Name: xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope at JoVE.com

Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI (Нет. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H0285)

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическая диаграмма этого протокола показана на рисунке 1.
1. Отбор проб: Напряжение Релаксация в пределах колонки воды Xylem Conduits
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее лечение релаксации напряжения рекомендуется перед приложением LN2, чт...

Методы наблюдения крио-SEM, представленные в настоящем документе, практичны для четкой визуализации распределения воды в клеточном масштабе. С помощью этого метода изучение изменений в распределении воды в ксилеме потенциально может помочь прояснить механизм толерантности видов дере?...

Наличие водных ресурсов (т.е. осадки, содержание воды в почве) строго определяет смертность и географическое распределение видов растений, поскольку им необходимо поглощать воду из почвы и транспортировать ее в листья для фотосинтетического производства. Растения должны поддерживать свою систему водного транспорта под колеблющимися запасами воды. В частности, древесные растения создают высокую напряженность в своих каналах вдоль транспирационных потоков, поскольку в некоторых случаях им необходимо удерживать свою корону на высоте более 100 м над землей. Для поддержания столбов воды при таком высоком отрицательном давлении ксилемные каналы состоят из континуума трубчатых клеток с жесткими и гидрофобно-лигнированными клеточными стенками1. Уязвимость ксилем дисфункции ксилем каналов в каждом виде является хорошим детерминантом выживания видов при колебаниях водоснабжения2. Кроме того, изучение водного состояния ксилемных каналов имеет важное значение для оценки состояния здоровья отдельных деревьев, подвергающихся абиотическим или биотическим стрессам. Измерение потока сока или водного потенциала может дать оценку состояния воды древесного растения в связи с интегрированной гидравлической функцией ксилемовых каналов. Кроме того, визуализация распределения воды в клетках ксилема может прояснить состояние отдельных компонентов ксилемской гидравлической системы.
Несколько методов для визуализации состояния воды ксилем каналов существуют3. Классические и полезные методы наблюдения водных путей в древесной ткани включают окрашивание водного столба путем погружения концы разрезающих ветвей в краситель или путем введения красителя в стоячие стебли деревьев4. Мягкая рентгеновская фотография также позволяет визуализировать распределение воды нарезанных деревянных дисков из-за дифференциальной интенсивности поглощения рентгеновского излучения влаги в xylem5,6. Эти методы, однако, только обеспечивают следы движения воды или демонстрируют макроскопические распределения воды. В последнее время, неразрушающие методы наблюдения, такие как микрофокус рентгеновская компьютерная томография (ККТ)7,8,9,10и магнитно-резонансная томография (МРТ)11, 12, были значительно улучшены, чтобы позволить наблюдения воды в ксилем каналов в нетронутых саженцев. Эти неразрушающие методы имеют большие преимущества в том, что мы можем наблюдать состояние воды xylem без искусственных эффектов резки, и мы можем отслеживать динамику потока воды путем последовательной визуализации или введения контрастного агента10. Тем не менее, мы должны использовать индивидуальные МРТ для визуализации растений или специализированное средство для синхротронной основе ККТ для того, чтобы получить изображения, которые могут определить содержание воды клеточного уровня. Кроме того, хотя синхротронная система ЗКТ позволила получить тонкие изображения с высоким пространственным разрешением, что сопоставимо с световой микроскопией7,8,9, живые клетки могут быть повреждены излучение высокой энергии рентген13,14. Использование сканирующего электронного микроскопа, в котором установлены крио-единицы (крио-SEM), является очень полезным методом для точного определения местонахождения воды в ксилеме на клеточном уровне, хотя для этого требуется разрушительное сбор образца для наблюдения. Для фиксации воды в ксилем-каналах часть стеблей (т.е. ветки, ветви или стебли) замораживаются наместе жидким азотом (LN 2). Наблюдения за поверхностью обрезанных, замороженных образцов крио-SEM обеспечивают высокоувеличенные изображения структуры ксилема, из которой мы можем определить воду в ксилемских каналах как лед. Существенным ограничением этого метода является то, что последовательное наблюдение за подвижностью воды в пределах одного образца невозможно. Тем не менее, применение ККТ или МРТ для последовательного наблюдения за деревьями, которые живут в поле является чрезвычайно сложной задачей, поскольку эти инструменты не являются портативными. В отличие от этого, крио-SEM имеет потенциал для использования этой техники на больших деревьях в полевых экспериментах, чтобы четко визуализировать содержание воды не только на клеточном уровне, но и на более тонком уровне структуры, например, вода в межсосудистых ямах15, вода в межклеточные пространства16, или пузырьки в колонке воды17.
Многие исследования наблюдения ксилем воды крио-SEM были зарегистрированы 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) первоначально установили протокол для наблюдения xylem in situ путем замораживания-фиксации живого ствола через заполнение LN2 в контейнер, установленный на стебель21. Температура образца сохранялась ниже -20 градусов по Цельсию во время сбора образцов и во время подготовки крио-SEM, чтобы избежать таяния льда в ксилемских каналах. Этот метод был использован для наблюдения за водой в ксилеме для уточнения распределения воды при изменении водного режима11,12,24,25,26, 27,28, сезонные колебания распределения воды21,29,30, эффект заморозки оттепели циклов17,31, 32, распределение воды во влажной древесине5, изменения в распределении воды во время перехода от заболоня к heartwood20, сезонный курс времени камбиальной активности и дифференциации сосудов33, и кавитации индуцированных определенных биотических стрессов23,34. Гидравлическая проводимость и уязвимость каналов к кавитации также были проверены с помощью крио-SEM35,36. Cryo-SEM, оснащенный энергетической диспергивной рентгено-рентгенометрической спектрометрией (EDX или EDS), был использован для изучения распределения элементов на поверхности образца, содержащего воду37.
Замораживание-фиксация живого ствола, который содержит каналы под высоким гидравлическим напряжением, иногда вызывает искусственные кавитации, которые наблюдаются крио-SEM как сломанные кристаллы льда в просвете проводников38,39. В частности, широколинейшие виды с более длинными и широкими каналами уязвимы для артефактов, вызванных напряженностью, таких как кавитация, вызванная вырубкой образцов, даже если она проводится под водой3,40. Артефакты кавитации становятся заметными после отбора проб транспирирующегося дерева (т.е. выборки в дневное время) или в условиях сильной засухи, и они могут ввести в заблуждение к завышению кавитации возникновения3,38, 39. Таким образом, напряжение, работая в каналах должен быть освобожден, чтобыизбежать артефактной кавитации 3,12,39.
Техника замораживания-перелома с помощью ножа, установленного в камере образца, часто используется для того, чтобы обнажить поверхность образца для наблюдения крио-SEM. Однако, замерзать-раздробленные плоскости древесных тканей завода, специально поперечные разделы вторичного xylem, слишком грубы для того чтобы ясно наблюдать анатомические характеристики и воду в ткани6. Применение криостата для обрезки образца позволяет быстро и качественно подготовить образец поверхностей20,23. Общая цель этого метода является предоставление доказательств с электронной микроскопии разрешение распределения воды в различных видах клеток ксилем на месте без возникновения выборок артефактов. Мы вводим нашу обновленную процедуру, которая постоянно совершенствуется с тех пор, как мы впервые ее приняли, в отношении отбора проб, обрезки и очистки поверхности образца для получения высококачественных электронных микрографов крио-фиксированных образцов ксилема.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:249px;">coating material</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">Gold wire, 0.50 &#215; 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499&#160;</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:249px;">cryo scanning electron microscope</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:48px;width:249px;">cryostat</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">CryoStar NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">microtome blade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">tissue freezing embedding medium</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope

Сканирующий электронный микроскоп, установленный крио-единица (крио-SEM), позволяет наблюдать за образцами при минусовых температурах и используется для изучения распределения воды в тканях растений в сочетании с методами замораживания фиксации с использованием жидкого азота (LN 2). Для древесных видов, однако, препараты для наблюдения ксилем поперечной огранки поверхности связаны с некоторыми трудностями из-за ориентации древесных волокон. Кроме того, более высокое напряжение в колонке воды в ксилемских каналах иногда может привести к артефактным изменениям в распределении воды, особенно во время фиксации и сбора проб. В этом исследовании мы демонстрируем эффективную процедуру наблюдения за распределением воды в ксилеме древесных растений на месте с помощью криостата и крио-SEM. Во-первых, во время сбора образцов, измерения потенциала воды ксилем аможет должен определить, присутствует ли высокое напряжение в ксилемских каналах. При низком потенциале ксилема воды (злот; около 0,5 МПа), процедура релаксации напряжения необходима для содействия лучшему сохранению состояния воды в ксилемских каналах во время фиксации замораживания образцов. Далее, водонепроницаемый воротник крепится вокруг ствола дерева и заполнен ы LN2 для замораживания фиксации состояния воды ксилем. После сбора урожая следует позаботиться о том, чтобы образец сохранялся замороженным при завершении процедур подготовки образца к наблюдению. Криостат используется, чтобы четко разоблачить поперечную поверхность ксилема. При крио-SEM-наблюдениях требуется корректировка времени для замораживания травления для удаления ледяной пыли и акцентирования края стенок клеток на смотровой поверхности. Наши результаты демонстрируют применимость крио-SEM методов для наблюдения распределения воды в xylem на клеточном и субклеточном уровнях. Сочетание крио-SEM с неразрушающими методами наблюдения на месте позволит значительно улучшить изучение динамики потока воды древесных растений.

Репрезентативные изображения поперечных поверхностей хвойных и широколицированных деревьев ксилем, наблюдаемые крио-SEM, показаны на рисунке 2. При низком увеличении черная область на снимках указывает на полости, из которых вода полностью или частичн...

Watch this Scientific Journal Video about Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope at JoVE.com

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Наблюдение за распределением воды в ксилеме дает важную информацию о динамике потока воды в древесных растениях. В этом исследовании мы демонстрируем практический подход к наблюдению за распределением воды ксилем на месте с помощью криостата и крио-SEM, который устраняет артефактные изменения в состоянии воды во время подготовки образца.

Xylem Распределение воды в Древесных растениях, визуализированных с крио-сканирования электронный микроскоп

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Общей целью этого протокола является предоставление нам электромикроскопического разрешения распределения воды в различных видах ксилемовых клеток на месте. Этот метод использовался для наблюдения за водой в ксилеме в целях уточнения распределения воды и изменения водных режимов, сезонных колебаний распределения воды, последствий циклов замораживания/оттепели, распределения воды во влажной древесине и кавитации, вызванной определенными биотическими стрессами. Замораживание-фиксация живого ствола при высоких гидравлических напряжениях иногда вызывает искусственные кавитации, которые наблюдаются крио-SEM как разорванные кристаллы льда в люмене трубопровода.Эта обновленная процедура фокусируется на получении высококачественных аэротомных микрографов ксилема без артефакта в процедуре отбора проб. Жизнеспособная демонстрация имеет решающее значение, поскольку существует ряд важных деталей, которые не могут быть легко объяснены. В то же время, получить обучение не легко, потому что только несколько лабораторий по всему миру практикуют этот метод.Чтобы начать эту процедуру, приложите ветку и листья для отбора проб с черным полиэтиленовым пакетом, чтобы уравночные потенциал воды между ксилемом и листьями более чем за два часа до отбора проб. Используя камеру давления, определите водный потенциал по крайней мере двух листьев из образца. Когда потенциал воды выше, чем примерно минус 0,5 мегапаскаля, образец может быть собран после замораживания.Когда потенциал воды ниже минус 0,5 мегапаскаля, приступить к лечению для релаксации. Зафиксните водонепроницаемый воротник вокруг стебля, который будет наполнен водой. Используя обрезку ножниц или пилы, вырежьте стебель под поверхностью воды и держите разрезанную часть образца под водой.Перенесите образец в другой контейнер с водой как можно быстрее, чтобы свести к минимуму воздействие разреза в воздух. Для широколивных видов убедитесь, что длина от места, где крио образец для SEM будет получен к краю разреза собранного стебля больше, чем максимальная длина сосуда образца, с тем чтобы предотвратить напряженность индуцированных артефактов в кризампле. Затем накройте образец черным полиэтиленовым пакетом, чтобы уменьшить транспирацию.Держите разрезанный конец образца в воде и поддерживать это состояние в течение примерно 30 минут, чтобы расслабиться ксилем напряженности. После этого, измерить потенциал воды снова, чтобы подтвердить расслабление ксилема напряженности. Во-первых, используйте ножницы или полезный нож, чтобы вырезать и открыть одну сторону водонепроницаемого воротника.Прикрепите воротник плотно вокруг стебля клейкой лентой, удерживая диафрагму горизонтально. Наложить изоляционные перчатки и безопасно держать сосуд жидкого азота. Выполнить жидкий азот в воротник, пока он не полон и держать его заполнены постоянно добавляя дополнительный жидкий азот, чтобы полностью заморозить воду в ксилеме.После достаточного времени замораживания, отделить воротник от замороженной части образца стебля для того, чтобы удалить жидкий азот. Немедленно используйте тонкую ручную пилу, чтобы собрать образец. Затем накройте замороженный образец куском алюминиевой фольги или положите его обратно в образец трубки.Быстро поместите собранный образец в контейнер, наполненный жидким азотом. Храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к проведению наблюдения. Для начала установите температуру камеры образца криостата до минус 30 градусов по Цельсию, что обычно достаточно холодно, чтобы сохранить ксилемовый сок большинства растений в замороженном состоянии.Используйте острый нож или мелкозубой пилы, чтобы обрезать образец на небольшой кусочек, который может быть скорректирован для образца держателя крио-SEM. Гора подстриженный кусок к патрону, держатель для криостата, с тканью замораживания встраивания среды для крио-секции. Прикрепите патрон к держателю образца микротома криостата.Обрезать поверхность, неоднократно бритья от пяти до семи микрометров толщиной разделов. Отсеивания более 1000-2000 микрометров общей глубины до первоначальной поверхности полезно для урезания поврежденной части образца, вызванного предварительной резки. После примерной обрезки поверхности образца, отрегулируйте неиспользованную часть лезвия микротома над поверхностью образца.Слегка расширяем расстояние между поверхностью образца и лезвием. И вырезать поверхность только один или два раза. Затем снова сдвиньте лезвие и распоистив неиспользованную часть лезвия на поверхность образца.Повторите эту обработку резки три-четыре раза, чтобы получить чистую поверхность без следов ножа. После окончательного разреза установите положение лезвия далеко от образца, чтобы пыль не прилипания к образцу. И отделить патрон от микротомы.Затем прикрепите образец к держателю образца крио-SEM с встраиваемой тканью среды в криостатической камере. Во-первых, используйте жидкий азот для поддержания температуры ниже минус 120 по Цельсию в камере образца крио-SEM в соответствии с руководством пользователя оборудования. Затем поместите держатель образца с подготовленным экземпляром в изоляционный контейнер, наполненный жидким азотом, в криостатической камере.Используйте образец обмена стержня держать держатель образца под жидким азотом. Быстро перенесите держатель образца в камеру перед эвакуацией камеры крио-SEM, как только начнется эвакуация до эвакуационные камеры. Для начала включите разгонное напряжение электрической пушки.Затем поднимите температуру стадии образца до минус 100 градусов по Цельсию. Подождите несколько минут, пока морозная пыль будет удалена, а уровень поверхности льда в клетках ксилема немного уменьшится по сравнению со стенками клеток. Затем понижайте температуру стадии спейена до минус 120 градусов по Цельсию.В этом исследовании используются методы наблюдения крио-SEM для четкой визуализации распределения воды в клеточном масштабе. При низком увеличении черная область на снимках указывает на полости, из которых полностью или частично исчезает вода, в то время как серая область указывает на стенки ксилемовых клеток, цитоплазму и воду. При высоком увеличении становится очевидным, что вода не полностью теряется от люмины трех трахейдов, что указывает на появление макропарок в ксилемовом соке на месте.Что касается широколивных видов, то возникновение кавитации легко обнаруживается в сосудах, в то время как существование воды трудно различить в волокнах, особенно при низком увеличении. Цитоплазмы и паренхимы клетки можно отличить от воды в tracheids или судов через текстуры ледяной плоскости. Анализ влияния температуры на процесс замерзания показывает, что морозная пыль постепенно сублимируется, а эндотрацидные ямо мембраны становятся яснее благодаря прогрессированию сублимации с повышением температуры.Оставшиеся крупные частицы морозной пыли могут быть устранены путем дальнейшего замораживания травления. Но это может быть проблематичным, поскольку это неоправданно снижает уровень поверхности льда в ксилемных каналах. Высокое качество наблюдений в значительной степени достигается за счет точной подготовки образцов.Особенно важно сглаживание поверхности острым лезвием микротомы. Недостаточное сглаживание использованного лезвия иногда может создать шероховатую поверхность, напоминающую следы ножа, или может создать многочисленные случаи пыли от порезов. Замораживание образца без ослабления отрицательного давления водяного столба вызовет артефактную индукцию кавитации в ксилемовых каналах.Кластерные кристаллы льда наблюдаются в сосудах образцов, где образец не был расслаблен. Напротив, в расслабленных образцах с аналогичным водным потенциалом не наблюдается кластерных кристаллов льда. Применение замораживания-фиксации для транспирации живых растений, которые страдают от засухи, может вызвать артефакты на основе результатов, такие как кластерные кристаллы льда.Эти артефакты приводят к неправильному толкованию состояния воды в ксилемовом канале. Поэтому важно сначала подтвердить водный потенциал образцов до замораживания-фиксации. Хотя эта процедура предусматривает изображение того, какой статус находится в ксилемовом канале, живое дерево должно быть уничтожено для наблюдения.Сочетание других неинвазивных методов наблюдения, таких как МРТ или микро-КТ, с вспомогательным наблюдением изображения уровня углубит наше понимание природы между водным транспортом и использованием. Наблюдение за состоянием воды, введенной в настоящем документе, также обеспечит метод для выяснения взаимосвязи воды, которая смешивается в клетках и других анатомических реакций на абиотический или биотический стресс. Cryo-SEM, оснащенный энергодисперсивной рентгеновской спектроскопией или верхним симом, был использован для изучения распределения элементов по поверхности образца, содержащего воду.Сочетание элементарного анализа и этой процедуры в этом аналогичном кадре может дать нам глубокие знания о поведении клеток ксилема, связанных со статусом воды. При использовании жидкого азота для замораживания-фиксации образцов в помещении, не забудьте проветрить помещение, чтобы избежать дефицита кислорода.

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Лабораторно-определяется Фосфор поток от озерных отложениях в качестве меры внутреннего фосфора Загрузка

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Измерение потоков минеральных питательных веществ и токсикантов в растениях с помощью радиоактивной метки

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и RT-КПЦР. I. Сбор образцов вирусов

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Метод 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и РТ-КПЦР. Часть III. Обнаружение Вирус РТ-КПЦР

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

How to Create Conditioned Taste Aversion for Grazing Ground Covers in Woody Crops with Small Ruminants

Как создать кондиционированной Вкус Отвращение для выгон покровов древесных культур с мелких жвачных

Conditioned taste aversion (CTA) is a learning behavior process where animals are trained to reject certain feed after gastrointestinal discomfort has ...

Soil Lysimeter Excavation for Coupled Hydrological, Geochemical, and Microbiological Investigations

Почва лизиметре Выемка для связанных гидрологические, геохимические и микробиологические исследования

Studying co-evolution of hydrological and biogeochemical processes in the subsurface of natural landscapes can enhance the understanding of coupled ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Скрининг на эндокринную активность в воде с использованием коммерчески доступного<em&gt; In Vitro</em&gt; Трансактивационную Биотесты

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Метод липидной экстракции и анализа для характеристики микробов почвы в экспериментах со многими образцами

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

Простая посадка техника для воссоздания деревьев, где происходит частое затопление

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Метод подготовки образцов сканирующего и трансмиссионного электронного микроскопа для придатков woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...