構造の高度に拡大された画像を提供します。この方法の重要な制限は、同じ試料内の水の移動性の逐次観察が不可能であるということです。しかし、フィールドに生息する樹木を順次観察するためのμCTまたはMRIの適用は、これらの器具が持ち運びにくいため、非常に困難です。対照的に、cryo-SEMは、フィールド実験で大きな木にこの技術を使用して、細胞レベルだけでなく、より細かい構造レベルで水内容を明確に可視化する可能性を秘めています(例えば、血管間ピット15の水、水中)細胞間空間16、または水柱17中の気泡。
クライオSEMによってキシレム水を観察する多くの研究は、5、12、18、19、20、21、23で報告されている。 内海ら(1996年)は、当初、LN2をステム21にセットした容器に充填することにより、生きている体幹の凍結固定により、その中でキシレムを観察するためのプロトコルを確立した。試料の温度は、キシレム導管内の氷を溶かすことを避けるために、サンプル収集中およびクライオSEM調製中に-20°C以下に維持した。この方法は、変化する水体制11、12、24、25、26の下で水の分布を明らかにするために、キシレム中の水を観察するために使用されてきた。 27,28, 水配分の季節変動21,29,30, 凍結融解サイクルの効果17,31, 32、湿った木の水の分布5、樹木からハートウッドへの移行中の水配分の変化、カンビアル活動と容器の分化の季節的な時間経過33、特定の生物学的ストレスによって誘発されるキャビテーション23,34.キャビテーションに対する油圧伝導性および導管の脆弱性も、cryo-SEM35,36を使用して検証されています。エネルギー分散X線分光法(EDXまたはEDS)を搭載したCryo-SEMは、水37を含む検体の表面上の元素分布を研究するために用いられてきた。
高い油圧張力下の導管を含む生きているトランクの凍結固定は時々導管38、39の内腔の壊れた氷の結晶として凍結SEMによって観察される人工キャビテーションを引き起こす。特に、より長く、より広い導管を有する広い放置種は、水中3、40の下で行われても、サンプル切断によって引き起こされるキャビテーションなどの緊張誘発性アーティファクトに対して脆弱である。キャビテーションアーティファクトは、透過木のサンプリング後(すなわち、日中のサンプリング)または厳しい干ばつ条件下で顕著になり、キャビテーション発生の過大評価に誤解を与える可能性があります3,38, 39.したがって、導管で働く張力は、実際のキャビテーション3、12、39を避けるために解放されなければならない。
試料室に設置されたナイフを用いた凍結破壊技術は、しばしば凍結SEM観察のために標本表面を露出させるために用いられる。しかし、木質植物組織の凍結破砕面、特に二次キシレムの横断部は、組織6の解剖学的特徴および水を明確に観察するには粗すぎる。標本をトリミングするためのクライオスタットの適用はサンプル表面20、23の急速で、高品質の調製を可能にする。この方法の全体的な目標は、サンプリングアーティファクトの発生することなく、その中の様々な種類のキシレム細胞における水分布の電子顕微鏡分解能を示す証拠を提供することである。キシレムのクライオ固定サンプルの高品質な電子顕微鏡写真を得るための試料表面のサンプリング、トリミング、洗浄に関しては、初めて採用して着実に改善された最新の手順をご紹介します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:249px;">coating material</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">Gold wire, 0.50 &#215; 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499&#160;</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:249px;">cryo scanning electron microscope</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:48px;width:249px;">cryostat</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">CryoStar NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">microtome blade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">tissue freezing embedding medium</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope

クライオユニット(クライオSEM)を設置した走査型電子顕微鏡により、氷点下の温度での検体観察が可能となり、液体窒素(LN)を用いて凍結固定技術と組み合わせて植物組織の水分布を探索するために使用されています。2.木質種の場合、しかし、キシレム横断切断面を観察するための準備は、木繊維の配向のためにいくつかの困難を伴う。さらに、キシレム導管の水柱の張力が高いと、特にサンプルの固定および収集中に、水の分布にアーティフィカルな変化を引き起こす場合があります。本研究では、クライオスタットとクライオSEMを用いて、その場で木質植物のキシレム内の水分布を観察する効率的な手順を示す。まず、サンプル採取中に、キシレム水電位を測定し、キシレム導管に高張力が存在するかどうかを判定する必要があります。キシレム水電位が低い場合(< ca. -0.5 MPa)、サンプル凍結固定中にキシレム導管の水状態をより良く保存するために、緊張緩和手順が必要です。次に、木の茎の周りに防水首輪を取り付け、キシレムの水状態の凍結固定のためにLN2で満たされる。収穫後は、観察のためのサンプル調製の手順を完了しながら、サンプルが凍結保存されていることを確認するために注意する必要があります。クライオスタットは、キシレム横断切断面を明確に露出させるために使用される。クライオ-SEM観測では、凍結エッチングの時間調整は、霜の塵を除去し、表示面上の細胞壁のエッジを強調するために必要とされます。我々の結果は、細胞および細胞レベルでのキシレム内の水分布の観察のためのクライオSEM技術の適用性を示す。クライオ-SEMと非破壊的な観察技術の組み合わせは、木質植物の水流ダイナミクスの探査を大幅に改善します。

凍結-SEMによって観察された、縮小樹と広い木キシレムの横切り面の代表的な画像を図2に示す。低倍率では、画像内の黒い領域は水が完全または部分的に消失する空洞を示し、灰色の領域はキシレム細胞壁、細胞質、および水を示します(図2A)。高倍率では、水が3つの気管イドのルミナから完全に失われるわけ?...

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Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

キシレム内の水分布を観察することは、木質植物の水流ダイナミクスに関する重要な情報を提供します。本研究では、サンプル調製時の水位のアーティフィスの変化を排除するクライオスタットとクライオSEMを用いて、キシレム水分布をその中で観察する実践的なアプローチを実証する。

クライオ走査型電子顕微鏡で可視化された木質植物のキシレム水分布

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

このプロトコルの全体的な目標は、私たちに、その中の様々な種類のxylem細胞の配水の電気顕微鏡分解能を提供することです。この方法は、水の分布と変化する水のレジーム、水の分布の季節変動、凍結/解凍サイクルの影響、湿木中の水の分布、および特定の生物的ストレスによって引き起こされるキャビテーションを明確にするために、xylemの水を観察するために使用されてきました。高い油圧張力の下で生きている幹の凍結固定は時々導管の管腔の破裂した氷の結晶としてcryo-SEMによって観察される人工キャビテーションを引き起こす。この更新された手順は、サンプリング手順でアーティファクトを使用せずに、xylemの高品質のエアロトーム顕微鏡写真を取得することに焦点を当てています。簡単には説明できない重要な詳細が数多くあるため、実行可能なデモンストレーションは重要です。同時に、この方法を実践しているのは世界中の少数の研究所だけなので、訓練を受け取ることは容易ではありません。この手順を開始するには、枝を囲み、黒いビニール袋でサンプリングするために葉を出して、xylemと葉の間の水位を平衡化してから、サンプリングの2時間以上前に残します。圧力チャンバを用いて、試料から少なくとも2枚の葉の水電位を決定する。水の電位が約マイナス0.5メガパスカルより高い場合、凍結後にサンプルを収穫することができます。水の電位がマイナス0.5メガパスカルより低い場合は、緩和のための処理を進めます。水で満たされる茎の周りに水密な襟を、修正します。剪定せん断やのこぎりを使用して、水面下で茎を切断し、サンプルのカットエンドを水中に保ちます。サンプルをできるだけ早く別の水の容器に移し、カットエンドを空気にさらすことを最小限に抑えます。広い離れた種の場合、クリソプラの中で張力誘発物を防ぐために、SEM用のクライオサンプルが採取された茎の切断端まで得られる場所からの長さが、サンプルの最大血管長よりも長いことを確認してください。次に、サンプルを黒いビニール袋で覆い、蒸散を減らします。試料のカットエンドを水中に保管し、xylem張力を緩和するために約30分間この状態を維持します。この後、再度水電位を測定し、xylem張力の緩和を確認する。まず、はさみやユーティリティナイフを使用して、水密な襟の片側を切り開きます。絞りを水平に保持したまま、粘着テープで茎の周りにしっかりと襟を取り付けます。絶縁手袋を着用し、液体窒素の容器を安全に保持します。液体窒素をいっぱいになるまで襟に入れ、徐々に液体窒素を加えてXylemの水を完全に凍結します。十分な凍結時間を経過した後、液体窒素を除去するために、試料ステムの凍結部分から襟を外す。すぐにサンプルを収穫するために細かい手のこぎりを使用してください。その後、冷凍サンプルをアルミホイルで覆うか、サンプルチューブに戻します。回収したサンプルを液体窒素で満たされた容器に素早く入れます。観察を行う準備ができるまで、サンプルをマイナス80°Cで保管してください。まず、クライオスタットの標本室の温度をマイナス30°Cに設定し、通常はほとんどの植物のxylem樹液を凍結状態に保つのに十分な寒さです。鋭利なナイフまたは細かい歯の鋸を使用して、クライオSEMの標本ホルダーのために調整できる小片にサンプルをトリミングします。トリミングされた部分をチャック、クライオスタットのホルダーに取り付け、クライオ切断用の組織凍結埋め込み媒体を使用します。チャックをクライオスタットのミクロトームの標本ホルダーに取り付けます。厚さ5~7マイクロメートルの断面を繰り返し削り取って表面を整えます。初期表面に全深度の1,000~2,000マイクロメートル以上を切り取ることは、予断によって生じるサンプルの損傷部分を発生させるのに役立ちます。サンプルの表面を大まかにトリミングした後、ミクロトームブレードの未使用部分を試料表面の上に調整します。試料の表面とブレードの間の距離をわずかに広げます。そして、表面を1、2回だけ切ります。次に、ブレードを再度スライドさせて、未使用の部分を試料表面に配置します。この切断処理を3~4回繰り返して、ナイフマークのない透明な表面を得る。最終カットの後、サンプルから遠く離れた位置にブレードを設定して、粉塵がサンプルに付着するのを防ぎます。そして、マイクロトームからチャックを取り外します。次に、クライオスタットチャンバに組織凍結埋め込み培地を備えたクライオSEM標本ホルダーに標本を取り付けます。まず、装置のユーザーマニュアルに従って、クライオSEMの標本室のマイナス120°Cの下の温度を維持するために液体窒素を使用する。次に、調製した検体を用いて、液体窒素を充填した絶縁容器に、凍結スタットチャンバーに置きます。試料交換ロッドを使用して、液体窒素の下に試料ホルダーを保持します。避難前室の避難を開始するとすぐに、検体ホルダーをクライオSEM検体室の避難前室に迅速に移す。まず、電動銃の加速電圧をオンにします。次に、試料ステージの温度をマイナス100°Cに上げます。霜の塵が取り除かれるのを数分間待ち、xylem細胞の氷の表面レベルが細胞壁に比べてわずかに減少するまで待ちます。その後、スペウエンステージの温度をマイナス120°Cに下げます。本研究では、細胞スケールでの配水を明確に可視化するために、クライオSEM観測法が用いられている。低倍率では、画像の黒い領域は水が完全にまたは部分的に消える空洞を示し、灰色の領域はxylem細胞壁、細胞質および水を示す。高倍率では、3気管のルミナから水が完全に失われないことを明らかになり、その時点でのキシレム樹液中のマクロ気泡の発生を示す。広い離れ種に関しては、キャビテーションの発生は血管内で容易に検出され、水の存在は繊維内で区別するのが難しく、特に低倍率では区別できない。細胞質細胞とパレンチマ細胞は、気管内の水や、氷面テクスチャーを通した血管と区別することができる。凍結エッチングプロセスに対する温度の影響を分析すると、霜粉が徐々に昇華し、温度上昇に伴って昇華の進行を通じて内線皮ピット膜が明確化することが明らかになりました。残存する大きな霜の塵粒子は、さらなる凍結エッチングによって除去することができる。しかし、Xylem導管の氷の表面レベルが不必要に低下するので、これは問題になる可能性があります。観察の質は正確な標本の準備によって大きく達成される。ミクロトームの鋭い刃で表面の平滑化は特に重要である。使用済みのブレードによる不十分なスムージングは、ナイフマークに似た粗い表面を作成したり、切り傷から多数のほこりが発生する可能性があります。負の水柱圧力の緩和を伴わない試料凍結は、xylem導管におけるキャビテーションの実際の誘導を引き起こす。クラスター化された氷の結晶は、試料が緩和されなかった標本の血管で観察される。対照的に、同様の水の可能性を有するリラックスしたサンプル標本では、クラスター化された氷の結晶は観察されない。干ばつに苦しんでいる生きている植物に凍結固定を適用すると、クラスター化された氷の結晶などの結果ベースのアーティファクトを誘発する可能性があります。これらのアーティファクトは、xylem導管の水状態の誤解につながります。したがって、凍結固定の前にサンプルの水位を確認することが重要です。この手順は、xylem導管内の状態のイメージを提供しますが、観察のために生きている木を破壊する必要があります。MRIやマイクロCTなどの他の非侵襲的な観察方法と、補助レベルの画像観察を組み合わせることで、水の輸送と使用の性質に関する理解を深めます。本論文で導入された水位の観察は、細胞内で混合される水の関係を解明する方法、および、生物的または生物的ストレスに対するその他の解剖学的反応を明確にする方法を提供する。エネルギー分散X線分光法またはトップシムを搭載したクライオ-SEMは、水を含む検体の表面上の元素分布を研究するために使用されてきた。同じようなフレームで元素分析とこの手順を組み合わせることで、水の状態に関連するxylem細胞の挙動に関する深い知識を得ることができます。部屋のサンプルの凍結固定のために液体窒素を使用する場合は、酸素欠乏を避けるために部屋を換気することを忘れないでください。

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